基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討近視復(fù)明丸治療近視的作用機(jī)制

黃 云，陳 姝，夏如梅，李 蕾，喻干龍，喻 娟*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一中醫(yī)臨床學(xué)院，湖南 長沙 410007

近視是一種全球普遍存在的視覺疾病，主要表現(xiàn)為遠(yuǎn)距離視物不清，近距離視物良好，并逐漸出現(xiàn)飛蚊癥、閃光感等癥狀，后期近視進(jìn)展為高度近視或者病理性近視，則容易合并多種眼部疾病，例如白內(nèi)障、青光眼、黃斑變性和視網(wǎng)膜脫離等，這些均可造成視力的嚴(yán)重喪失[1]。 近視已成為我國及全世界的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題，預(yù)計(jì)2050 年，全球近視患病人數(shù)將會達(dá)到47 億[2]。研究發(fā)現(xiàn)，2020 年，我國兒童青少年近視率為52.7%，其中，小學(xué)生35.6%、初中生71.1%、高中生達(dá)80.5%[3]。近視高發(fā)病率嚴(yán)重影響青少年的視覺健康。 目前，臨床上對近視的治療以框架眼鏡、角膜塑形鏡或低濃度阿托品滴眼液為主，同時(shí)也有耳穴貼壓及針刺等治療[4]，但各類方法療效并不明確，且均有一定局限性。

中醫(yī)藥防控近視具有獨(dú)特優(yōu)勢[5]。 近視在中醫(yī)古籍中被稱為“目不能視”“能近怯遠(yuǎn)癥”[6]。 《諸病源候論·目病諸候》[7]中認(rèn)為，本病為“勞傷肝腑，肝氣不足，兼受風(fēng)邪，使精華之氣衰弱，故不能遠(yuǎn)視”。 近視復(fù)明丸由芍藥、柴胡、木瓜、丹參、當(dāng)歸、人參、巴戟天、石菖蒲、黃芪組成，近視復(fù)明丸作為院內(nèi)制劑，是喻干龍教授根據(jù)青少年近視防治的長期臨床經(jīng)驗(yàn)組方而成。 肝氣郁結(jié)而致血循不暢，肝郁則脾失健運(yùn)，氣血生化無源，氣血無以上乘，目系則失其濡養(yǎng)。 柴胡疏肝理氣開郁；芍藥、木瓜味酸以斂肝；人參、黃芪健脾胃以補(bǔ)中氣；石菖蒲豁痰開竅；丹參、當(dāng)歸補(bǔ)血活血；巴戟天溫腎以升舉陽氣，濡養(yǎng)目竅。 近視復(fù)明丸在湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院應(yīng)用于近視治療已有20 余年，臨床療效較好，但其中藥復(fù)方的作用機(jī)制及靶點(diǎn)仍不明確。 本研究以近視復(fù)明丸治療近視的有效成分和靶點(diǎn)為切入點(diǎn)，研究其作用機(jī)制，為近視復(fù)明丸的臨床應(yīng)用提供進(jìn)一步的理論支持。

1 方法

1.1 近視復(fù)明丸活性成分及靶點(diǎn)的獲取

本研究采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫及TCMID 數(shù)據(jù)庫收集近視復(fù)明丸中芍藥、柴胡、木瓜、丹參、當(dāng)歸、人參、巴戟天、石菖蒲、黃芪的化學(xué)成分，并設(shè)置口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%，類藥性（druglikeness, DL）≥0.18，對其活性成分進(jìn)行鑒定，最終將數(shù)據(jù)導(dǎo)入藥物靶點(diǎn)預(yù)測系統(tǒng)SwissTargetPrediction，進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測。

1.2 近視相關(guān)靶點(diǎn)的獲取與篩選

以“myopia”為檢索詞，在GeneCards、DrugBank、OMIM 和Therapeutic Target Database 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索與篩選，最終得到近視的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 “藥物-疾病”網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建與分析

將近視復(fù)明丸藥物成分靶點(diǎn)與近視相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0 數(shù)據(jù)庫，所得交集靶點(diǎn)，即為近視復(fù)明丸治療近視的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 “成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將近視復(fù)明丸藥物成分靶點(diǎn)與近視靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)，共同導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)圖，同時(shí)分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩?，度值表示成分所涉及的靶點(diǎn)個(gè)數(shù)，度值越大，說明該成分對疾病治療作用越大。 本研究利用網(wǎng)絡(luò)模型下活性成分的度值，對近視復(fù)明丸治療近視的主要活性成分進(jìn)行分析。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction, PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將近視復(fù)明丸與近視的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。 將篩選的結(jié)果通過Cytoscape 3.9.1 軟件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，篩選近視復(fù)明丸治療近視的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

1.6 近視復(fù)明丸治療近視相關(guān)靶點(diǎn)的GO 和KEGG富集分析

將近視復(fù)明丸與近視的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行可視化分析。

2 動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.1 實(shí)驗(yàn)動物

選取約3 周齡雄性普通級健康豚鼠48 只，體質(zhì)量160～200 g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量許可證：SCXK（湘）2019-0015；實(shí)驗(yàn)動物在實(shí)驗(yàn)前均通過裂隙燈排除眼瞼異常、眼底等病變。 飼養(yǎng)條件：室溫保持在25 ℃左右，空氣濕度保持在45%～50%，晝夜交替飼養(yǎng)（12 h 交替光照），自由飲食，每日進(jìn)食新鮮蔬菜以補(bǔ)充體內(nèi)維生素C，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后開始實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審核批準(zhǔn)（倫理編號：ZYFY20220813-09）。

刀手、劍士全聚集在練功廳，武成龍?jiān)谏鲜椎溃骸按蠡锛杏诖耸怯捎诤谄鞎J進(jìn)本莊之前三少吩咐我告訴大伙：本莊不幸成為江湖鐵血組合，組合應(yīng)有組合的鐵律，三少會在不同時(shí)期有不同要求。雖然無法確定要求證確，但即使有誤也要無條件遵守。因?yàn)槿贋榧覉@而戰(zhàn)，由于家園危如懸卵，任何人違背三少意志三少都不會輕饒。也在那時(shí)我知道琴臺之戰(zhàn)是三少制造的第一懸案，也驀然悟及鐵衛(wèi)中有一些熟悉的面孔是由于我們數(shù)年天涯亡命，那些鐵衛(wèi)又放下了昔日的名聲?！?/p>

2.2 主要儀器與試劑

研磨儀（型號：KZ-II，武漢塞維爾生物科技有限公司）；冷凍離心機(jī)（型號：neofuge 15R，力新儀器上海有限公司）；電泳儀（型號：DYY-6D，北京六一生物科技有限公司）；熒光定量PCR 儀（型號：ABI QuantStudio 1，美國Thermo 公司）；逆轉(zhuǎn)錄儀（型號：SCI1000-G，美國SCILOGE 公司）；曝光儀（型號：HB-980，美國Protein simple 公司）；純水儀（型號：AJC-0501-P，重慶艾科浦有限公司）。 Trizol（批號：R1100，北京索萊寶科技有限公司）。 近視復(fù)明丸（生產(chǎn)批號：20220817，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院）。復(fù)方托吡卡胺滴眼液[生產(chǎn)批號：MP2262，參天制藥（中國）有限公司]。

2.3 分組、造模及給藥

隨機(jī)將豚鼠分為空白組、近視模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組，共4 組，每組12 只。 近視模型組、中藥高劑量組和中藥低劑量組豚鼠用半球形塑料眼罩遮蓋右眼4 周，誘導(dǎo)形覺剝奪性近視動物模型[8-9]，左眼不做處理；空白組不做任何處理。 4 周后經(jīng)檢影驗(yàn)光確認(rèn)造模成功[10]。 繼續(xù)保持造模狀態(tài)4周。 根據(jù)“人和動物按體表面積折算的等效劑量比值”折算等效劑量[11]。 予近視模型組2 mL 生理鹽水灌胃；中藥高劑量組予2 mL 近視復(fù)明丸藥粉（給藥濃度為0.8 g/mL）灌胃；中藥低劑量組予2 mL 近視復(fù)明丸藥粉（給藥濃度為0.2 g/mL）灌胃。 空白組予2 mL 生理鹽水灌胃。 每日1 次，連續(xù)灌胃4 周。

2.4 屈光度測量

在實(shí)驗(yàn)造模前和造模4 周后測量所有豚鼠屈光度，將豚鼠置于暗室，使用復(fù)方托吡卡胺滴眼液滴入豚鼠右眼結(jié)膜囊中，每5 min 滴1 次，充分散大瞳孔，驗(yàn)光師在30 min 后進(jìn)行帶狀光檢影鏡檢影驗(yàn)光檢測屈光度。

2.5 鞏膜組織病理學(xué)形態(tài)觀察

每組取3 只豚鼠，經(jīng)處死拆除眼球后，選取鞏膜組織固定在多聚甲醛溶液中，常規(guī)脫水、石蠟包埋，選取靠近視盤部切片，染色，顯微鏡下觀察各組鞏膜厚度及各層間結(jié)構(gòu)。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

每組各取3 只豚鼠，取右眼眼球，分離鞏膜組織，采用Trizol 法提取鞏膜組織總RNA，參考試劑盒說明書進(jìn)行操作，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，引物序列由北京擎科生物科技有限公司合成。 MMP-2 上游引物：5'-ACACACCTGATCTGGACCCT-3'；下游引物：5'-ACACAGATGTGCAGCGAAGA-3'；產(chǎn)物大小為93 bp。 TIMP-2 上游引物：5'-ACACAGATGTGCAGCGAAGA-3'；下游引物：5'-AACTACGAGGGCAACTGAGC-3'；產(chǎn)物大小162 bp。 調(diào)整反應(yīng)程序，執(zhí)行擴(kuò)增，先在94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃5 s，60 ℃30 s，72 ℃60 s，共循環(huán)45 次。最后以β-actin 作為內(nèi)參，用2-△△Ct方法進(jìn)行分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 8 軟件，計(jì)量資料采用“±s”表示，組間比較用Tukey 的多重比較檢驗(yàn)分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 近視復(fù)明丸活性成分與靶點(diǎn)

經(jīng)TCMSP 和TCMID 數(shù)據(jù)庫檢索，共收集到587個(gè)OB≥30%且DL≥0.18 的有效活性成分，其中芍藥123 種、柴胡74 種、木瓜123 種、丹參52 種、當(dāng)歸35 種、人參51 種、巴戟天26 種、石菖蒲42 種、黃芪61 種。 采用SwissTargetPrediction，將上述數(shù)據(jù)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，經(jīng)合并，篩除重復(fù)值后共得到近視復(fù)明丸作用靶點(diǎn)176 個(gè)。

3.2 近視相關(guān)作用靶點(diǎn)

利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫、Therapeutic Target Database 數(shù)據(jù)庫、DrugBank 數(shù)據(jù)庫和OMIM 數(shù)據(jù)庫，以“myopia”為檢索詞，分別檢索到4 888、2、270、26個(gè)與近視相關(guān)的靶點(diǎn)，移除重復(fù)值后得到4 217 個(gè)近視相關(guān)作用靶點(diǎn)。

3.3 “成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

圖1 近視復(fù)明丸與近視共同靶點(diǎn)

圖2 中藥-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

3.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選

通過STRING 平臺與Cytoscape 3.9.1 軟件生成PPI 網(wǎng)絡(luò)，圖中共有122 個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 996 條邊。節(jié)點(diǎn)的顏色和面積越深、越大，其節(jié)點(diǎn)度值越大。 結(jié)果顯示，絲氨酸-蘇氨酸激酶（serine-threonine kinase 1, AKT1）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A, VEGFA）、白細(xì)胞介素-1β（interlukin-1β, IL-1β）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-9（matrix metallo proteinase-9, MMP-9）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）等的度值排名靠前，推斷這些靶點(diǎn)是近視復(fù)明丸治療近視的核心靶點(diǎn)。 詳見圖3。

圖3 近視復(fù)明丸與近視PPI 網(wǎng)絡(luò)

3.5 GO 功能及KEGG 通路富集分析

通過對DAVID 數(shù)據(jù)庫GO 功能分析，共得到631條目，其中472 條生物過程（biological process, BP）、57 個(gè)細(xì)胞組成（cell composition, CC）、102 個(gè)分子功能（molecular function, MF），選取前10 項(xiàng)進(jìn)行可視化，并使用在線作圖工具繪制出GO 富集分析條形圖。 詳見圖4。 其中，BP 主要包括蛋白質(zhì)結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性等；CC 主要包括細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、核漿、細(xì)胞膜的組成部分、細(xì)胞外空間等；MF 主要包括RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、正調(diào)控轉(zhuǎn)錄、DNA 的正向調(diào)控等。 通過KEGG 富集通路分析，共獲得151 條細(xì)胞信號通路，通路主要涉及磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B, Akt）信號通路信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF）信號通路、白細(xì)胞介素-17（interleukin-17, IL-17）信號通路等。 選擇前20 條通路作為近視復(fù)明丸治療近視的重要途徑進(jìn)行分析。 詳見圖5。

圖4 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO 分析

圖5 核心靶點(diǎn)的KEGG 富集分析

3.6 各種豚鼠造模前后屈光度比較

造模前，各組豚鼠屈光度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。 造模4 周后，與空白組比較，近視模型組、中藥高劑量組和中藥低劑量組屈光度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果提示造模成功。 詳見表1。

表1 造模前后各組豚鼠屈光度比較（±s，n=12，D）

表1 造模前后各組豚鼠屈光度比較（±s，n=12，D）

注：與空白組比較，##P＜0.01。

組別空白組近視模型組中藥高劑量組中藥低劑量組造模前2.90±0.31 2.83±0.40 2.98±0.27 3.13±0.25造模后1.21±0.23-1.27±0.31##-1.15±0.29##-1.10±0.27##

3.7 近視復(fù)明丸對各組鞏膜厚度的影響

空白組豚鼠的鞏膜組織形態(tài)完整，膠原纖維結(jié)構(gòu)緊密，細(xì)胞排列整齊，分布規(guī)則；近視模型組鞏膜厚度較空白組變薄，且膠原纖維結(jié)構(gòu)疏松，排列紊亂；中藥高劑量組與中藥低劑量組鞏膜厚度較模型組均增加；中藥高劑量組膠原纖維排列較模型組稍緊密，各層結(jié)構(gòu)較中藥低劑量組清晰。 與空白組比較，近視模型組顯著變薄（P＜0.01）；與近視模型組比較，中藥低劑量組、中藥高劑量組厚度顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。 詳見表2，圖6。

表2 各組豚鼠鞏膜厚度比較（±s，n=3）

表2 各組豚鼠鞏膜厚度比較（±s，n=3）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與近視模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別空白組近視模型組中藥高劑量組中藥低劑量組鞏膜厚度/μm 346.23±5.38 319.33±7.32##341.10±3.04**336.00±1.55*

圖6 各組豚鼠鞏膜組織HE 染色圖（×200）

3.8 近視復(fù)明丸對鞏膜組織中MMP-2 及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2, TIMP-2）mRNA 表達(dá)的影響

與空白組比較，近視模型組豚鼠鞏膜組織中MMP-2 mRNA 表達(dá)水平顯著增加（P＜0.01）、TIMP-2 mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與近視模型組相比較，中藥高劑量組中豚鼠鞏膜組織MMP-2 mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）、TIMP-2 mRNA 表達(dá)水平明顯增加（P＜0.05）；與中藥高劑量組相比較，中藥低劑量組鞏膜組織中MMP-2 mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。 詳見表3。

表3 近視復(fù)明丸對鞏膜組織中MMP-2 及TIMP-2 mRNA表達(dá)的影響（±s，n=3）

表3 近視復(fù)明丸對鞏膜組織中MMP-2 及TIMP-2 mRNA表達(dá)的影響（±s，n=3）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與近視模型組比較，*P＜0.05；**P＜0.01；與中藥高劑量組比較，&&P＜0.01。

組別空白組近視模型組中藥高劑量組中藥低劑量組MMP-2 1.000±0.089 1.337±0.061##0.763±0.026**0.057±0.005**&&TIMP-2 1.000±0.09 0.272±0.018##0.709±0.037*0.142±0.003

4 討論

從藥物-疾病交集靶點(diǎn)可知，近視復(fù)明丸可作用于AKT1、VEGFA、IL-1β、MMP-9、EGFR、MMP-2 等多個(gè)靶點(diǎn)，從而起到治療近視作用。 在近視復(fù)明丸治療近視過程中，發(fā)揮關(guān)鍵作用的途徑主要包括PI3K/Akt信號通路、MAPK 信號通路、TNF 信號通路等。

Akt 可調(diào)節(jié)多種生物過程，它在調(diào)節(jié)細(xì)胞生存、增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用[12]。 其中的亞型AKT1，在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育，生長及存活上有著獨(dú)特的優(yōu)勢作用[13]。HUANG 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，AKT1 通過在小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞發(fā)生的極化作用，影響視神經(jīng)病變的病程變化。表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）是作用在機(jī)體內(nèi)外各種組織細(xì)胞上的生長因子， 可通過促進(jìn)鞏膜成纖維細(xì)胞的增殖，進(jìn)而影響鞏膜的重塑[15]。 而EGFR 可參與調(diào)節(jié)鞏膜成纖維細(xì)胞的增殖和分化[16]。 EGR 與EGFR 結(jié)合，對體內(nèi)外的組織生長與增殖起著明顯的調(diào)節(jié)作用[17]。

基因金屬蛋白酶是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）并參與鞏膜重塑的內(nèi)肽酶[18-19]，其家族成員MMP-2 與鞏膜ECM 重塑關(guān)系最為密切[20]。在近視的發(fā)展過程中，鞏膜重塑在其中起到關(guān)鍵調(diào)控作用，而鞏膜重塑的關(guān)鍵在于MMP-2及其抑制物TIMP-2 之間的動態(tài)平衡[21]。 LIU 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在形覺剝奪誘導(dǎo)近視樹鼩中發(fā)現(xiàn)MMP-2 表達(dá)水平增高，而TIMP-2 表達(dá)水平降低。 QIAN 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在近視豚鼠鞏膜中，吡侖西平降低了MMP-2 的表達(dá)，增加了組織抑制物TIMP-2 的表達(dá)，這提示MMP-2 與TIMP-2 的動態(tài)平衡在近視中發(fā)揮著重要作用。

PI3K/Akt 信號通路對多種眼病有著重要的調(diào)節(jié)作用[24]，該通路有多種下游信號通路，包括糖原合成酶激酶3 和凋亡信號調(diào)控激酶1 等[25]，PI3K 通過催化方式生成產(chǎn)物，進(jìn)而激活絲裂原活化蛋白激酶等蛋白，進(jìn)而參與多種近視相關(guān)的生物過程，其中包括鞏膜重塑[26]。研究顯示，玻璃體內(nèi)miR-200a 紊亂，原因是PI3K/Akt 信號通路影響眼軸長度的發(fā)展[27]。這也進(jìn)一步說明，PI3K/Akt 信號通路可以抑制近視的進(jìn)展。

本研究在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的基礎(chǔ)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果顯示，與近視模型組比較，近視復(fù)明丸使MMP-2 mRNA 表達(dá)水平下降，TIMP-2 mRNA 表達(dá)水平增加，促進(jìn)鞏膜膠原纖維的合成，減少鞏膜膠原纖維的降解，進(jìn)而調(diào)控鞏膜重塑，延緩近視進(jìn)展。 本研究為近視復(fù)明丸的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為后續(xù)近視復(fù)明丸的相關(guān)研究提供了新線索與新思路。此外，對于其他相關(guān)靶點(diǎn)和信號通路，未來還需進(jìn)一步深入研究及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。