浙江省1200萬例新生兒先天性甲狀腺功能減退癥、高苯丙氨酸血癥篩查結(jié)果分析

周朵，楊茹萊，黃新文，黃曉磊，楊 昕，毛華慶，楊建濱，趙正言

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院遺傳與代謝科 國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，浙江 杭州 310052

新生兒篩查是指在新生兒出生后采用快速、簡便、敏感的方法檢測體內(nèi)某些異常代謝產(chǎn)物，以期在患兒尚未出現(xiàn)臨床癥狀前早期診斷、早期治療，避免各系統(tǒng)出現(xiàn)不可逆性損害，進(jìn)而提高患兒的生活質(zhì)量。作為三級預(yù)防措施之一，新生兒篩查在降低出生缺陷率、提高出生人口素質(zhì)方面發(fā)揮著巨大的作用［1］。CH 和HPA 是導(dǎo)致兒童生長發(fā)育遲緩和智力障礙最常見的兩種遺傳代謝病。1999—2022 年，浙江省近1200 萬新生兒接受了CH 和HPA 篩查，本文回顧性分析篩查結(jié)果，旨在了解新生兒CH、HPA 的篩查率、發(fā)病率、基因變異等情況，為完善新生兒篩查工作提供參考。

1 對象與方法

1.1 資料來源

收集1999 年9 月至2022 年12 月浙江省新生兒疾病篩查中心對11 922 318 名新生兒進(jìn)行血TSH 及Phe檢測的資料。本研究通過浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院倫理委員會審查（2018-IRB-077），篩查前家長均簽署知情同意書。

1.2 采用熒光法檢測血TSH濃度篩查CH

按照《新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范》，新生兒出生滿72 h 且充分哺乳6 次后，由專業(yè)醫(yī)護(hù)人員采集足跟血滴于專用采血濾紙片上，陰干后送檢。根據(jù)試劑盒操作說明對干血斑進(jìn)行預(yù)處理，應(yīng)用熒光法檢測血TSH濃度，1999—2013年采用1420手動檢測儀，2014—2022 年4 月采用1235 半自動檢測儀，2022 年4 月后改為GSP 全自動檢測儀。血TSH在9 μIU/mL及以上的新生兒為CH篩查陽性，召回復(fù)查并完善甲狀腺功能檢測。復(fù)查結(jié)果顯示血TSH增加、FT4減少，則患兒診斷為CH。

1.3 采用熒光法或串聯(lián)質(zhì)譜法檢測血Phe 濃度篩查HPA

1999—2008 年采用熒光法檢測血Phe 濃度；2009 年起，如該新生兒遞送為四病篩查，仍采用熒光法檢測血Phe 濃度；如遞送為二十九病篩查，則采用串聯(lián)質(zhì)譜法檢測血Phe 濃度。血Phe濃度超過120 μmol/L和（或）血Phe 與Tyr 比值（Phe/Tyr）超過2.0為HPA篩查陽性，召回復(fù)查，結(jié)果仍異常者完善尿蝶呤譜、血二氫蝶啶還原酶活性及基因檢測。

1.4 高通量測序和MassARRAY 技術(shù)檢測基因變異

采用高通量測序和MassARRAY 技術(shù)對PAH、PTS、CH 相關(guān)基因的外顯子及側(cè)翼內(nèi)含子進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果與1000 Genomes、ESP6500數(shù)據(jù)庫、ExAC 數(shù)據(jù)庫和GnomAD 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。使用SIFT、Provean、PolyPhen-2、Mutation Taster、FATHMM 和Human Splicing Finder 等在線軟件進(jìn)行預(yù)測，分析可疑變異位點對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響以及是否會引起剪接改變。明確基因變異患兒的父母進(jìn)一步行桑格測序，以確定變異來源。

2 結(jié)果

2.1 浙江省24年來新生兒篩查率變化

1999 年9 月至2022 年12 月，浙江省共出生13 333 929 名活產(chǎn)新生兒，篩查11 922 318 名，總篩查率為89.41%。篩查率由1999 年的6.46%提升至2022 年的100.00%，2008 年后篩查率均高于97%，2014 年后篩查率均在99%以上，2018 年后接近100%，見表1。結(jié)果提示，浙江省篩查率逐年提高，近五年維持在近100%的高水平。

表1 1999—2022 年度浙江省新生兒先天性甲狀腺功能減退癥和高苯丙氨酸血癥篩查率統(tǒng)計Table 1 The screening rates of newborns for congenital hypothyroidism and hyper-phenylalaninemia in Zhejiang province during 1999 and 2022

2.2 浙江省24年來CH和HPA發(fā)病情況

浙江省1999—2022 年共確診CH 患兒8924例，總發(fā)病率約為1/1336（確診數(shù)/篩查數(shù)）。其中，暫時性CH 3203 例，占比35.9%；終身性CH 5721例，占比64.1%。浙江省各地市發(fā)病率1/1861～1/1002，其中衢州市的發(fā)病率最高（1/1002），嘉興市最低（1/1861）。1999—2022年的發(fā)病率波動在1/2330～1/748，其中2021 年發(fā)病率最高（1/748），1999 年發(fā)病率最低（1/2330）。見表2。結(jié)果提示，1999—2022年浙江省CH 發(fā)病率呈上升趨勢，其中衢州地區(qū)發(fā)病率相對較高。

1999—2022 年共確診HPA 患兒563 例，其中cPKU患兒508例，BH4D患兒55例，總發(fā)病率約為1/21 176。浙江省各地市發(fā)病率1/36 781～1/15 900，其中舟山市發(fā)病率最高（1/15 900），麗水市最低（1/36 781）。1999—2022年各年份HPA發(fā)病率波動在1/43 908～1/11 648，其中1999 年發(fā)病率最高（1/11 648），2006 年發(fā)病率最低（1/43 908）。見表3。結(jié)果提示，1999—2022 年浙江省HPA 患兒以cPKU多見。

2.3 浙江省CH和PHA患兒基因檢測結(jié)果

8924 例CH 患兒中97例（1.1%）進(jìn)行了基因檢測，其中純合變異6 例，復(fù)合雜合變異60 例，雜合變異30 例，半合子1 例。508 例cPKU 患兒中250例（49.2%）進(jìn)行了基因檢測，其中純合變異29例，復(fù)合雜合變異200 例，雜合變異21 例。55 例BH4D患兒中36例（65.5%）進(jìn)行了基因檢測，其中純合變異7例，復(fù)合雜合變異26例，雜合變異3例。

2.3.1 CH 患兒基因檢測結(jié)果 97 例CH 患兒檢出DUOX2基因變異67 例，TG基因變異12例，TPO基因變異10例，TSHR基因變異9例，DUOXA2基因變 異4 例，DUOX1基因變 異2 例，GLIS3、IGSF1和PAX8基因各1 例，其中10 例CH 患兒發(fā)生雙基因變異。DUOX2變異檢出率最高達(dá)69%，檢出44 種變異，其中c.3329G＞A（p.R1110Q）、c.1588A＞T（p.K530X）、c.2654G＞A（p.R885Q）和c.4027C＞T（p.L1343F）分別占18.2%、17.3%、6.4%和5.4%。TG檢出14種變異，檢出率為12.4%；TPO檢出12 種變異，檢出率為9.7%，其中c.2268dupT（p.E757X）是TPO基因最常見的變異，占39.0%；TSHR檢出12 種變異，檢出率為9.0%，其中c.1574T＞C（p.F525S）最常見，占20.0%；DUOXA2檢出3 種變異，c.738C＞G（p.Y246X）占50.0%。見附表1。結(jié)果提示，CH 患兒最常見的基因變異為DUOX2基因，多為錯義突變，熱點突變位點為c.3329G＞A（p.R1110Q）。

2.3.2 HPA患兒基因檢測結(jié)果 250例cPKU 患兒檢出81種PAH基因變異，包括47 種錯義突變（58.0%）、13 種無義突變（16.0%）、12 個剪接突變（14.8%）、4 種框移突變、2 種整碼突變、1 種復(fù)雜突變、1 種5'非翻譯區(qū)大片段缺失，1 個4～7 號外顯子缺失。各變異在PAH中分布不均，在外顯子中發(fā)現(xiàn)68個（84.0%）變異，其中外顯子7 中有15個（18.5%），外顯子12 中有9個（11.1%），外顯子11 和外顯子6 各有7個（8.6%）。PAH基因最常見變異為c728G＞A（p.R243Q）、c.721C＞T（p.R241C）、c.611A＞G（p.Y204C）、c.442-1G＞A、c.331C＞T（p.R111*）和c.1068C＞A（p.Y356*）分別占24.4%、15.0%、8.1%、5.6%、5.0%和4.4%，外顯子7為PAH基因變異的熱點區(qū)域。發(fā)現(xiàn)7種PAH基因新發(fā)變異，分 別為：c.107C＞A（p.S36*）、c.137G＞T（p.G46V）、c.148A＞G（p.K50E）、c.285C＞T（p.I95I）、c.843-10delTTCC、exon4-7del和c.1066-2A＞G。

36 例BH4D 患者中檢出12種PTS基因變異，包括8種錯義突變、3種剪接突變。PTS基因最常見變異為c.259C＞T（p.P87S），占31.9%；其次為c.84-291A＞G、c.155A＞G（p.N52S），分別占14.5%、10.1%，見附表2。

以上結(jié)果提示，浙江省PAH 基因變異多為錯義突變，熱點突變位點為c728G＞A（p.R243Q），檢出7種PAH基因新發(fā)變異；PTS基因熱點突變位點為c.259C＞T（p.P87S）。

3 討論

浙江省新生兒篩查工作自1998年開展以來，篩查質(zhì)量不斷提高［2］，篩查率逐年升高，2014 年后已達(dá)99%以上，高于全國同期水平［3］，這與建立了覆蓋全省的“健康宣傳-采血-遞送-檢驗-確診-治療-隨訪”為一體的“相對集中篩查、分級管理”的篩查體系及政府實行免費篩查政策相關(guān)［4］。

CH 是因先天因素使甲狀腺發(fā)育異常引起甲狀腺激素分泌不足或合成障礙，導(dǎo)致生長發(fā)育遲緩和智力障礙等后果的一種疾病，是兒童最常見的內(nèi)分泌疾病之一，全球范圍發(fā)病率為1/4000～1/1400，近年來其發(fā)病率呈快速上升趨勢［5-6］。本文資料顯示，1999—2022 年浙江省新生兒篩查共確診8924 例CH 患兒，總發(fā)病率為1/1336，高于全國發(fā)病率。研究報道CH 發(fā)病率增高潛在的原因可能與人口統(tǒng)計學(xué)的變化、TSH 召回值降低（每降低1 mIU/L，CH 發(fā)病率增加2.96%）、早產(chǎn)兒存活率增加、篩查覆蓋率增高和母親甲狀腺功能、年齡、孕期有機(jī)氯暴露有關(guān)［7-9］。浙江省新生兒篩查CH 發(fā)病率較高可能與以下原因相關(guān)：①浙江省積極推進(jìn)樣本信息化物流質(zhì)控項目，采用專用醫(yī)療冷鏈將標(biāo)本從采血機(jī)構(gòu)直接送至省篩查中心實驗室，安全、快速并最大程度保證了標(biāo)本質(zhì)量；②檢測方法不斷改進(jìn)，具有更高的靈敏度，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性；③本篩查中心采用的篩查召回標(biāo)準(zhǔn)為TSH在9 μIU/mL及以上，根據(jù)Ford 和LaFranchi［10］的研究 結(jié)果，TSH 篩查值 從20～25 μIU/mL 降低到6～10 μIU/mL 時，CH 發(fā)病率增加2.20 倍，因此TSH 篩查值降低可能使得CH 的診斷增加；④社會以及家長越來越重視新生兒篩查，從而使召回率提高，增加了確診率。本文資料還顯示，在浙江省的10 個地市中，山區(qū)衢州、麗水地區(qū)CH 發(fā)病率相對較高，而山區(qū)地理環(huán)境下人群碘的攝入量較其他沿海地區(qū)低，因此CH發(fā)病可能與人群碘缺乏也相關(guān)。

HPA 是由于PAH 或其輔酶四氫生物蝶呤缺乏致使機(jī)體內(nèi)Phe 累積，引起以神經(jīng)系統(tǒng)損害癥狀為主要特征的一組氨基酸代謝異常疾病。浙江省近24 年共確診HPA 患兒563 例，其中cPKU 508 例，BH4D 55 例，絕大部分為cPKU，平均發(fā)病率為1/21 176，略低于以往報道的全國發(fā)病率1/11 628，高于湖南（1/45 454）、廣西（1/83 333）、廣東（1/50 000）等南方地區(qū)，該病在中國發(fā)病率呈現(xiàn)南低北高趨勢［11］。另外，各國發(fā)病率存在差異，歐洲約為1/100 000，土耳其約為1/4000，日本約為1/78 400［12］，可能與基因多態(tài)性、種族及地域不同相關(guān)［13］。

既往研究在CH 患者中發(fā)現(xiàn)20 余種基因變異［14］，其中甲狀腺發(fā)育不良與TSHR、FOXE1、PAX8、NKX2-1、NKX2-5和GLIS3基因變異相關(guān)，甲狀腺素合成障礙與DUOX2、TPO、TG、SLC5A5、SLC26A4和IYD基因變異相關(guān)［15］。本文資料97 例CH患兒進(jìn)行基因檢測，共檢出9種基因發(fā)生變異，分別為DUOX2、TG、TPO、TSHR、DUOXA2、DUOX1、GLIS3、IGSF1和PAX8，其中DUOX2基因變異檢出率高達(dá)69.0%，提示DUOX2基因變異是本地區(qū)CH 患者中最常見的變異類型，與相關(guān)文獻(xiàn)提示DUOX2是東亞人群中發(fā)現(xiàn)變異頻率最高的基因結(jié)果一致［16-17］。DUOX2是甲狀腺過氧化氫產(chǎn)生系統(tǒng)的主要成分，涉及甲狀腺激素合成障礙的重要環(huán)節(jié)，大多數(shù)DUOX2致病性變異會導(dǎo)致甲狀腺激素生成障礙，而甲狀腺激素合成障礙也是中國人群CH 的主要原因。本文資料DUOX2檢出44 種變異，以錯義突變?yōu)橹鳎渲衏.3329G＞A（p.R1110Q）檢出率最高為16.4%，其次為c.1588A＞T（p.K530X）、c.2654G＞A（p.R885Q）和c.4027C＞T（p.L1343F），與相關(guān)文獻(xiàn)報道的我國人群DUOX2熱點突變相符［18-19］。本文資料中，檢出頻率較高的還有TG基因變異（12.4%）和TPO基因變異（9.7%）。TG基因變異導(dǎo)致非活性甲狀腺激素、碘化物儲存減少及甲狀腺素合成障礙，目前已發(fā)現(xiàn)200 余種TG基因變異，本文資料檢出TG基因變異13 種，突變頻率相對較高的變異為c.1348delT（p.S450Pfs*29）、c.3808C＞T（p.R1270C）。我國西北地區(qū)TG基因熱點突變?yōu)閏.3035C＞T（p.P1012L）［20］，本文資料無該變異位點，推測TG基因變異可能存在地域差異。TPO缺乏導(dǎo)致碘有機(jī)化缺陷引起嚴(yán)重的激素合成障礙，從而導(dǎo)致CH的發(fā)生。目前報道TPO基因變異170 余種，在高加索人種中TPO變異檢測率為20%～46%，而在東亞人種中TPO變異檢測率不到10%［21］。本文資料發(fā)現(xiàn)TPO基因變異11種，c.2268dupT（p.E757X）是TPO基因最常見的變異，占26.6%，與相關(guān)文獻(xiàn)報道的東亞人群的TPO基因熱點突變相符［22-23］。本文資料多例CH 患者存在雙基因變異或多位點同時變異的形式，最常見的變異基因組合是DUOX2聯(lián)合TG或TSHR，表明CH 屬于多基因疾病，遺傳背景復(fù)雜，環(huán)境因素如碘攝入、營養(yǎng)或其他表觀遺傳因素可能通過影響基因表達(dá)導(dǎo)致CH 發(fā)生，但各變異體以何種機(jī)制參與CH 的致病過程還需要進(jìn)一步的功能實驗來證實。

HPA 致病基因分別是PAH 和BH4 合成代謝中的相關(guān)基因。目前已報道PAH基因1000 余種變異，本文資料250例cPKU患者中檢出81種PAH基因變異，變異種類以錯義突變?yōu)橹?，少?shù)為無義突變、剪接突變，84.0%變異位于外顯子，與PAH基因數(shù)據(jù)庫記錄相似（PAHvdb，http：//www.biopku.org/home/pah.asp）。既往研究表明，PAH基因突變譜存在種族和地域差異，歐洲最常見的變異為c.1222C＞T（p.R408W），意大利南部最常見的變異為c.782G＞A（p.R261Q），而在西班牙人群中最常見的變異是c.194T＞C（p.I65T）。在中國人群中，臺灣地區(qū)最常見的變異為c.721C＞T p.R241C（36.0%）；cPKU患者中最常見的變異為c728G＞A（p.R243Q）（17.5%）［24-27］。本文資料顯示，PAH基因最常見變異為c728G＞A（p.R243Q）、c.721C＞T（p.R241C）、c.611A＞G（p.Y204C）、c.442-1G＞A、c.331C＞T（p.R111*）和c.1068C＞A（p.Y356*），分別占24.4%、15.0%、8.1%、5.6%、5.0%和4.4%。本文資料7種PAH基因新發(fā)變異分別為c.107C＞A（p.S36*）、c.137G＞T（p.G46V）、c.148A＞G（p.K50E）、c.285C＞T（p.I95I）、c.843-10delTTCC、exon4-7del 和c.1066-2A＞G，擴(kuò)展了PAH基因譜。PTS是與四氫生物蝶呤合成代謝最常見的基因。中國人群PTS基因常見的變異位點有c.155A＞G（p.N52S）、c.259C＞T（p.P87S）、c.286G＞A（p.D96N）、c.272A＞G（p.K91R）、c.84-291A＞G/p.Y27Rfs*17、c.317C＞T（p.T1be06M）、c.166G＞A（p.V56M），其中中國南方患者常見的變異為c.155A＞G（p.N52S），北方患者常見的變異為c.286G＞A（p.D96N），c.259C＞T（p.P87S）和c.84-291A＞G 在南北方均可見［28-30］。本文資料以上常見變異均有檢出，共檢出PTS基因變異12種，其中熱點突變位點為c.259C＞T（p.P87S），其次為c.84-291A＞G、c.155A＞G（p.N52S）。

綜上所述，浙江省新生兒篩查開展20余年以來，共計篩查約1200 萬新生兒，隨著政府政策主導(dǎo)、各部門及全社會參與，篩查體系覆蓋全省，篩查率逐年提高。浙江省CH 發(fā)病率呈增高趨勢，與浙江省積極推進(jìn)樣本信息化物流質(zhì)控項目、TSH檢測方法不斷改進(jìn)提高了篩查準(zhǔn)確性及靈敏度以及社會和家長越來越重視新生兒篩查相關(guān)。HPA 發(fā)病率與全國平均水平相當(dāng)，略高于南方其他地區(qū)發(fā)病率。CH、HPA患兒基因檢測呈現(xiàn)了浙江省CH 基因譜和PAH、PTS基因分布特點等信息，可為進(jìn)一步完善新生兒篩查提供參考。

本文附表見電子版。

志謝研究得到國家重點研發(fā)計劃（2022YFC2703401）支持

AcknowledgementsThis work was supported by the National Key R&D Program of China (2022YFC2703401)

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

Conflict of InterestsThe authors declare that there is no conflict of interests

?The author(s) 2023.This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)