抗阻運(yùn)動調(diào)控鳶尾素促進(jìn)導(dǎo)管相關(guān)性血栓溶解再通的研究

黎小艷 應(yīng)燕萍 徐佳澳 吳彩嬌 韋佳妮 趙慧函

目的：探討抗阻運(yùn)動對導(dǎo)管相關(guān)性血栓（CRT）溶解再通的影響及可能機(jī)制。

方法：將36只SD雄性大鼠隨機(jī)分為對照組、CRT組、CRT+抗阻運(yùn)動組，每組12只。除對照組大鼠外，其余大鼠均構(gòu)建CRT模型。CRT組不做任何干預(yù)，CRT+抗阻運(yùn)動組大鼠于建模10 d后開始抗阻運(yùn)動干預(yù)，干預(yù)28 d后取材。蘇木素-伊紅染色觀察血栓情況，計(jì)算血栓溶解率，酶聯(lián)免疫吸附劑實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測血清鳶尾素（Irisin）、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-10含量，實(shí)時熒光定量PCR檢測腓腸肌組織過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（PGC-1α）、Ⅲ型纖連蛋白域包含蛋白5（FNDC5）mRNA表達(dá)水平。

結(jié)果：對照組大鼠無血栓形成。與對照組比較，CRT組大鼠血清Irisin、IL-10含量減少，IL-6含量增高（P均＜0.01）。與CRT組比較，CRT+抗阻運(yùn)動組血栓溶解率顯著升高（P＜0.01），腓腸肌組織PGC-1α、FNDC5 mRNA表達(dá)量增加（P均＜0.01），血清Irisin與IL-10含量顯著增加，血清IL-6含量減少。

結(jié)論：抗阻運(yùn)動28 d促進(jìn)CRT溶解，可能與上調(diào)Irisin表達(dá)，抑制炎癥有關(guān)。

中心靜脈導(dǎo)管（CVC）具有提供穩(wěn)定血管通路、避免反復(fù)穿刺、可留置時間較長以及能夠減輕患者痛苦等優(yōu)點(diǎn)，在臨床被廣泛用于疾病治療[1]。盡管CVC有諸多優(yōu)點(diǎn)，但導(dǎo)管相關(guān)性血栓（CRT）是其嚴(yán)重的并發(fā)癥，臨床上以無癥狀性CRT常見，發(fā)生率高達(dá)68%，而癥狀性CRT發(fā)生率僅為1%～5%[2]，可見CRT具有“高發(fā)而隱匿”的特點(diǎn)。目前治療CRT的方法主要包括抗凝、溶栓治療和拔管處理。抗凝治療雖為基本治療，但其不能加速血栓溶解，而溶栓治療存在諸多禁忌證且安全性仍有爭議，目前國內(nèi)外指南并未推薦中心靜脈置管的患者拔管處理CRT[3-6]。靜脈血栓溶解再通過程和創(chuàng)面愈合過程類似，均伴有靜脈壁炎癥反應(yīng)，各種炎癥細(xì)胞浸潤及新生毛細(xì)血管形成，靜脈血栓的最終吸收和溶解主要依賴機(jī)體自身慢性自然溶解機(jī)制，而抗阻運(yùn)動可促進(jìn)血栓機(jī)化和血管新生進(jìn)而有助于血栓溶解和吸收[7-8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CVC建模10 d血栓與血管壁粘連面積增大，大量炎癥細(xì)胞浸潤，血栓機(jī)化明顯[9]。鳶尾素（Irisin）是近年來研究新發(fā)現(xiàn)的肌源性因子，主要通過抗阻運(yùn)動刺激骨骼肌分泌過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（PGC-1α）介導(dǎo)Ⅲ型纖連蛋白域包含蛋白5（FNDC5）的表達(dá)增加，F(xiàn)NDC5經(jīng)蛋白酶水解加工后分泌到血液中成為Irisin[10-11]。Irisin具有抑制炎癥反應(yīng)、保護(hù)內(nèi)皮、促進(jìn)血管新生的作用，是保護(hù)血管壁的重要生物活性物質(zhì)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，Irisin不僅可以減少動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞浸潤，還可以減小動脈粥樣硬化斑塊面積[13-15]?；谝陨献C據(jù)，推測抗阻運(yùn)動通過介導(dǎo)炎癥因子而防治靜脈血栓，但對CRT的作用鮮有研究報道，就此本研究探討了抗阻運(yùn)動對CRT的影響及可能機(jī)制，為臨床上抗阻運(yùn)動輔助治療CRT提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本實(shí)驗(yàn)于2023年3月20日至2023年5月20日使用SD雄性大鼠36只，7～8周齡，SPF級、體重220～240 g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心SPF級動物房（SYXK桂2020-0004）。實(shí)驗(yàn)前均適應(yīng)性喂養(yǎng)3～5 d。實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置符合科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定，實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)和倫理委員會批準(zhǔn)（批號：2023-E099-01）。

1.2 主要試劑與儀器

硅膠導(dǎo)管與堵頭（2#PU，北京思科諾斯生物科技有限公司），實(shí)驗(yàn)動物爬梯（課題組自主研發(fā)，專利號：CN201921509747.4），大鼠血清Irisin、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-10試劑盒（江蘇科晶生物科技有限公司），10%中性甲醛（北京索萊寶科技有限公司)，蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），中性樹脂（北京索萊寶科技有限公司），非凍型組織RNA保存液（北京索萊寶科技有限公司），TRIzol裂解液（Invitrogen公司，美國），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海新貝生物科技有限公司），實(shí)時熒光定量PCR試劑盒（上海新貝生物科技有限公司），引物甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，上海生工生物工程有限公司），引物FNDC5、PGC-1α（南寧捷尼斯生物科技有限公司），恒溫孵育箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司），手動輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（Leica公司，德國），多功能熒光發(fā)光分析儀（Thermo Fisher公司，美國），正置熒光相差顯微鏡成像分析系統(tǒng)（Olympus公司，日本），全自動多功能生物大分子分析儀（Protein Simp公司，美國），PCR儀（Biometra公司，德國），熒光PCR儀（Applied Biosystems公司，美國）。

1.3 構(gòu)建大鼠CRT模型

課題組前期已構(gòu)建大鼠頸外靜脈CRT模型，發(fā)現(xiàn)在置管7 d后血栓高發(fā)，10 d后血栓形成穩(wěn)定[16]。因此，本研究選用置管10 d后經(jīng)B超確診血栓形成的大鼠CRT模型（圖1），將動物隨機(jī)分組為CRT組（n=12）、CRT+抗阻運(yùn)動組（n=12），另外設(shè)置對照組（n=12）。大鼠CRT模型參照課題組前期實(shí)驗(yàn)方法[16]，采用3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，右側(cè)頸部備皮，用剪刀沿著大鼠頸部前正中線偏右側(cè)0.5 cm方向縱切1～2 cm，逐層鈍性分離皮膚及組織，使右頸外靜脈完全暴露。將2根縫線送入頸外靜脈下備用，在結(jié)扎點(diǎn)下將靜脈剪一斜形切口，將導(dǎo)管送入至右心房上部，使用加入0.9%生理鹽水的注射器回抽血液，見回血后確認(rèn)導(dǎo)管在靜脈血管中，并且血流通暢。用縫線固定導(dǎo)管，防止脫落，再用配套堵頭封閉導(dǎo)管末端，縫合傷口。大鼠麻醉復(fù)蘇后放回鼠籠，正常進(jìn)食飲水。

1.4 干預(yù)方法

CRT+抗阻運(yùn)動組于建模10 d后進(jìn)行運(yùn)動干預(yù)，運(yùn)動方案參考課題組前期方法[17]。所有大鼠術(shù)前1周進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練無負(fù)重預(yù)爬，每天能完成6次預(yù)爬的大鼠納入實(shí)驗(yàn)，否則予以剔除[18]。爬梯傾斜度設(shè)置為85°，采用大鼠尾部砝碼負(fù)重的方式進(jìn)行抗阻運(yùn)動，大鼠從梯子底部開始往上爬，每周運(yùn)動訓(xùn)練5 d，1組/d，6次/組，2 min/次，間隔20 s/次，總共訓(xùn)練4周。初始負(fù)重為大鼠自身體重的10%，每周遞增體重的20%負(fù)重，直至第4周負(fù)荷增加至體重的70%。對照組和CRT組不做干預(yù)，正常飼養(yǎng)。

1.5 樣本采集

第28天后干預(yù)結(jié)束。所有大鼠進(jìn)行取材，待大鼠麻醉后，進(jìn)行腹主動脈采血，離心收集血清后放置于-80°冰箱。剪開大鼠置管側(cè)皮膚，逐層鈍性分離，取穿刺點(diǎn)至右心房上段約5 cm靜脈血管，用于病理切片HE染色。剝離大鼠右下肢皮毛，暴露肌肉組織，獲取大鼠腓腸肌組織，用于實(shí)時熒光定量PCR檢測。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測方法

血栓溶解率: 取頸內(nèi)靜脈靠近上腔靜脈的三分之一處血管組織使用HE染色，脫水、透明、封片等，使用正置熒光相差顯微鏡成像分析系統(tǒng)采集圖像，應(yīng)用Image-Pro-Plus圖像分析軟件進(jìn)行分析，使用以下公式計(jì)算各組血栓溶解率：血栓溶解率=[（靜脈管腔面積-血栓面積）/靜脈管腔面積]×100%[19]。

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測:大鼠腹主動脈采血后，室溫放置30 min，離心10 min，得到血清。使用ELISA試劑盒檢測Irisin、IL-6、IL-10含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用多功能熒光發(fā)光分析儀檢測吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

實(shí)時熒光定量PCR檢測: 實(shí)時熒光定量PCR法檢測腓腸肌中PGC-1α、FNDC5 mRNA表達(dá)，采用Trizol法提取組織總RNA。測定RNA濃度及質(zhì)量后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒以組織總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt計(jì)算相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)分布的連續(xù)變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，分類變量用頻數(shù)和百分比描述。兩組別之間若方差齊采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，若方差不齊，則使用非參數(shù)檢驗(yàn)；多組別采用方差分析比較，若方差齊，則使用LSD法進(jìn)行兩兩比較；若方差不齊，則使用Tamhane T2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠基本情況分析及血栓溶解率比較

大鼠置管成功率為100%，置管后存活率為100%，導(dǎo)管留置期間無導(dǎo)管脫出，無出血、感染等并發(fā)癥。對照組大鼠血管內(nèi)皮完好，管腔內(nèi)無血栓形成，組織結(jié)構(gòu)完整。CRT組形成大面積血栓，內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞從血管壁長入血栓，形成肉芽組織伸入并取代血栓發(fā)生機(jī)化，與血管壁緊密粘連，血栓體部出現(xiàn)管腔樣裂隙，但未相互融合，血栓僅有小部分再通。干預(yù)28 d后CRT+抗阻運(yùn)動組血栓與血管壁之間存在空隙，小部分發(fā)生機(jī)化與血管壁粘連，血栓體內(nèi)壁恢復(fù)血流見紅細(xì)胞，血栓內(nèi)大面積再通（圖2）。CRT+抗阻運(yùn)動組的血栓溶解率高于CRT組[（83.84±8.82）% vs.（36.63±10.92）%，P＜0.01]。

圖2 三組大鼠靜脈組織形態(tài)學(xué)觀察（n=12，×10）

2.2 三組大鼠腓腸肌組織PGC-1α、FNDC5 mRNA相對表達(dá)水平比較（圖3）

圖3 三組大鼠腓腸肌組織PGC-1α、FNDC5 mRNA表達(dá)水平比較（n=12）

CRT組腓腸肌組織的PGC-1α、FNDC5 mRNA相對表達(dá)水平均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。CRT+抗阻運(yùn)動組腓腸肌組織的PGC-1α、FNDC5 mRNA相對表達(dá)水平均顯著高于CRT組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。

2.3 三組大鼠血清Irisin、IL-6、IL-10含量比較（圖4）

圖4 各組大鼠血清Irisin、IL-6、IL-10含量比較（n=12）

CRT組血清Irisin含量低于對照組，CRT+抗阻運(yùn)動組血清Irisin含量高于CRT組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。與對照組比較，CRT組血清IL-6含量增高，IL-10含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01），與CRT組比較，CRT+抗阻運(yùn)動組血清IL-6含量降低，IL-10含量增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。

3 討論

血栓形成是一個多因素的過程，經(jīng)典的Virchow三聯(lián)征包括內(nèi)皮損傷、靜脈流動停滯和（或）潛在的血栓形成前狀態(tài)[20]。炎癥反應(yīng)與血栓發(fā)生發(fā)展過程緊密相連，炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致機(jī)體凝血系統(tǒng)過度激活，形成血栓炎癥，另一方面，血栓凝血系統(tǒng)可增強(qiáng)凝血酶誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子分泌，促進(jìn)炎癥，導(dǎo)致惡性循環(huán)[21]。研究發(fā)現(xiàn)，新西蘭兔置入CVC 3周時，C反應(yīng)蛋白（CRP）、IL-6和凝血因子纖維蛋白原含量的水平迅速上升，右頸外靜脈和上腔靜脈炎細(xì)胞浸潤，管腔內(nèi)有血栓形成，可能是由于IL-6等炎癥因子可直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，使血小板活化、聚集、黏附，血栓形成[22-23]。因此凝血和纖溶之間的平衡決定了血栓形成的程度，僅依靠內(nèi)源性纖溶不能克服凝血和溶解血栓，因此血栓周圍的血流動力、血栓內(nèi)部的炎癥活性和全身血液中炎癥因子的濃度在消除血栓中起重要作用[24-25]。有研究發(fā)現(xiàn)，抗阻運(yùn)動作為一種生理刺激，經(jīng)血液動力學(xué)刺激介導(dǎo)血紅素加氧酶-1（HO-1）生物學(xué)活性，能顯著改善血管內(nèi)皮功能，減輕血管炎癥，加速CRT溶解再通[7]。另外抗阻運(yùn)動可以減緩骨骼肌退變，增加肌肉力量刺激炎癥介質(zhì)的增加，降低血清CRP、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-6水平，誘導(dǎo)抗炎環(huán)境[26]。

抗阻運(yùn)動指肌肉在克服外來阻力時進(jìn)行的主動運(yùn)動，基于改善血壓、血脂、血管彈性以及減輕內(nèi)皮受損導(dǎo)致炎癥出現(xiàn)等方面的優(yōu)勢，已成為控制動脈粥樣硬化的重要運(yùn)動形式[27]。運(yùn)動干預(yù)已被證實(shí)可以降低心血管疾病發(fā)病率，最近的一項(xiàng)研究證實(shí)，運(yùn)動可誘導(dǎo)骨骼肌PGC-1α的表達(dá)，PGC-1α促進(jìn)骨骼肌中FNDC5 mRNA表達(dá)，促使FNDC5合成，間接增加血漿中Irisin水平[10,28-29]。本研究顯示，CRT+抗阻運(yùn)動組干預(yù)28 d后骨骼肌PGC-1α、FNDC5 mRNA表達(dá)水平均顯著升高，表明抗阻運(yùn)動能有效刺激骨骼肌PGC-1α、FNDC5表達(dá)。近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)，Irisin通過抑制IL-6、TNF-α等炎癥因子水平升高、拮抗細(xì)胞凋亡和核因子κB（NF-κB）活化、抑制細(xì)胞氧化還原應(yīng)激、改善組織損傷和內(nèi)皮功能障礙等機(jī)制在高血壓、心肌梗死、動脈粥樣硬化等多種炎性疾病中發(fā)揮抗炎作用[30]。何青松等[13]發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化小鼠經(jīng)注射Irisin，TNF-α、NF-κB活性降低，且斑塊橫斷面面積小于模型組。且有臨床研究表明，Irisin/FNDC5水平降低是動靜脈內(nèi)瘺血栓（AVF）形成的風(fēng)險因素，Irisin/FNDC5對AVF預(yù)測具有中等價值[31]。本研究顯示，抗阻運(yùn)動能顯著升高血清Irisin、IL-10含量，降低血清IL-6含量，同時與對照組的自然溶解過程相比，Irisin高表達(dá)的CRT+抗阻運(yùn)動組血栓溶解明顯加快，由此證明抗阻運(yùn)動28 d可上調(diào)Irisin表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，這可能是促進(jìn)CRT溶解再通的關(guān)鍵機(jī)制。

綜上所述，抗阻運(yùn)動、Irisin/FNDC5、抗炎、血栓溶解再通均存在相互關(guān)系?？棺柽\(yùn)動可能通過刺激骨骼肌分泌FNDC5，進(jìn)而促進(jìn)釋放Irisin進(jìn)入血液循環(huán)，減輕血栓炎性反應(yīng)，加速血栓溶解。因此，本研究從動物實(shí)驗(yàn)層面探討抗阻運(yùn)動增強(qiáng)Irisin/FNDC5表達(dá)，加速CRT溶解再通的可能性，并為臨床抗阻運(yùn)動輔助治療CRT的實(shí)施提供有力證據(jù)及經(jīng)濟(jì)、科學(xué)、有效的輔助治療方案。

本研究也存在一定局限性，如未能實(shí)時運(yùn)用B超監(jiān)測CRT溶解再通過程及其安全性，也僅在動物層面上驗(yàn)證了Irisin/FNDC5介導(dǎo)抗炎促進(jìn)CRT溶解再通的作用，應(yīng)在細(xì)胞和其他動物水平進(jìn)一步明確其發(fā)揮功能的作用機(jī)制。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突