丁?；鈮A代謝異常新生兒的基因型和生化表型分析

吳鼎文，楊茹萊，方可欣，劉 晨，湯佳明，于美君，趙正言

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院遺傳與代謝科 國(guó)家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 浙江省新生兒疾病診治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310052

串聯(lián)質(zhì)譜法將傳統(tǒng)的“一樣本、一檢測(cè)、一標(biāo)志物、一疾病”篩查變成了“一樣本、一檢測(cè)、多標(biāo)志物、多疾病”篩查，成為新生兒疾病篩查領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)［1］?；诟裳哌M(jìn)行C4 檢測(cè)主要用于IBDD 和SCADD 的新生兒篩查［2］。但因C4 和異丁酰肉堿的質(zhì)荷比相同，無(wú)法通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜法區(qū)分，故進(jìn)一步的分型檢測(cè)十分關(guān)鍵［3］?；驒z測(cè)是對(duì)生化檢測(cè)的有效補(bǔ)充，可提高遺傳代謝病診斷的準(zhǔn)確性，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值［4］?；诎邢蚧虿东@的高通量測(cè)序是針對(duì)感興趣的特定基因外顯子區(qū)域定制探針，與基因組DNA進(jìn)行雜交，經(jīng)富集后利用高通量測(cè)序進(jìn)行分析。由于測(cè)序的目標(biāo)區(qū)域只占基因組的一小部分，因此可在保證獲得足量目標(biāo)基因變異信息的前提下，極大地降低測(cè)序成本。靶向基因捕獲與高通量測(cè)序的組合應(yīng)用既保留了信息自動(dòng)化分析的優(yōu)勢(shì)，又避免檢測(cè)過(guò)多冗余內(nèi)含子區(qū)域，大大提高了基因缺陷疾病的檢測(cè)效率［5-6］。當(dāng)前，生化指標(biāo)檢測(cè)聯(lián)合基因變異的篩查已成為新生兒疾病篩查的新趨勢(shì)［7］。故明確基因變異型與生化表型的關(guān)系更顯得必要和緊迫。迄今，對(duì)于新生兒疾病篩查中出現(xiàn)單純性C4 增高的群體，其基因變異型與生化表型的關(guān)聯(lián)性尚待進(jìn)一步探討。本研究回顧性分析了120 例單純性C4 增高新生兒臨床檢測(cè)資料，通過(guò)靶向捕獲目標(biāo)基因聯(lián)合高通量測(cè)序檢測(cè)C4 代謝異常新生兒的基因變異情況，分析基因變異型與生化表型的關(guān)系，從而為新生兒遺傳代謝病篩查及臨床決策提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

收集2018年1月至2023年6月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜法篩查結(jié)果為單純C4增高的120例新生兒（男性63例，女性57例）初篩和召回復(fù)查的C4、C4/C3 檢測(cè)數(shù)據(jù)。在法定監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書后，采集C4增高新生兒及其父母EDTA 抗凝靜脈血各1.0～2.0 mL，4 ℃保存?zhèn)溆?。研究通過(guò)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查（2018-IRB-076）。

1.2 主要儀器及試劑

Xevo TQD串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)為美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；Nanodrop2000 超微量核酸蛋白測(cè)定儀為美國(guó)ThermoFisher Scientific 公司產(chǎn)品；HiSeq 2500NGS平臺(tái)為美國(guó)Illumina 公司產(chǎn)品；3500XL 測(cè)序儀為美國(guó)ABI Life 公司產(chǎn)品；非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測(cè)定試劑盒為美國(guó)PerkinElmer公司產(chǎn)品；QIAamp DNA Blood Mini Kit 血液DNA提取試劑盒為德國(guó)Qiagen 公司產(chǎn)品；Qubit 雙鏈DNA 檢測(cè)試劑盒、BigDyeTMTerminator v3.1 循環(huán)測(cè)序試劑盒為美國(guó)Invitrogen 公司產(chǎn)品；Agencourt AMPure XP 磁珠為美國(guó)Beckman Coulter 公司產(chǎn)品；TruePrepTM DNA Library Prep Kit V2 for Illumina?Kit 文庫(kù)構(gòu)建試劑盒、TruePrepTM Index Kit V2 for Illumina?Kit標(biāo)簽試劑盒為美國(guó)Vazyme公司產(chǎn)品；High Sensitivity DNA Kit 檢測(cè)試劑盒為美國(guó)Agilent 公司產(chǎn)品；DNA Quantification Standards and Primer Premix Kit 文庫(kù)定量試劑盒為美國(guó)KAPA Biosystems 公司產(chǎn)品；LA PCRTMKit酶試劑盒為日本TaKaRa 公司產(chǎn)品；NucleoSpin?Gel and PCR Clean-up PCR 產(chǎn)物純化試劑盒為德國(guó)Macherey-Nagel公司產(chǎn)品。

1.3 串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)新生兒外周血C4 及結(jié)果判斷

依據(jù)新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范的要求采集干血斑，參考非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測(cè)定試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，于Xevo TQD 串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。參考文獻(xiàn)［8］中的方法收集C4和C4/C3檢測(cè)數(shù)據(jù)。為消除不同時(shí)期C4檢測(cè)的差異，獲得C4水平在“同一平面”的比較分析，將C4 和C4/C3 檢測(cè)數(shù)據(jù)換算成C4 增高倍數(shù)。根據(jù)C4 檢測(cè)值參考范圍（0.03～0.48 μmol/L）和C4/C3比值參考范圍（0.04～0.46），C4增高倍數(shù)=（C4檢測(cè)值÷0.48+C4/C3比值÷0.46）÷2。召回串聯(lián)質(zhì)譜初篩發(fā)現(xiàn)C4指標(biāo)增高的新生兒，重新采樣進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，C4仍增高者確定為“C4增高”。

1.4 靶向捕獲目標(biāo)基因聯(lián)合高通量測(cè)序檢測(cè)基因變異

1.4.1 DNA提取 采用QIAamp DNA Blood Mini Kit 血液DNA 提取試劑盒，按照說(shuō)明書提取全血基因組DNA，采用紫外分光光度計(jì)和Qubit雙鏈DNA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)DNA濃度和純度。

1.4.2 建庫(kù)及測(cè)序 由美國(guó)Agilent 公司定制ACAD8和ACADS基因的外顯子及鄰近50 bp 區(qū)域的捕獲探針，通過(guò)多重探針雜交方法靶向富集目標(biāo)區(qū)域序列；Agencourt AMPure XP 磁珠純化捕獲產(chǎn)物。按照TruePrepTM DNA Library Prep Kit V2 for Illumina?Kit文庫(kù)構(gòu)建試劑盒說(shuō)明書處理純化產(chǎn)物，建庫(kù)過(guò)程中每個(gè)樣本加上特殊標(biāo)簽。文庫(kù)經(jīng)Qubit及2100 Bioanalyzer進(jìn)行濃度及片段大小質(zhì)檢分析確定合格后，利用DNA Quantification Standards and Primer Premix Kit 文庫(kù)定量試劑盒進(jìn)行文庫(kù)精確定量并確定上機(jī)樣本量，最后在HiSeq 2500平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。目標(biāo)區(qū)覆蓋度大于99.90%，目標(biāo)區(qū)平均測(cè)序深度大于300次。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理 將基因靶向高通量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行低質(zhì)量過(guò)濾，以人類基因組hg19 為參考序列，通過(guò)BWA（Burrows-Wheeler Aligner）、Picard等生物信息軟件進(jìn)行序列比對(duì)及重復(fù)標(biāo)記。采用GATK（The Genome Analysis Toolkit）、Samtools進(jìn)行變異位點(diǎn)的識(shí)別［9］。采用Annovar 注釋軟件將變異位點(diǎn)注釋到公共突變數(shù)據(jù)庫(kù)，以變異位點(diǎn)的人群頻率、序列保守性、變異所處的位置等條件進(jìn)行篩選。

1.5 桑格測(cè)序檢測(cè)基因變異的遺傳來(lái)源

采用桑格測(cè)序?qū)π律鷥杭捌涓浮⒛赣H進(jìn)行候選變異位點(diǎn)的驗(yàn)證，以明確變異的遺傳來(lái)源及順式或反式。取50 ng DNA，使用待測(cè)位點(diǎn)的特異性引物，按照LA PCRTMKit 酶試劑盒操作流程進(jìn)行PCR，并使用NucleoSpin?Gel and PCR Clean-up試劑盒純化PCR產(chǎn)物。回收PCR產(chǎn)物按照BigDyeTMTerminator v3.1 循環(huán)測(cè)序試劑盒操作流程進(jìn)行測(cè)序PCR 反應(yīng)及純化。純化產(chǎn)物于ABI 3500XL 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果采用SeqMan 軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析。

1.6 蛋白功能域預(yù)測(cè)及基因變異的致病性評(píng)估

通過(guò)檢索NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得ACAD8基因（NM_014384.3）和ACADS基因（NM_000017.4）的蛋白質(zhì)序列。通過(guò)SMART數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//smart.embl-heidelberg.de/smart/change_mode.pl）對(duì)基因的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行功能域預(yù)測(cè)。采用SIFT、Polyphen2_HDIV、Polyphen2_HVAR、LRT、MutationTaster、Mutation Assessor、FATHMM、PROVEAN、MetaSVM、MetaLR、REVEL等11個(gè)生物信息軟件預(yù)測(cè)錯(cuò)義突變的危害性，并使用SpliceAI 軟件預(yù)測(cè)變異是否影響基因剪切。在ClinVar、HGMD、LOVD 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索相關(guān)變異的收錄和注釋情況，在PubMed 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索相關(guān)變異的文獻(xiàn)報(bào)道情況。參考ACMG 分類標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合臨床隨訪情況評(píng)估變異的致病性，具體分為“致病”、“可能致病”、“臨床意義未明”、“可能良性”、“良性”五級(jí)［10］。評(píng)估為“致病”、“可能致病”、“臨床意義未明”的基因變異納入本次研究。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過(guò)R 語(yǔ)言（https：//www.r-project.org/）編程。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用威爾科克森秩和檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單純C4增高新生兒基因變異檢測(cè)結(jié)果

在120 例C4 增高新生兒中，檢出ACAD8基因和（或）ACADS基因變異117例（97.50%），均為遺傳來(lái)源。ACAD8基因共檢出32 種變異型，涉及23 種錯(cuò)義突變（71.88%）、5 種移碼突變（15.63%）、3 種剪接突變（9.38%）和1 種同義突變（3.13%）。其中，c.244_245del（p.A82Pfs*22）、c.258del（p.F86Lfs*38）、c.121C＞T（p.L41F）、c.359C＞T（p.T120I）、c.887G＞A（p.R296Q）、c.947A＞C（p.Q316P）、c.986C＞T（p.A329V）未曾報(bào)道，根據(jù)蛋白功能域預(yù)測(cè)結(jié)果，這7個(gè)變異均位于功能域，前2種移碼突變?cè)u(píng)估為“致病”，后5種錯(cuò)義突變?cè)u(píng)估為“臨床意義未明”。ACAD8基因變異位點(diǎn)分布情況見(jiàn)圖1。ACADS基因共檢出41 種變異型，涉及38種錯(cuò)義突變（92.68%）、2種剪接突變（4.88%）和1 種整碼突變（2.44%）。其中17 種變異型未曾報(bào)道，具體為c.79A＞C（p.T27P）、c.104C＞T（p.P35L）、c.233G＞A（p.G78E）、c.301G＞T（p.A101S）、c.346A＞G（p.M116V）、c.360+5G＞A、c.466G＞A（p.E156K）、c.586G＞A（p.V196M）、c.698T＞C（p.I233T）、c.820G＞T（p.G274C）、c.847G＞A（p.A283T）、c.862G＞T（p.D288Y）、c.968G＞A（p.S323N）、c.987G＞T（p.W329C）、c.1049T＞C（p.L350P）、c.1062G＞C（p.E354D）、c.1186G＞A（p.E396K），其中c.360+5G＞A 為剪接突變，其余均為錯(cuò)義突變；除c.79A＞C（p.T27P）外，其余均位于功能域；c.233G＞A（p.G78E）和c.1186G＞A（p.E396K）被評(píng)估為“可能致病”，其余15種均被評(píng)估為“臨床意義未明”。ACADS基因變異位點(diǎn)分布情況見(jiàn)圖2。上述結(jié)果提示，ACAD8基因和ACADS基因變異是導(dǎo)致新生兒血C4 增高的主要遺傳學(xué)原因，錯(cuò)義突變是主要類型，且均存在高頻變異型。

圖1 本研究檢出的32種ACAD8基因變異位點(diǎn)分布Figure 1 Distribution of ACAD8 genes variations detected in the study

圖2 本研究檢出的41種ACADS基因變異位點(diǎn)分布Figure 2 Distribution of ACADS genes variations detected in the study

2.2 不同基因型新生兒C4增高倍數(shù)比較

120 例新生兒中，檢出ACAD8雙等位基因變異39例，ACAD8單等位基因變異3 例，ACADS雙等位基因變異34例，ACADS單等位基因變異36例，ACAD8和ACADS雙 基因變 異5例，未檢出基因變異3例。其中，ACAD8雙等位基因變異組的C4增高倍數(shù)初篩值為3.39±0.97（1.64～5.35），召回值 為3.79±1.18（1.00～5.86，其中1例小于1.50）；ACADS雙等位基因變異組的C4 增高倍數(shù)初篩值為2.63±0.95（1.53～5.79），召回值為2.90±1.25（1.29～6.16，其中4 例小于1.50）；ACADS單等位基因變異組的C4 增高倍數(shù)初篩值為1.42±0.35（0.87～2.49，其中27 例小于1.50），召回值為1.33±0.26（0.94～1.97，其中30 例小于1.50）。因ACAD8單等位基因變異及ACAD8和ACADS雙基因變異的例數(shù)較少，不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)分析價(jià)值，故不予分組分析。組間比較顯示，ACAD8雙等位基因變異組、ACADS雙等位基因變異組C4 增高倍數(shù)初篩值和召回值均顯著高于ACADS單等位基因變異組（均P＜0.01），且ACAD8雙等位基因變異組C4 增高倍數(shù)初篩值和召回值較ACADS雙等位基因變異組均更高（均P＜0.01），見(jiàn)圖3，各例的基因型和C4 增高倍數(shù)見(jiàn)附表1。結(jié)果提示，檢出雙等位基因變異新生兒的C4 水平較單等位基因變異者高，且ACAD8變異者較ACADS變異者的C4水平更高；新生兒在初篩時(shí)，C4 增高倍數(shù)1.50 以上檢出雙等位基因變異的概率更高。

圖3 不同基因型新生兒C4增高倍數(shù)比較Figure 3 Comparison of multiples of C4 reference range among different gene variations groups

3 討論

采用串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)新生兒干血斑中數(shù)十種氨基酸、游離肉堿及?；鈮A的水平來(lái)篩查氨基酸代謝障礙、有機(jī)酸血癥及脂肪酸氧化代謝障礙等多種遺傳代謝病，已廣泛應(yīng)用于新生兒出生缺陷的防治［11］。C4 是串聯(lián)質(zhì)譜法新生兒篩查的重要指標(biāo)，在IBDD、SCADD、乙基丙二酸腦病、Ⅱ型戊二酸血癥和甲亞氨基谷氨酸尿癥病例中均可出現(xiàn)C4 或C4 異構(gòu)體的增高［2］。當(dāng)前，國(guó)際上普遍采用流動(dòng)注射式串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行新生兒遺傳代謝病篩查，可實(shí)現(xiàn)高通量，但無(wú)法分離C4 的異構(gòu)體和同量異位化合物［3］。因此對(duì)C4增高新生兒進(jìn)行后續(xù)的鑒別診斷十分重要。

既往研究表明，IBDD 和SCADD 均為常染色體隱性遺傳病，分別由ACAD8和ACADS的雙等位基因變異所致，串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)均呈現(xiàn)單純的C4增高［2］。在本研究隊(duì)列的120 例單純C4 增高的新生兒中，39 例檢出ACAD8雙等位基因變異，3 例檢出ACAD8單等位基因變異，34 例檢出ACADS雙等位基因變異，36例檢出ACAD8單等位基因變異（19 例為母源，17 例為父源），5 例檢出ACAD8和ACADS雙基因變異，說(shuō)明單純C4增高新生兒的遺傳學(xué)原因復(fù)雜，ACAD8和ACADS基因的雙等位基因變異、單等位基因變異及雙基因復(fù)雜變異均可導(dǎo)致不同程度的C4 增高。本次檢出的32種ACAD8基因變異型離散分布于1 至10 號(hào)外顯子，錯(cuò)義突變占71.88%（23/32），其中c.286G＞A和c.1000C＞T 最常見(jiàn)，與Feng等［12］總結(jié)的情況類似。本次檢出的41種ACADS基因變異型離散分布于2至10號(hào)外顯子，以錯(cuò)義突變?yōu)橹鳎?2.68%）。其中c.1031A＞G、c.1130C＞T 和c.164C＞T 的檢出頻率較高，分別為27.27%（30/110）、14.55%（16/110）、9.09%（10/110）。而Zhang等［13］報(bào)道中國(guó)北方人群ACADS基因最常見(jiàn)變異型為c.1031A＞G（33.33%）和c.164C＞T（33.33%），而c.1130C＞T 僅檢出2 次，提示ACADS基因變異存在一定地域特征，c.1130C＞T（p.P377L）可能是浙江地區(qū)人群特有的高頻變異。在新近報(bào)道的50個(gè)ACAD8基因變異的病例中，合并報(bào)道了20 種新的變異型［12，14］。本次再增添7種未曾報(bào)道的ACAD8基因變異型和17種未曾報(bào)道的ACADS基因變異型，說(shuō)明ACAD8和ACADS變異均具有高度異質(zhì)性，可以預(yù)見(jiàn)隨著高通量測(cè)序技術(shù)在遺傳代謝病篩查和診斷中的廣泛應(yīng)用，將會(huì)出現(xiàn)更多新的變異型。

眾所周知，在新生兒遺傳代謝病篩查體系中，通過(guò)初篩時(shí)特定生化指標(biāo)的差異來(lái)識(shí)別目標(biāo)疾病高危人群是其核心內(nèi)涵。那么初篩呈現(xiàn)C4增高的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值如何呢？Zhou等［2］報(bào)道經(jīng)常規(guī)串聯(lián)質(zhì)譜法篩查，1029 名新生兒呈現(xiàn)C4 增高，通過(guò)二級(jí)篩查，初篩陽(yáng)性兒降低至237名，但僅有17名獲得了遺傳學(xué)證據(jù)支持，說(shuō)明現(xiàn)有串聯(lián)質(zhì)譜法新生兒篩查體系中C4 增高兒的假陽(yáng)性問(wèn)題突出。本研究對(duì)不同基因變異組C4 增高倍數(shù)進(jìn)行比較分析結(jié)果顯示，ACAD8和ACADS雙等位基因變異群體的召回復(fù)測(cè)C4 水平整體高于初篩時(shí)期，但不同患者升高或降低均存在。Zhou等［2］基于17 例檢出基因變異的C4 增高患兒進(jìn)行分析，提示SCADD 患兒和IBDD 患兒間C4 水平?jīng)]有差異。而本文資料顯示ACAD8雙等位基因變異組的初篩和召回復(fù)測(cè)C4 水平均顯著高于ACADS雙等位基因變異組和ACADS單等位基因變異組；ACADS雙等位基因變異組的初篩和召回復(fù)測(cè)C4水平均顯著高于ACADS單等位基因變異組。這是否意味著獲得遺傳學(xué)證據(jù)支持的患兒與缺乏遺傳學(xué)證據(jù)支持患兒間的C4水平存在“分水嶺”呢？本文資料顯示，所有攜帶ACAD8雙等位基因變異或ACADS雙等位基因變異新生兒的初篩C4 增高倍數(shù)均大于1.50，而ACADS單等位基因變異僅有約25%（9/36）的初篩C4 增高倍數(shù)大于1.50，提示常規(guī)串聯(lián)質(zhì)譜法新生兒篩查呈現(xiàn)為單純的C4 增高時(shí)，其“篩查切值”可以適當(dāng)提升，以減少假陽(yáng)性病例。

綜上所述，靶向捕獲疾病基因聯(lián)合高通量測(cè)序能高效探查C4代謝異常兒的遺傳學(xué)背景，可推薦為串聯(lián)質(zhì)譜法篩查陽(yáng)性患兒臨床鑒別及分型診斷的首選方法。本文資料提示ACAD8和（或）ACADS基因變異是新生兒C4 增高的主要遺傳學(xué)原因，拓展了ACAD8、ACADS的基因變異譜。新生兒串聯(lián)質(zhì)譜法篩查呈現(xiàn)單純的C4增高時(shí)，其篩查切值建議適當(dāng)提升，但合適的切值有待后續(xù)研究。

本文附表見(jiàn)電子版。

志謝本研究得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2022YFC2703401）和浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021C03099）的資助

AcknowledgementsThis study was supported by the National Key R&D Program of China (2022YFC2703401),and Key R&D Program of Zhejiang Province (2021C03099)

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

Conflict of InterestsThe authors declare that there is no conflict of interests

?The author(s) 2023.This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)