基于HPLC 和LC-Orbitrap-MS 的梔子化學(xué)成分定性與定量研究

袁漢文，李云耀*，梁 玲，呂夢(mèng)穎，王 煒*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥民族醫(yī)藥國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南交通工程學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421001

中藥梔子（Gardeniae Fructus）為茜草科植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis）的成熟果實(shí)，習(xí)稱山梔子。梔子為清熱瀉火藥，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒等功效，常用于熱病心煩、濕熱黃疸等疾病[1]。研究表明，梔子中主要成分為環(huán)烯醚萜類，如京平尼苷（Geniposide）、山梔苷（Shanzhiside）、羥異梔子苷（Gardenoside）等[2]。 此外，梔子中還含有大量的二萜類化合物，如西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、西紅花苷Ⅲ等[3]。 梔子具有保肝利膽、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血脂、抗病原微生物等多種藥理作用[4]。 梔子苷被認(rèn)為是梔子的主要有效成分，在2020 版《中華人民共和國(guó)藥典》 中，TLC 鑒別主要檢測(cè)其是否存在梔子苷，HPLC 含量測(cè)定規(guī)定梔子中梔子苷的含量以干燥品計(jì)，不得低于1.8%[1]。 大花梔子（Gardenia jasminoides Eills var.grandiflora Nakai）為梔子的變種，其果實(shí)習(xí)稱水梔子，外形較中藥梔子略大，化學(xué)成分與中藥梔子高度相似，但歷來(lái)不作藥用，是中藥梔子最常見(jiàn)的混淆品[5]。

本研究利用HPLC 雙波長(zhǎng)法對(duì)梔子中的主要成分進(jìn)行了分析，建立了梔子特征圖譜，并通過(guò)與對(duì)照品溶液進(jìn)行比較鑒定了11 個(gè)主要成分。 PCA 和PLS-DA 分析結(jié)果表明，山梔子和水梔子主要的化學(xué)成分沒(méi)有明顯差異。 此外，本研究還建立了6 個(gè)主要成分的含量測(cè)定方法，并利用LC-Orbitrap-MS技術(shù)從梔子中鑒定了31 個(gè)成分。

1 材料

1.1 試劑

HPLC 級(jí)甲醇（批號(hào)：WXBD9351V）和乙腈（批號(hào)：WXBF0117V）購(gòu)自美國(guó)Sigama Aldrich 公司，其他分析純?cè)噭┚?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（中國(guó)上海）。 所有水溶液均使用怡寶純凈水（華潤(rùn)怡寶飲料有限公司）制備。對(duì)照品西紅花苷Ⅰ（批號(hào)：DST191027-142）、梔子苷（批號(hào)：DST200713-032）、羥異梔子苷（批號(hào)：DST210715-126）、梔子新苷（批號(hào)：DST200723-122）、西紅花苷Ⅱ（批號(hào)：DST200527-012）、西紅花苷Ⅲ（批號(hào)：DST210210-145）、雞矢藤次苷甲酯（批號(hào)：DST211020-108）、京尼平苷酸（批號(hào)：DSTDJ004001）、山梔苷（批號(hào)：DST210718-142）購(gòu)于成都樂(lè)美天制藥科技有限公司，其他對(duì)照品，包括去乙酰車葉酸甲酯（批號(hào)：ST19440120），京尼平龍膽雙糖苷（批號(hào)：ST56070120）購(gòu)于上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司。 所有對(duì)照品經(jīng)HPLC 測(cè)定，其純度在98%以上。

1.2 藥材

15 批山梔子和9 批水梔子課題組收集于湖南、江西、安徽等省份的不同城市，并由湖南中醫(yī)藥大學(xué)龔力民副教授鑒定為梔子（Gardenia jasminoides Eills）或大花梔子（Gardenia jasminoides Eills var.grandiflora Nakai）的干燥成熟果實(shí)。

1.3 主要儀器

1260 型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；AE100S 型電子天平（梅特勒-托利多公司）；KQ2200DB 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CTH1850 型臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘立科學(xué)儀器有限公司）；101 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京市光明醫(yī)療儀器有限公司）；Vanquish Flex UHPLC 與Orbitrap Exploris 120 質(zhì)譜儀聯(lián)用系統(tǒng)（賽默飛世爾科技）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

HPLC 分析流動(dòng)相由乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B）組成，梯度洗脫程序?yàn)椋?～30 min，5%～30%A；30～60 min，30%～50% A；60～65 min，50%～95%A；65～70 min，95% A。檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm 和440 nm（0～28.5 min 檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm；28.5～70 min 檢測(cè)波長(zhǎng)為440 nm），流速為1 mL/min，柱溫維持在30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。 色譜柱為Agilent 5 TC-C18（5 μm,4.6 cm×250 cm)。

LC-Orbitrap-MS 分析流動(dòng)相由乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B）組成，梯度洗脫程序?yàn)椋?～40 min，5%～50% A；40～45 min，50%～95% A；45～50 min，95% A。 流速為0.3 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，色譜柱為Hypersil GOLDTM Aq-C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）。 正負(fù)離子模式下噴霧電壓分別為2 500 V 和3 500 V；鞘氣10 Arb；離子傳輸管溫度，325 ℃；碰撞能量30 eV；MS 掃描范圍100～1 000 Da；MS2 掃描范圍50～1000 Da。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精確稱取對(duì)照品適量，并將其單獨(dú)溶解在甲醇中，以獲得儲(chǔ)備溶液。 此后，通過(guò)混合和稀釋儲(chǔ)備溶液獲得一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，所有標(biāo)準(zhǔn)溶液于4 ℃避光保存。

2.3 樣品溶液制備

山梔子與水梔子藥材粉碎后過(guò)80 目篩，即得樣品粉末。 取樣品粉末1.000 0 g，置于50 mL 錐形瓶中，加25 mL 甲醇，超聲提取30 min，10 000 r/min 離心10 min 后，取上清液，即得。

2.4 特征圖譜建立

對(duì)柱溫、進(jìn)樣量、流動(dòng)相、提取溶劑等進(jìn)行了考察，為保證各色譜峰的分離效率，最終確定的最佳色譜條件如2.1 項(xiàng)下所示，梔子的HPLC 色譜圖如圖1所示。取同一份樣品，連續(xù)進(jìn)樣6 次，考察其精密度。取同一份樣品，分別在0、4、8、12、24、48 h 進(jìn)樣分析以考察穩(wěn)定性。 取同一樣品，平行制備6 份，進(jìn)樣分析考察重復(fù)性。取同一份樣品，使用3 種不同的色譜柱，在兩臺(tái)不同品牌的液相儀器上進(jìn)行進(jìn)樣分析，考察方法的耐用性。記錄色譜圖，以及各共有色譜峰的保留時(shí)間（Rt）和峰面積（PA）。 并以梔子苷為參照物，計(jì)算各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間（RRT）和相對(duì)峰面積（RPA）的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表1。 耐用性考察中1 號(hào)峰和3 號(hào)峰RRT 略大于5%，分別為5.95%和6.12%，其余各項(xiàng)考察各色譜峰RPA 和RRT 的RSD 值均小于5%，說(shuō)明該方法穩(wěn)定可靠。 將15 批山梔子與9 批水梔子按上述方法制備樣品溶液并進(jìn)樣分析，記錄色譜圖并將其導(dǎo)入到中藥色譜指紋圖譜相似性評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 A 版）軟件中進(jìn)行分析，建立其特征圖譜（圖2）。 大部分山梔子在圖2—9 方框1 和方框2 標(biāo)記處分別有3 個(gè)小峰，而在水梔子中這些位置均沒(méi)有明顯的峰，但山梔子中也有在這些位置沒(méi)有峰的樣品如S15 和S6，故僅利用這些特征也難以準(zhǔn)確地鑒別山梔子和水梔子。

圖1 梔子HPLC 色譜圖

圖2 山梔子（A）和水梔子（B）指紋圖譜

表1 方法學(xué)考察各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD（%）

將11 個(gè)主要成分的峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入Simca-p 14.1 軟件中進(jìn)行PCA 和PLS-DA 分析，其得分圖如圖3 所示，山梔子和水梔子樣品在圖中沒(méi)有明顯的分離趨勢(shì)，說(shuō)明山梔子和水梔子化學(xué)成分差異不明顯。

圖3 PCA（A）和PLS-DA（B）得分圖

2.5 含量測(cè)定

對(duì)6 個(gè)最主要的成分，包括梔子苷、羥異梔子苷、京尼平雙糖苷、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、西紅花苷Ⅲ進(jìn)行了含量測(cè)定。 各化合物校正曲線、線性范圍、LOD 和LOQ 考察結(jié)果如表2 所示。 將已知量的各對(duì)照品加入準(zhǔn)確稱量的樣品中，并通過(guò)所述方法制備6 份，用于HPLC 分析。 回收率計(jì)算如下：回收率（%）=（測(cè)得量-樣品中的量）/加入量×100%。 其回收率分別為95.9%、98.5%、98.0%、95.3%、99.3%、95.3%。 綜上，各成分線性良好，該方法穩(wěn)定可靠，可用于梔子的含量測(cè)定。含量測(cè)定結(jié)果表明（圖4），梔子中主要成分為梔子苷、羥異梔子苷和西紅花苷Ⅰ，梔子苷的含量高達(dá)7.25 mg/g，梔子苷和羥異梔子苷在山梔子和水梔子中含量沒(méi)有明顯差異。

圖4 各樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg·mL-1)

表2 主要成分的校正曲線、線性范圍、LOD、LOQ 結(jié)果

2.6 LC-Orbitrap-MS 分析

梔子將LC-Orbitrap-MS 總離子圖如圖5 所示，數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discoverer 軟件中，進(jìn)行空白扣除、峰對(duì)齊、解卷積、峰提取、譜庫(kù)搜索（mzCloud、mzVault）、化合物匹配。 篩選mzClound best match≥90 且mzClound best match confidence≥60 或者mzVualt best match≥90 的化合物，得到初步鑒定的成分。排除可信度相對(duì)較低的成分，如某些化合物難以裂解產(chǎn)生二級(jí)碎片，或二級(jí)質(zhì)譜圖相應(yīng)低，則會(huì)造成主要依靠母離子進(jìn)行匹配而導(dǎo)致匹配度較高的假陽(yáng)性結(jié)果，故可限定子離子匹配的個(gè)數(shù)，提高鑒定的準(zhǔn)確性；另外，梔子中主要為含C、H、O、N 的成分，可排除含其他元素的成分，最終從梔子中鑒定了31個(gè)成分（表3）。

圖5 梔子正離子模式（A）和負(fù)離子模式（B）總離子流圖

表3 LC-Orbitrap-MS 鑒定結(jié)果

3 討論

本文以大宗果實(shí)類藥材梔子為研究對(duì)象，利用HPLC 對(duì)其主要成分進(jìn)行分析，建立了梔子特征圖譜，通過(guò)與對(duì)照品溶液進(jìn)行比較鑒定了11 個(gè)主要成分，包括梔子新苷、山梔苷、京尼平苷酸、去乙酰車葉酸甲酯、羥異梔子苷）、雞矢藤次苷甲酯、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、西紅花Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、西紅花苷Ⅲ，并建立了其中6 個(gè)最主要成分的含量測(cè)定方法。水梔子是山梔子的變種，研究結(jié)果也表明，二者主要化學(xué)成分高度相似，僅部分微量成分有細(xì)微差異，水梔子能否作藥用并代替山梔子有待深入研究。此外，本研究利用LC-Orbitrap-MS 結(jié)合Compound Discoverer 分析平臺(tái)和mzCloud 和mzVault 二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)梔子中的成分進(jìn)行了分析，并鑒定了31 個(gè)成分。 本研究建立的方法穩(wěn)定可靠，可為木瓜和梔子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供理論依據(jù)，并能助力其國(guó)際化與現(xiàn)代化。