細菌介導重金屬轉化過程及金屬組學研究方法

唐寅寅 劉麗紅 何 濱,3 胡立剛,3*

(1.中國科學院 生態(tài)環(huán)境研究中心,環(huán)境化學與生態(tài)毒理學國家重點實驗室,北京 100085;2.中國科學院大學,北京 100049;3.國科大杭州高等研究院 環(huán)境學院,杭州 310024)

重金屬被定義為相對原子質量在63.5～200.6,比重大于5.0的金屬以及類金屬元素[1],常見重金屬有鋅(Zn)、銅(Cu)、鐵(Fe)、錳(Mn)、砷(As)、鎘(Cd)、鉛(Pb)、汞(Hg)、鉻(Cr)[2-5]。由于重金屬在環(huán)境中具有頑固性、持久性、易傳遞和難以生物降解等特點,導致其在環(huán)境中累積,污染食物鏈,影響環(huán)境的健康秩序和人類生產生活,并不斷對生物生存和人類文明發(fā)展造成威脅[6]。如硬巖開采造成的重金屬污染在采礦作業(yè)停止后仍會持續(xù)數百年,重金屬污染的危害程度可見一斑,因此重金屬污染在世界范圍內受到特別且廣泛的關注。同時隨著工業(yè)化、城市化進程加快,環(huán)境中重金屬排放量也持續(xù)增加,重金屬污染在當下已是全球最嚴峻的環(huán)境問題之一。

1 重金屬污染及危害

1.1 重金屬污染來源

普遍認為環(huán)境中重金屬的來源包括自然來源和人為來源兩類。自然來源主要包括火山噴發(fā)、礦物風化、森林火災,人為來源作為重金屬污染的更重要來源主要包括燃煤發(fā)電、供熱、采礦和其他冶金活動[7]。此外,工業(yè)化加劇了人為因素的影響,包括不合理的農藥和化肥使用、未經處理的工業(yè)排放和汽車尾氣排放[8-10]。針對人為來源中的具體因素,目前有研究利用正定矩陣因子分解模型(PMF)和Unmix模型共同識別了地質、交通、農業(yè)和工業(yè)來源。根據模型得到的結果可知,Ni和Cr主要來源于工業(yè)排放,Cd和Pb主要來自交通排放,As主要來自地質開采,Hg主要來源于工農業(yè)發(fā)展的影響。來源解析結果表明,金屬、化工、煤炭、機械和紡織工業(yè)等對Ni、Cr、Zn和Cd等金屬含量有顯著的負向影響,應成為控制和緩解措施的重點[11]。

1.2 重金屬污染的危害

重金屬濃度過高會導致植物和作物生長不良,動物群落數量減少[12],重金屬還可以通過食物攝入對人類健康構成威脅,導致呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等功能的紊亂[13]。例如,重金屬鉛會損害腎臟和消化系統(tǒng),擾亂腎小管重吸收或使胃腸功能紊亂,甚至引起腎炎、腎病綜合征和消化系統(tǒng)疾病[14]。同時,鉛可通過抑制血紅蛋白的形成而誘發(fā)貧血。已有研究報道,重金屬汞無論是短期接觸還是長期接觸都會顯著影響人的認知、感覺和運動功能,尤其會對新生兒發(fā)育中的神經系統(tǒng)產生極大影響[15]。一項對900名法羅群島兒童(其父母主要通過鯨肉接觸甲基汞)的研究表明,父母產前接觸甲基汞會導致兒童7歲時的神經心理缺陷[16-17]。另外,在長期慢性暴露砷的地區(qū),皮膚癌、肺癌和膀胱癌的風險也有所增加[18]。

2 細菌介導的重金屬轉化機制

目前已有多種環(huán)境中重金屬污染的處理方法,比如物理修復法(包括工程措施、電動修復、熱解吸、超聲波加熱等)、化學修復法(包括化學浸出法、氧化還原法等)和一些生物修復法等[19-20]。其中傳統(tǒng)的物理和化學修復法存在一些缺點,如能耗較大、成本高、易形成二次污染等[21]。生物修復法中的微生物處理具有明顯優(yōu)勢:1)處理能力強,可通過吸附、活化以及轉化等多種方式降低環(huán)境中的重金屬濃度;2)適應能力強,可迅速適應環(huán)境,應用領域廣泛;3)收益成本高,易管理,不易造成二次污染[22-24];4)細菌種屬多、分布廣,是微生物中的最大群體;5)各種細菌具有獨特的潛力,可以采取不同的代謝策略及建立不同程度的耐受性和抗性機制來適應被污染環(huán)境中的金屬威脅[25-26]。因此,細菌轉化相對于其他方式,具有實施方便、資源豐富、環(huán)保經濟等優(yōu)點,同時具有原位轉化的潛力,已成為環(huán)境重金屬污染轉化領域中新技術探索的熱點之一[27-28]。以下是細菌在重金屬轉化中的常見途徑。

2.1 生物吸附

細菌可產生生物膜為一些重金屬離子提供緩沖的環(huán)境,降低重金屬對細菌本身的侵害作用,還可以利用多種碳源合成并向胞外釋放有助于隔離污染物的胞外聚合物質(EPS)[29]。EPS最初被描述為“胞外多糖”,包含多種成分,如蛋白質、核酸、脂質和腐殖質等[30-31],EPS對金屬的吸附可能與細胞表面性質及其官能團(如羧基、羥基、磷基)有關,這些官能團可以與重金屬發(fā)生反應從而達到去除重金屬的目的[32]。有研究稱細菌生物膜表面分泌的胞外聚合物中攜帶大量負電荷,可吸附重金屬離子[33]。目前,關于細菌產生的胞外聚合物對于重金屬的吸附作用已經被廣泛地研究與應用[34-35]。如有研究表明,金黃色葡萄球菌和假單胞菌主要利用生物吸附來改善鎘污染,它們的吸附率分別可達25%和27.8%[36]。有研究將EPS從副土地桿菌Parapedobactersp. ISTM3中提取出來,研究EPS對重金屬混合物的生物吸附,發(fā)現在酸性條件下,EPS對Cr(Ⅵ)具有極強的吸附能力[37]。同時有研究發(fā)現,枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis和惡臭假單胞菌Pseudomonasputida在去掉EPS后,細菌對重金屬鎘的吸附能力下降[38]。另一方面,已有研究發(fā)現細菌的細胞膜和細胞壁是細菌進行重金屬吸附的重要場所,細菌細胞壁中的重要成分幾丁質和殼聚糖對重金屬離子有吸附能力,可以將重金屬離子絡合或螯合在細菌表面導致金屬濃度降低[39]。渾濁紅球菌與銅綠假單胞菌被發(fā)現均可以通過細胞壁的吸附作用進行重金屬鉛的固定[40-41]。除以上兩種吸附方法以外,細菌還可以通過體內外的陽離子與環(huán)境中的重金屬離子發(fā)生交換來達到固定重金屬的目的,蠟樣芽孢桿菌在含鎘環(huán)境中被發(fā)現在細菌表面與Ca(Ⅱ)發(fā)生了離子交換,從而降低了環(huán)境中鎘的濃度[42]。

2.2 生物轉化

生物轉化主要是通過氧化還原反應和甲基化、去甲基化反應將金屬離子轉化,以降低其生物毒性。如兼性厭氧菌佐呂間湖生芽孢八疊球菌SporosarcinasaromensisW5菌株已被證明可以將Cr(Ⅵ)還原為Cr(Ⅲ)。好氧條件下,Cr(Ⅵ)還原主要發(fā)生在細胞質中,最終產物為可溶性有機Cr(Ⅲ)配合物。厭氧條件下,Cr(Ⅵ)還原主要發(fā)生在細胞質中,還原產物為可溶性有機Cr(Ⅲ)配合物和Cr(Ⅲ)沉淀物[43]。同時有研究發(fā)現,細胞表面的羥基、羧基和酰胺基等官能團可以將Cr(Ⅵ)轉化為Cr(Ⅲ)(主要是CrCl3)[44]。大腸桿菌EscherichiacoliATCC 33456,在好氧和厭氧條件下也均具有還原Cr(Ⅵ)的能力[45]。另一種被廣泛研究的生物轉化方式為汞的甲基化與去甲基化,在自然環(huán)境中,汞通常以無機汞(零價汞、一價汞、二價汞)和有機汞[CH3Hg+、(CH3)2Hg]的形式存在。而有機汞的毒性大于無機汞的毒性,尤其是甲基汞具有高神經毒性和高生物蓄積性,許多具有mer操縱子的細菌被證明具有將甲基汞還原為汞的能力,對細菌的二價汞結合、轉運、還原、解毒起到精確的調控作用[46]。

2.3 胞外沉淀

2.4 胞內累積

微生物可以將重金屬離子通過自身存在的特定通道運送到細胞內,并在細胞內與蛋白結合形成不活躍的金屬結合蛋白,降低金屬離子活性的同時減少金屬的毒性。例如,金屬硫蛋白(MTs)是一種低分子量、富含半胱氨酸的重金屬結合蛋白,由于半胱氨酸可與金屬離子發(fā)生絡合反應,從而將重金屬沉淀于體內。因此金屬硫蛋白被認為參與了重金屬解毒、儲存、氧化損傷等生物學過程并發(fā)揮重要作用[53-54]。已有研究進一步發(fā)現,MTs基因的轉錄實際上是重金屬通過金屬反應元件誘導的,MTs基因暴露于金屬離子后的過表達是細菌抵抗重金屬毒性的原因[55]。

3 重金屬轉化過程的分析流程

細菌介導重金屬轉化過程的研究主要涉及細菌分子生物學的表征與鑒定以及利用金屬組學探究重金屬轉化形態(tài)的檢測與鑒定(圖1)。

圖1 研究細菌介導重金屬轉化流程Figure 1 The process of heavy metal transformation mediated by bacteria.

4 細菌介導重金屬轉化過程中的相關金屬組學技術

4.1 納米顆粒與金屬蛋白分離技術

尺寸排阻色譜(SEC)由于分離時間快、分離過程溫和等優(yōu)勢被廣泛應用于納米顆粒和金屬蛋白的分離中[56-57]。其分離原理基于不同水力學直徑的分子流經填料時的孔道路徑差異,利用該差異將不同大小的分子分離,類似于分子篩效應。如圖2所示,不同水力學直徑的分子進入管柱后,以一定速度流動的流動相流經色譜柱的同時,帶動樣品分子在色譜柱內的遷移。樣品與固定相之間不發(fā)生相互作用,管柱中的填料是由高分子交聯(lián)而成,內部本身具有三維網狀篩孔的固體顆粒,大分子無法進入凝膠孔洞,而只流經凝膠和管柱間的孔隙,所以總體運行路徑較短,從色譜柱入口到出口所需時間較短(如圖2中實心圓分子和五邊形分子);中等大小的分子能進入凝膠中一些適當的孔洞,但不能進入更小的微孔,在柱中受到滯留作用,較慢地從色譜柱洗脫出來,在管柱中的停留時間比較久(如圖2中菱形分子);較小的分子可以自由進入凝膠內的篩孔,在柱中受到更強的滯留,總體運行路徑較長,所以在管柱內的停留時間較長(如圖2中空心圓分子和三角形分子)。基于此原理可以區(qū)分大小不同的分子,亦可與已知大小的分子作比較而確定未知樣品的分子量。由此可知,尺寸排阻色譜可以將尺寸不同的分子按照保留時間分開,分子量越大的分子保留時間越短,相反,分子量越小的分子保留時間越長。

圖2 SEC中分離不同水動力直徑分子的示意圖Figure 2 Schematic diagram for the separation of various molecules with different hydrodynamic diameters in SEC.

4.2 納米顆粒與金屬蛋白檢測技術

電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)因為其高靈敏度,多元素同時檢測等優(yōu)勢而被應用于聯(lián)用系統(tǒng),包括與液相色譜[58]、離子色譜[59]、毛細管電泳[60]、凝膠電泳等體系的聯(lián)用[61]。其中,SEC-ICP-MS已應用于不同生物樣品中金屬納米顆粒和金屬蛋白的檢測。例如,已有研究[62-63]利用SEC-ICP-MS聯(lián)用技術對金屬納米顆粒及其對應的金屬離子進行了形態(tài)分析,并在實際樣品檢測中表現出良好的方法性能,驗證了方法的有效性。另一方面,為了更好地闡明金屬在生物體內的健康和毒性作用,分析生物體內與必需金屬和有毒金屬結合形成的金屬蛋白是至關重要的,SEC-ICP-MS已經應用于不同人體體液、植物和細胞中金屬蛋白的檢測,為了解金屬蛋白的環(huán)境效應和生物毒性提供了有力工具[64-66]。

4.3 納米顆粒與金屬蛋白鑒定、表征技術

在進行納米顆粒與金屬蛋白分離檢測后,還需要進行納米顆粒的形貌表征和未知蛋白的結構鑒定,獲得納米顆粒與金屬蛋白的性質信息,進而研究細菌介導重金屬的形態(tài)轉化過程和轉化機制。

4.3.1 納米顆粒表征技術

透射電子顯微鏡(TEM)為納米顆粒的結構表征提供了高分辨率的直接成像方法。與原子力顯微鏡(AFM)、掃描隧道顯微鏡(STM)和各種X射線方法等其他原位技術相比,TEM不僅具有高分辨率的優(yōu)勢,還提供了多尺度成像功能表征顆粒密度,獲得目標區(qū)域內有關顆粒大小和形態(tài)分布的統(tǒng)計信息,與電子能譜(EDS)相結合,還可以確定原子組成信息或實現元素分布的直接可視化[67-72]。已有研究通過TEM對合成的腐植酸(HA)包覆Fe3O4納米粒子(Fe3O4/HA)進行了物理化學表征,驗證了Fe3O4/HA在重金屬去除中的適用性[73]。還有研究利用TEM對鯨類動物肝臟中汞結合態(tài)進行表征,發(fā)現Hg-NPs是鯨類動物肝臟中重要的汞形態(tài)。同時鑒定出小尺寸(5～40 nm)和大尺寸(100 nm)的Hg-NPs主要與硒(Se)、硫(S)以及少量鎘(Cd)、鉛(Pb)和銀(Ag)絡合,為海洋哺乳動物體內Hg-NPs及其化學形態(tài)提供了直接證據[74]。

4.3.2 金屬蛋白鑒定技術

蛋白質是一條或者多條肽鏈以特殊方式形成的生物大分子,大多數蛋白質以特定的三維結構存在。蛋白質鑒定主要在于識別蛋白質的一級結構,包括蛋白質肽鏈氨基酸的排列、肽段分子量以及二硫鍵數目和位置,是生物研究的有力工具。液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)由于其高靈敏度和特異性通常成為鑒定和定量分析復雜生物樣品中蛋白質的首選方法。首先,它是一種高通量方法,能夠同時定量數千種蛋白質[75-77]。其次,LC-MS/MS可以檢測和量化天然蛋白并對修飾點進行分析,并通過蛋白相互作用(PPI)網絡識別蛋白質參與的生物過程和相關途徑[78],為研究蛋白質在細菌介導重金屬轉化過程中所扮演的角色提供有力支撐。

5 總結與展望

細菌在重金屬環(huán)境中,會發(fā)展出抵御重金屬毒性作用的復雜防御機制。本綜述立足于金屬組學相關方法,為細菌介導重金屬轉化過程這一科學問題的研究提供了新思路。在未來研究中,首先可以從細菌生物信息學數據入手,通過序列比對確定關鍵基因,并將關鍵基因進行敲除與轉導,在體內暴露與體外模擬的過程中,通過對顆粒態(tài)和蛋白質結合態(tài)金屬的分離檢測與表征鑒定,研究細菌介導重金屬轉化的形態(tài),為重金屬形態(tài)轉化過程的機制研究提供理論及技術基礎。

但目前仍有一些問題需要進一步研究,例如,重金屬與細菌最初發(fā)生相互作用(氧化還原、礦化)的初始位點尚不清楚,同時缺乏一定的技術方法去滿足重金屬和細菌相互作用的原位觀測。另一方面,細菌介導重金屬發(fā)生轉化后的最終形態(tài)還不明確,更深層次的機制還需要一些新技術的開發(fā)與優(yōu)化,例如蛋白質結構的鑒定等。