植物蛋白飲料中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定結(jié)果不確定度評(píng)價(jià)

劉順

（荊州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北荊州 434000）

植物蛋白飲料的蛋白質(zhì)含量是目前我國(guó)市場(chǎng)監(jiān)督抽檢項(xiàng)目的重要理化指標(biāo)，涉及的產(chǎn)品種類主要有豆乳飲料、椰子乳、杏仁乳、核桃乳[1]，其依據(jù)的判定要求為產(chǎn)品明示標(biāo)準(zhǔn)或產(chǎn)品明示質(zhì)量要求。通過總結(jié)國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管總局關(guān)于食品抽檢不合格情況的通告，發(fā)現(xiàn)植物蛋白飲料的質(zhì)量指標(biāo)[2,3]不達(dá)標(biāo)問題主要集中于蛋白質(zhì)項(xiàng)目，為保障食品檢驗(yàn)項(xiàng)目的準(zhǔn)確性有必要探究檢測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)果的不確定度[4-8]。

目前植物蛋白飲料中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法[9]為GB 5009.5-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》（第一法 凱氏定氮法），相較于GB 5009.5-2010 版標(biāo)準(zhǔn)，增加了常見食物中氮折算成蛋白質(zhì)的折算系數(shù)，新標(biāo)準(zhǔn)對(duì)產(chǎn)品不同產(chǎn)品類別的計(jì)算結(jié)果更加具有針對(duì)性、科學(xué)性。標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的第一法可采用自組裝的定氮蒸餾裝置或者自動(dòng)凱氏定氮儀[10]，自組裝蒸餾裝置結(jié)束蒸餾后再通過手動(dòng)滴定法滴定至終點(diǎn)，自動(dòng)凱氏定氮儀可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)加液、蒸餾、滴定和記錄滴定數(shù)據(jù)的過程，兩種滴定方法均是通過混合指示劑顏色變化確定滴定終點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)于液體試樣要求稱樣量為10 g～25 g（約相當(dāng)于30 mg～40 mg 氮），植物蛋白飲料標(biāo)稱的蛋白質(zhì)含量換算為30 mg 含氮量，而一般市場(chǎng)銷售的自動(dòng)凱氏定氮儀配置的滴定儀在滴定體積達(dá)到40.00 mL 后可能出現(xiàn)滴定杯液溢出，進(jìn)而導(dǎo)致滴定終點(diǎn)的體積測(cè)定不準(zhǔn)確影響最終結(jié)果的準(zhǔn)確度。對(duì)于自組裝定氮蒸餾裝置因采用傳統(tǒng)手動(dòng)滴定法，通過選擇合適體積的接受瓶及四氟滴定管即可保證滴定至終點(diǎn)。本文擬采用自動(dòng)凱氏定氮儀的蒸餾部分與手動(dòng)滴定部分結(jié)合后，依據(jù)CNAS-GL006《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[11]和RB/T 030《化學(xué)分析中測(cè)量不確定度評(píng)估指南》對(duì)植物蛋白飲料中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定結(jié)果不確定度進(jìn)行分析[12-15]，通過對(duì)測(cè)量過程中不確定度來源分析，減小對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生較大影響的不確定度，進(jìn)而提高食品檢驗(yàn)過程的質(zhì)量控制能力和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

全自動(dòng)凱氏定氮儀：K-360 型，瑞士步琦實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；電子天平：ME204/02 型，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；能力驗(yàn)證樣品（豆奶飲料）：中位值蛋白質(zhì)1.90 g/100 g，中國(guó)食品藥品檢定研究所；硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、氫氧化鈉、95%乙醇：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水碳酸鈉：基準(zhǔn)PT，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 蛋白質(zhì)的測(cè)定

參照GB 5009.5-2016（第一法）：食品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量計(jì)算氮含量，再乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。

1.3 計(jì)算公式

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定按式（1）進(jìn)行計(jì)算：

式中：m-試樣質(zhì)量，g；V1-試樣消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V2-空白消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；C-硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的實(shí)際濃度，mol/L；0.014 0-1.0 mL 硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，g；100-換算系數(shù)；F-氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)（各種食品中氮換算系數(shù)見標(biāo)準(zhǔn)附錄A）；X-檢測(cè)結(jié)果，g/100 g。

1.4 蛋白質(zhì)測(cè)定不確定度影響因素分析

根據(jù)GB 5009.6-2016 第一法測(cè)定質(zhì)控樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)量不確定度分析來源主要有檢測(cè)過程重復(fù)性引入的不確定度urel(r1a)、試樣質(zhì)量引入的不確定度urel(m1a)、滴定管滴定引入的不確定度urel(V1a)、硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度urel(c1a)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)過程重復(fù)性引入的不確定度urel(r)評(píng)定

對(duì)于檢測(cè)過程重復(fù)性引入的不確定度urel(r)，依據(jù)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法，指示劑滴定法8 次測(cè)得豆奶樣品蛋白質(zhì)含量的均值為1.851 g/100 g（1.841，1.837，1.859，1.838，1.841，1.832，1.882，1.875），計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差S和檢測(cè)過程重復(fù)性引入的不確定度urel(r)。

2.2 質(zhì)量稱量引入的不確定度urel(m)

天平校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度一般由天平計(jì)量證書給出，按標(biāo)準(zhǔn)要求準(zhǔn)確稱量樣品精確至0.001 g，最大允許誤差±5 mg，按均勻分布評(píng)定，取，則：

2.3 配制硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度urel(c)

根據(jù)GB/T 601-2016 進(jìn)行硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)定：

式中：m-基準(zhǔn)試劑質(zhì)量，g；V-試樣消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V0-空白消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；M-無水碳酸鈉的摩爾質(zhì)量濃度，g/mol；硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的實(shí)際濃度，mol/L。

（1）標(biāo)定重復(fù)性引入的不確定度分量：平行測(cè)定8 次所得硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度均值為0.102 12 mol/L（0.102 17，0.102 08，0.102 18，0.102 05，0.102 08，0.102 18，0.102 09，0.102 16），對(duì)于檢測(cè)過程重復(fù)性引入的不確定度ur(rep)：

（2）稱量Na2CO3引入的不確定度分量：天平校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度一般由天平計(jì)量證書給出，按標(biāo)準(zhǔn)要求準(zhǔn)確稱量樣品精確至0.000 01 g，最大允許誤差±0.05 mg，按均勻分布評(píng)定，取，則：

基準(zhǔn)試劑無水碳酸鈉引入的不確定度主要來源于純度和摩爾質(zhì)量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)證書記錄的純度（99.99±0.02）%，摩爾質(zhì)量的相對(duì)不確定度由國(guó)際理論（化學(xué)）與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUAPC）查表得到在實(shí)際應(yīng)用時(shí)可忽略不計(jì)，按均勻分布計(jì)算得純度和摩爾質(zhì)量的不確定度：

（3）滴定基準(zhǔn)物質(zhì)消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積引入的不確定度分量

①50 mL A 級(jí)滴定管：校準(zhǔn)證書誤差為0.05 mL，按三角形分布考慮，則u1(V)=0.05=0.020 4 mL。

②實(shí)驗(yàn)室溫度波動(dòng)引入的不確定度分量u2(V)：標(biāo)準(zhǔn)情況下溫度為20℃，而實(shí)驗(yàn)室溫度在±4℃波動(dòng)，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，溫度效應(yīng)引起的體積變化為均勻分布，，則u2(V)=39.98×2.1×10-4=0.004 85。

③將u1(V)、u2(V)兩個(gè)分量合成，得到：

（4）玻璃量器引入的不確定度分量：依據(jù)GB 5009.5-2016 所用硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度為0.050 0 mol/L，因此將0.102 1 mol/L 硫酸溶液稀釋至0.051 05 mol/L，具體操作：取50 mL 0.102 1 mol/L 硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液至100 mL 容量瓶，100 mL A 級(jí)容量瓶最大允許誤差±0.10 mL；50 mL A 級(jí)移液管最大允許誤差±0.05 mL，服從均勻分布，包含因子，換算成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

不確定度合成為：

2.4 滴定體積引起的不確定度urel(V)

2.5 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度

（3）擴(kuò)展不確定度：

采用置信概率為95%（k=2）計(jì)算，U=kux。

植物蛋白飲料中蛋白質(zhì)含量各不確定度分量如表1 所示。

表1 不確定度分量匯總

植物蛋白飲料中蛋白質(zhì)含量測(cè)定的不確定度主要由測(cè)量重復(fù)性、稱量、滴定管、標(biāo)準(zhǔn)溶液（標(biāo)定和稀釋）產(chǎn)生，由表1 可知，測(cè)定蛋白質(zhì)含量的第一法測(cè)定影響大小為測(cè)量重復(fù)性>標(biāo)準(zhǔn)溶液>滴定管>稱量；蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果為=(1.851±0.013 3) g/100 g。

（1）合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

（2）合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)植物蛋白飲料中蛋白質(zhì)含量中測(cè)量重復(fù)性和標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度影響較大，本文將GB 5009.5-2016 第一法中自動(dòng)凱氏定氮儀的蒸餾部分與手動(dòng)滴定相結(jié)合，排除因自動(dòng)凱氏定氮儀自動(dòng)滴定部分帶來的不確定度分量，同時(shí)節(jié)約因自組裝蒸餾裝置消耗的時(shí)間，提高基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)試驗(yàn)效率，可通過合理增加測(cè)量次數(shù)達(dá)到減小測(cè)量重復(fù)性引起的不確定度分量，采用GB/T 601-2016 對(duì)硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行標(biāo)定后再依據(jù)GB 5009.5-2016 進(jìn)行適當(dāng)稀釋所產(chǎn)生的不確定度分量需由購(gòu)買已有擴(kuò)展不確定度的標(biāo)準(zhǔn)溶液來減小，而基層檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的期間核查和保質(zhì)期核查方面存在工作疏忽，即通過增加標(biāo)定次數(shù)和采取精密度較高的稀釋容器也可減小標(biāo)準(zhǔn)溶液產(chǎn)生的不確定度分量。

3 結(jié)論

本文通過結(jié)合GB 5009.6-2016 第一法自動(dòng)凱氏定氮儀和手動(dòng)滴定法對(duì)植物蛋白飲料中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行不確定度分析。結(jié)果表明，影響植物蛋白飲料中蛋白質(zhì)含量測(cè)定的不確定度主要來源分為測(cè)量重復(fù)性、稱量、滴定管、標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過對(duì)不確定度分量進(jìn)行分析得出植物蛋白飲料中蛋白質(zhì)含量的擴(kuò)展不確定度，其中測(cè)量重復(fù)性和標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度分量占比較大。因此，對(duì)于購(gòu)買自動(dòng)凱氏定氮儀附加自動(dòng)電位滴定儀有限制的基層檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)，可優(yōu)先選擇本文中的自動(dòng)凱氏定氮儀和手動(dòng)滴定法相結(jié)合的方法，增加標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)定和蛋白質(zhì)含量檢測(cè)試驗(yàn)的次數(shù)，也可按照CNAS-GL035《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品驗(yàn)收和期間核查指南》對(duì)試驗(yàn)中涉及的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)收和期間核查，提高對(duì)檢驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量控制能力。本文未涉及GB/T 27418-2017《測(cè)量不確定度評(píng)定和表示》中不確定度的通用分析方法，計(jì)劃在今后的工作研究中可將該標(biāo)準(zhǔn)引入檢驗(yàn)檢測(cè)過程質(zhì)量控制，進(jìn)一步提高檢驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的可信度。