碰撞/反應(yīng)池電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法測定血液中16種元素

于宏洋 王 萌 汪 冰 王 娟 李孟楠 胡 克*

(1.北京萊伯泰科儀器股份有限公司,北京 101312;2.中國科學(xué)院高能物理研究所,北京 100049)

金屬組學(xué)的研究對象是生命體系中所有的金屬元素[1]。常用的血液中元素分析儀器分別是電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)[2]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP-AES)[3]、原子吸收光譜儀(AAS)[4]和原子熒光光譜儀(AFS)[5]等。其中,使用ICP-MS的分析技術(shù)目前應(yīng)用最廣泛,由于其具有靈敏度高、檢出限低、動態(tài)線性范圍寬、分析速度快、檢測精度高等優(yōu)點,同時又避免了光譜分析手段易受干擾的缺點?，F(xiàn)階段,ICP-MS的分析性能已經(jīng)在食品[6]、環(huán)境[7]、刑偵[8]、地質(zhì)[9]、醫(yī)療[10]、半導(dǎo)體[11]等領(lǐng)域得到充分驗證。

測量血液中元素含量是評估人體健康狀況的一個重要指標(biāo),很多元素參與人體多種生理機(jī)能和代謝[12]。本文測量血液中的16種元素(V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ge、As、Se、Cd、Hg、Tl、Pb、Bi)中,V、Cr、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Se是人體中的微量元素,剩余8種元素則屬于有毒有害元素。

對血液樣品進(jìn)行前處理是ICP-MS分析微量元素的重要步驟之一。血液樣品中存在大量的有機(jī)物和無機(jī)鹽等干擾物質(zhì),這些干擾物質(zhì)可能會影響到微量元素的分析結(jié)果[13]。因此,通常需要將血液樣品進(jìn)行消解[14-15]或稀釋[16-17]等前處理步驟,以去除干擾物質(zhì),減少樣品的復(fù)雜性,提高分析的準(zhǔn)確性和精度。消解手段雖可去除有機(jī)物的干擾,但由于消解手段的不同,潛在問題有元素?fù)]發(fā)損失、外源污染以及分次消解條件不同造成平行樣品數(shù)量多等。稀釋法一般采用硝酸溶液和曲拉通(Triton X-100)的混合溶液將樣本血液稀釋20～40倍后測試,雖容易產(chǎn)生較大的基體效應(yīng)[18],但引入的試劑空白較少,簡單易操作,儀器運(yùn)行成本低,同時引入的基體效應(yīng)可以通過優(yōu)化儀器條件減少對檢測結(jié)果的影響,故稀釋法受到了更多醫(yī)院與第三方檢測機(jī)構(gòu)的青睞[17]。

ICP-MS法在檢測過程中受到樣品引入方法以及機(jī)械結(jié)構(gòu)的限制,離子化的樣品會生成多原子離子,而一些多原子離子例如40Ar16O、40Ar40Ar等,由于會與諸如56Fe與80Se等被測核素有相近質(zhì)核比,使質(zhì)譜檢測結(jié)果受到干擾,分析準(zhǔn)確度受到很大影響[19]。碰撞反應(yīng)池(Collision/Reaction Cell)技術(shù)是ICP-MS技術(shù)中的重要組成部分,單四極桿質(zhì)譜中,從離子束路徑來說,碰撞反應(yīng)池的位置在四極桿之前,它通過引入反應(yīng)氣體和碰撞氣體來控制和調(diào)節(jié)離子之間的相互作用,以減少或消除干擾效應(yīng),使ICP-MS法在分析樣品時可以耐受更復(fù)雜干擾基質(zhì)并且提高元素分析的靈敏度和準(zhǔn)確性[20]。

首先通過分析16種元素ICP-MS法的靈敏度與檢出限,以及對比氦氣、氫氣作為碰撞氣時ICP-MS法消除干擾的能力,建立一種用于血液金屬組學(xué)樣本元素的快速定量測定方法。

1 實驗部分

1.1 儀器設(shè)備與試劑

LabMS 3000四極桿質(zhì)譜儀(北京萊伯泰科儀器股份有限公司)。質(zhì)譜調(diào)諧液使用Be、Co、In、Ba、Ce、Pb、U元素的單標(biāo)溶液(壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司,下同)配制,使用2% HNO3稀釋至1.0 μg/L。通入碰撞氣后的儀器調(diào)諧與性能對比使用V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ge、As、Se、Cd、Hg、Tl、Pb、Bi共16種元素的單標(biāo)溶液配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,并以2% HNO3逐級稀釋配制濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。在線內(nèi)標(biāo)溶液使用Rh,以2% HNO3稀釋至10.0 μg/L。全血檢測使用上述16種元素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以含有0.1% HNO3與0.1% Triton X-100(Thermo Fisher Scientific)的稀釋液逐級稀釋配制濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、500.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液?？紤]到血液中Zn、Cu和Fe三種元素含量較高,對其額外配制1.0、10.0、100.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。全血樣本取自CD-1實驗小鼠(n=3,編號:Z143986、Z169538、Z750342,北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司),用含有0.1% HNO3與0.1% Triton的稀釋液稀釋40倍。微量元素標(biāo)準(zhǔn)全血粉末(Seronorm,LOT:2011934),按照說明書溶解并用含有0.1% HNO3與0.1% Triton的稀釋液稀釋40倍。實驗用水均為超純水(制水儀Milli-Q IQ7000),HNO3為上海傲班科技有限公司生產(chǎn)(ICPMS PURE),實驗中使用的碰撞氦氣由北京順安奇特氣體有限公司生產(chǎn),純度99.999%;碰撞氫氣由氫氣發(fā)生器產(chǎn)生(ERRE Due,Mars 250DC),產(chǎn)氣純度99.9999%。

1.2 ICP-MS儀器條件

考慮到分析的樣品與元素,會有35Cl16O+、43Ca16O+、40Ar16O+、23Na40Ar+、40Ar40Ar+等多原子離子產(chǎn)生的質(zhì)譜干擾,使用碰撞反應(yīng)池以消除多原子離子干擾,提高檢測靈敏度與準(zhǔn)確性。同時為了對比氫氣和氦氣對于質(zhì)譜儀性能的影響,將ICP-MS儀同時接上氫氣和氦氣,使用儀器軟件自動控制氣路切換。

在碰撞模式中,通過調(diào)節(jié)碰撞氣流速,使純水中80Se的響應(yīng)值低于1 000 cps,隨后通入調(diào)諧液,調(diào)整碰撞反應(yīng)池的出口電壓、六極桿偏壓以及聚焦透鏡電壓使質(zhì)譜調(diào)諧液中的各元素響應(yīng)值盡可能高。

儀器的主要參數(shù)以及通入碰撞反應(yīng)池的氦氣與氫氣流量記錄于表1中。

表1 儀器主要參數(shù)

1.3 質(zhì)量數(shù)選擇

測定元素質(zhì)量數(shù)的選擇,以該元素的最大豐度對應(yīng)的質(zhì)量數(shù)為原則,同時盡可能避免多原子離子和同量異位素造成質(zhì)譜干擾。選定元素的同位素為51V、52Cr、55Mn、56Fe、59Co、60Ni、63Cu、66Zn、72Ge、75As、80Se、114Cd、202Hg、205Tl、208Pb、209Bi。

1.4 靈敏度與檢出限計算

儀器靈敏度通過測定前述16種元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液后,將儀器響應(yīng)值及其對應(yīng)的溶液濃度計算線性回歸方程,其中線性回歸方程的斜率代表儀器靈敏度L。

測試11次試劑空白,計算儀器響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差S,并按以下公式計算檢出限(Limit of detection,DL,ng/L)。

(1)

2 結(jié)果與討論

2.1 通入碰撞氣前后儀器性能對比

首先將儀器點火,按照儀器優(yōu)化調(diào)諧方法將儀器狀態(tài)調(diào)整至最優(yōu)。檢測通入碰撞氣前(標(biāo)準(zhǔn)模式)的14種元素的響應(yīng)值并按照公式(1)計算檢出限,其中56Fe與80Se由于多原子離子干擾未進(jìn)行檢測,檢出限(Limit of detection,DL)、線性回歸方程(Linear regression equation,LRE)及其相關(guān)系數(shù)(Linear correlation coefficient,LCC)結(jié)果見表2。接著通過檢測調(diào)諧液中Ce、CeO、Ba和Ba++的響應(yīng)值,計算得到氧化物離子產(chǎn)率與雙電荷離子產(chǎn)率分別為2.80%和2.64%,兩項數(shù)值均滿足《四極桿電感耦合等離子體質(zhì)譜儀校準(zhǔn)規(guī)范》(JJF 1159—2006)對兩者的指標(biāo)小于3.0 %的要求。

表2 標(biāo)準(zhǔn)模式下14種元素的靈敏度與檢出限

接著將儀器切換至氦氣碰撞模式,調(diào)整氦氣流速使空白中的80Se背景響應(yīng)值小于1 000 cps,按前述方法檢測并計算包括56Fe和80Se在內(nèi)的16種元素的靈敏度和檢出限,記錄于表3,計算出氧化物離子產(chǎn)率與雙電荷離子產(chǎn)率分別為2.20%和2.75%。

表3 氦氣模式下16種元素的靈敏度與檢出限

最后將儀器切換至氫氣碰撞模式,按前述方法經(jīng)過調(diào)諧后并分析計算檢出限(Limit of detection,DL)、定量限(Limit of quantitation,QL)、線性回歸方程(Linear regression equation,LRE)及其相關(guān)系數(shù)(Linear correlation coefficient,LCC)記錄于表4,三種模式下的氧化物離子產(chǎn)率與雙電荷離子產(chǎn)率匯總記錄于表5。

表4 氫氣模式下16種元素的靈敏度、檢出限和定量限

表5 三種模式下氧化物離子產(chǎn)率與雙電荷離子產(chǎn)率

根據(jù)表2、3、4中的靈敏度數(shù)據(jù),計算除56Fe和80Se外的各元素標(biāo)準(zhǔn)模式/碰撞模式靈敏度比值,結(jié)果繪制于圖1中,結(jié)果表明氦氣作為碰撞氣的加入對各元素的靈敏度影響很大,最高會損失98.21%(51V),這是由于在調(diào)諧過程中,為了保證80Se的背景小于1 000而損失較多靈敏度,而氫氣作為碰撞反應(yīng)氣時對靈敏度的損失則相對較小,最多損失74.03%(63Cu),同時氫氣對某些同位素(66Zn、111Cd、202Hg、205Tl、208Pb和209Bi)的靈敏度有提升效果,說明在碰撞反應(yīng)池中的選擇性和準(zhǔn)確性更高。

圖1 氦氣碰撞模式與氫氣碰撞模式的靈敏度比值Figure 1 Sensitivity ratio of helium collision mode to hydrogen collision mode.

三種模式下14種元素的檢出限比值結(jié)果繪制于圖2中,結(jié)果表明即使有部分靈敏度損失,但是由于氦氣或氫氣的加入,均可以降低測試的14種元素的檢出限,對于低濃度樣品有更準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。

圖2 氦氣碰撞模式與氫氣碰撞模式的檢出限比值Figure 2 Detection limit ratio of helium collision mode to hydrogen collision mode.

對于56Fe和80Se兩種元素來說,在氫氣模式的靈敏度比氦氣模式分別高22和216倍,而檢出限卻分別是氦氣模式的8.0%和24.5%。這是由于使用氦氣和氫氣時對干擾元素進(jìn)行消除的機(jī)理不同造成的。氦氣模式中,由于氦氣自身穩(wěn)定不能參與反應(yīng),對Ar等干擾元素的消除主要原理是碰撞發(fā)生能量轉(zhuǎn)移,具有更大尺寸的多原子離子在碰撞時發(fā)生更大的能量轉(zhuǎn)移,被去除的更徹底。離子束由于碰撞氣的引入而發(fā)生碰撞聚焦效應(yīng)[21],此時離子束通過一系列的碰撞行為損失徑向和軸向能量,而徑向能量的損失使離子在碰撞池中的運(yùn)動更趨于電場中心,繼而使碰撞池出口處的離子通過效率增加。隨著碰撞氣流速的增加,多原子離子逐漸下降,而當(dāng)流速超過最佳水平時,碰撞反應(yīng)池內(nèi)的離子束會因與碰撞氣的碰撞概率增加發(fā)生散射。儀器調(diào)諧的過程中不難發(fā)現(xiàn),擁有更大質(zhì)荷比的元素靈敏度的最大值對應(yīng)的最佳碰撞反應(yīng)氣流速更大[22],這是由于較大質(zhì)荷比的元素?fù)碛懈蟮膭幽?需要更高的碰撞反應(yīng)氣流速。

氫氣模式中,氫氣可以通過反應(yīng)選擇性地去除Ar和其他等離子體基質(zhì)離子[23],此時碰撞反應(yīng)池內(nèi)的Ar不僅會因為動能損失而減少,還可能有以下三種反應(yīng)干擾消除的機(jī)制:

Ar++H2→ArH++H

(2)

ArH++H2→H3++Ar

(3)

Ar++H2→H2++Ar

(4)

以上三種機(jī)制包含氫原子轉(zhuǎn)移[公式(2)]、質(zhì)子轉(zhuǎn)移[公式(3)]和電荷轉(zhuǎn)移[公式(4)][24-25],這使干擾元素改變了質(zhì)核比,可以在四極桿質(zhì)量篩選器中輕松去除,增加信噪比。同時,與較重的氦氣相比,使用氫氣造成的分析物能量損失較低,從而具有更高靈敏度和更低的檢出限通過對比氦氣與氫氣作為碰撞氣的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),相同儀器狀態(tài)下,以氫氣作為碰撞氣時儀器的檢測準(zhǔn)確性、檢出限以及靈敏度均優(yōu)于氦氣,后續(xù)將使用氫氣作為碰撞反應(yīng)氣分析全血樣本。

2.2 血液標(biāo)準(zhǔn)品和小鼠血液中16種元素的分析

使用三通引入在線內(nèi)標(biāo)溶液,以由0.1% HNO3和0.1% Triton X100稀釋配制的16種元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為外標(biāo),分析血液標(biāo)準(zhǔn)品樣品(n=3),標(biāo)準(zhǔn)品的認(rèn)證值、認(rèn)證區(qū)間、測量值以及精密度結(jié)果列于表6中。同時將稀釋后的小鼠血液樣本分成兩份,其中一份加入標(biāo)準(zhǔn)溶液分析計算加標(biāo)回收率,結(jié)果列于表7中。

表6 Seronorm標(biāo)準(zhǔn)品的認(rèn)證值、認(rèn)證區(qū)間、測量值和儀器精密度

表7 Z143986、Z169538和Z750342血液樣本分析結(jié)果

結(jié)果表明,對Seronorm 全血標(biāo)準(zhǔn)品中16種元素的分析準(zhǔn)確度為86.0%～114%,儀器精密度為2.3%～4.8%。對小鼠血液樣本中16種元素的加標(biāo)回收率為81.2%～120%,符合血液樣本的分析要求。

3 結(jié)論

本文討論了氦氣與氫氣分別作為碰撞反應(yīng)氣時對ICP-MS性能影響的碰撞反應(yīng)池機(jī)理,并提出一種使用氫氣作為碰撞反應(yīng)氣,分析血液中16種元素(V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ge、As、Se、Cd、Hg、Tl、Pb、Bi)的測試方法,該方法顯著降低了干擾元素(40Ar16O+、40Ar40Ar+)在m/z=56和80的背景信號,同時該方法對比使用氦氣時具有靈敏度高、檢出限低的優(yōu)點。使用該方法16種元素在0.5～100.0 μg/L線性關(guān)系良好(R2≥0.99991),全血標(biāo)準(zhǔn)品中分析準(zhǔn)確度86.0%～114%,小鼠血液樣本的加標(biāo)回收率81.2%～115%,儀器精密度2.3%～4.8%,為血液金屬組學(xué)分析提供了新方法。