人群重金屬混合暴露與肝功能的關聯(lián)研究

趙拴政 殷國桓 趙梅朵 李 昂 吳景濤 柳曉琳 魏嵐萍 徐 晶* 許 群

(1.中國醫(yī)學科學院 基礎醫(yī)學研究所,北京協(xié)和醫(yī)學院 基礎學院 流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學系,中國醫(yī)學科學院 環(huán)境與健康研究中心,北京 100005;2.錦州醫(yī)科大學,遼寧 錦州 121001;3.錦州市中心醫(yī)院,遼寧 錦州 121001)

肝病所致的全球疾病負擔仍然巨大,據(jù)研究,全球每年約有200萬人死于肝臟疾病,造成了嚴重的醫(yī)療經(jīng)濟損失[1]。同樣,中國因肝病造成的壽命損失也有所上升[2]。研究表明,病菌、不良的生活習慣以及環(huán)境毒物等均可導致肝臟損傷,引發(fā)肝臟疾病[3]。肝臟作為人體的代謝器官,在對有毒化學物的代謝中起著關鍵作用[4]。而重金屬作為一種廣泛存在于土壤、水以及空氣中的環(huán)境持久性以及生物累積性污染物[5],多項流行病學研究報道了其對肝臟的損傷[6-8]。然而,這些研究的結果是不一致的,且評估肝臟損傷的肝功能指標較為單一。因此,本研究選取遼寧省一個典型的重金屬污染區(qū)居民作為研究對象,分析了5種重金屬鉻(Cr)、鎘(Cd)、釩(V)、錳(Mn)、鉛(Pb)與9種肝損傷標志物的關聯(lián)。此外,考慮到真實的情況往往是多金屬的共同暴露,本研究也同時評估了5種重金屬混合暴露對肝功能標志物的總體效應。

1 實驗部分

1.1 研究對象

研究對象來源于2016—2018年在遼寧省錦州市重金屬污染區(qū)進行的橫斷面調查。納入標準為:1)年齡≥18歲;2)在該地區(qū)居住10 a以上;3)無任何肝病,如脂肪肝、慢性肝炎或肝硬化;4)有完整的問卷和測量數(shù)據(jù)。本研究最終納入1 266人,所有參與者均由專業(yè)人員進行標準化問卷的調查與體檢,并收集了空腹血液樣本。所有的參與者均簽署了知情同意書,本研究方案(項目編號:2021025)已獲中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所機構倫理委員會批準。

1.2 調查內容

本研究通過標準化問卷進行調查,內容包括:年齡(連續(xù)型變量)、性別(男性或女性)、教育程度(小學及以下,初中及以上)、職業(yè)(農民或其他)、家庭年收入(<2 000元或≥2 000元)、吸煙狀態(tài)(是或否)、飲酒狀態(tài)(是或否)等。

1.2.2 體格檢查

通過體格檢查收集了參與者的體重、身高等信息,并計算了體質質量指數(shù)(Body mass index,BMI)=體重/身高2。

1.3 血液金屬檢測

空腹血樣由臨床專業(yè)人員在檢查當天收集于無金屬肝素抗凝管(BD Biosciences,CA,USA)中,并保存于-80 ℃冰箱中。采用電感耦合等離子體質譜(ICP-MS;Thermo Fisher X2;Thermo Fisher Scientific)來測量血液中Cr、Cd、V、Mn和Pb的水平。為便于進行后續(xù)的統(tǒng)計分析,對于金屬水平低于檢出限(Limit of detection,LOD),則以LOD/2替代。

1.4 肝功能標志物的檢測

早期肝損傷生物標志物丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、天冬氨酸轉氨酶與丙氨酸轉氨酶之比(AST/ALT)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、白蛋白與球蛋白之比(ALB/GLB)、總蛋白(TP)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)使用自動生化分析儀(Hitachi 7600)檢測。

1.5 質量控制

所有調查人員在調查開始前都接受了統(tǒng)一規(guī)范化的培訓,調查數(shù)據(jù)也均采用雙人錄入,以確保一致性與準確性。血樣金屬的檢測采用盲法和質控樣本以確保檢測質量。在分析樣本之前,以空白溶液來確定背景值,進行加標回收實驗,測試元素的峰值回收率在93.9%～102%,批內和批間的精度值分別為<5%和<10%。

1.6 統(tǒng)計學分析

分類變量數(shù)據(jù)采用數(shù)量(百分比)表示,連續(xù)型數(shù)據(jù)根據(jù)是否符合正態(tài)分布采用均數(shù)(標準差)或中位數(shù)[第一分位數(shù)(P25),第三分位數(shù)(P75)]表示。由于金屬值的右偏態(tài)分布,本研究進行了對數(shù)轉換以更好地擬合模型。此外,采用Spearman秩相關計算了5種金屬之間的相關性。

王維說：“我心素已閑，清川澹如此?！彼裕軌蝾I略自然中“明月松間照，清泉石上流”、“人閑桂花落，夜靜春山空”的清幽空靈。

1.6.1 一般線性回歸

首先以單個重金屬濃度作為暴露變量,以每個肝功能生物標志物作為連續(xù)型結果變量,使用一般線性回歸模型(General linear regression model,GLM)評估單一重金屬暴露與肝功能生物標志物之間的關聯(lián)。

1.6.2 加權分位數(shù)和回歸

為了探討5種重金屬共同暴露對肝功能標志物的總體影響,以及每種金屬在總體影響中的貢獻占比,本研究使用了加權分位數(shù)和(Weighted quantile sum,WQS)回歸,WQS模型用于評價混合物的總體效應及每個暴露變量重要程度。其默認假設所有暴露變量與結局關聯(lián)為同一方向(正向或負向),當將WQS指數(shù)納入多元回歸模型時,相關效應估計代表總體混合效應,權重代表各金屬在整體混合物中的相對貢獻[9]。

1.6.3 Quantile g-computation

由于WQS模型需要預先確定相關的方向,當單一暴露和結果同時具有不同的相關方向時存在局限性,本研究同時使用了Quantile g-computation模型以彌補WQS模型關聯(lián)方向選擇的不足以及驗證上述GLM與WQS的結果。Quantile g-computation模型不要求所有暴露都與結果均呈同一方向的相關。其可將金屬濃度轉換為四分位數(shù),并擬合一個線性模型,從而得到總體效應,并同時輸出每種金屬在總體影響中的貢獻占比[10]。如果5種金屬的影響有不同的方向,其提供了每種金屬的正或負權重值,正或負權重值之和為1或-1。

變量的描述性分析與GLM模型采用SAS 9.4(Cary,NC,USA)完成,WQS模型與Quantile g-computation模型使用了R(version 4.0.5)軟件的“gWQS(version 3.0.4)”和 “qgcomp(version 2.10.1)”包。所有模型均對性別、年齡、BMI、教育程度、吸煙、飲酒狀態(tài)、職業(yè)以及家庭年收入進行了調整。雙側檢驗P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基本情況

1 266名研究對象的年齡為(65.5±10.5)歲,BMI為24.26±3.78,女性占比(64.6%)多于男性;多數(shù)人不吸煙(65.9%)或飲酒(73.2%),且職業(yè)多為農民(89.7%);教育程度多為小學及以下(92.7%),多數(shù)人(56.8%)家庭年收入≥2 000元。血液金屬及肝功能標志物的濃度描述見表1。5種金屬之間存在低到中度的相關性(0.04～0.29)。

表1 研究人群的基本特征(n=1 266)

2.2 單一金屬與肝功能標志物的關系

由GLM的結果可知,經(jīng)對數(shù)轉換后的血重金屬Cr、Cd、V、Mn的濃度每增加1個單位,AST/ALT水平分別平均升高1.59、2.86、11.83和5.28(βCr=1.59,95%CI:0.46、2.72;βCd=2.86,95%CI:1.30、4.42;βv=11.83,95%CI:7.87、15.78;βMn=5.28,95%CI:2.86、7.71);對數(shù)轉換后的血重金屬Cr、Cd、Mn、Pb水平每增加1個單位,ALB水平分別平均降低0.72、1.12、1.60和0.77 g/L(βCr=-0.72,95%CI:-1.04、-0.41;βCd=-1.12,95%CI:-1.56、-0.69;βMn=-1.60,95%CI:-2.28、-0.92;βPb=-0.77,95%CI:-1.44、-0.11);對數(shù)轉換后的血重金屬Cr、V水平每增加一個單位,GLB水平分別平均升高0.43和1.73 g/L(βCr=0.43,95%CI:0.21、0.65;βV=1.73,95%CI:0.95、2.50);對數(shù)轉換后的血重金屬Cr、Mn水平每增加1個單位,ALB/GLB水平平均降低1.42和1.48(βCr=-1.42,95%CI:-1.87、-0.97;βMn=-1.48,95%CI:-2.47、-0.50);經(jīng)對數(shù)轉換后的血重金屬Cr、Cd、Mn、Pb水平每增加1個單位,TP水平平均降低0.32、1.17、1.48和0.81 g/L(βCr=-0.32,95%CI:-0.65、-0.01;βCd=-1.17,95%CI:-1.63、-0.72;βMn=-1.48,95%CI:-2.19、-0.77;βPb=-0.81,95%CI:-1.51、-0.12);經(jīng)對數(shù)轉換后的血重金屬Cd、V、Mn水平每增加1個單位,TBIL水平分別平均升高0.59、2.70和1.01 μmol/L(βCd=0.59,95%CI:0.00、1.18;βV=2.70,95%CI:1.19、4.20;βMn=1.01,95%CI:0.09、1.94);經(jīng)對數(shù)轉換后的血重金屬Cr、Cd、V、Mn、Pb水平每增加1個單位,DBIL水平分別平均升高0.08、0.07、0.13、0.10和0.06 μmol/L(βCr=0.08,95%CI:0.05、0.10;βCd=0.07,95%CI:0.04、0.11;βV=0.13,95%CI:0.04、0.22;βMn=0.10,95%CI:0.05、0.16;βPb=0.06,95%CI:0.01、0.12)。詳見表2。

表2 一般線性回歸模型中單一重金屬與肝功能標志物的關聯(lián)(n=1266)

2.3 混合金屬暴露與肝功能標志物的關聯(lián)及每種金屬在混合效應中的貢獻占比

2.3.1 加權分位數(shù)和(WQS)回歸的結果

如圖1所示,WQS指數(shù)每增加一個分位數(shù),AST/ALT水平平均升高4.42(β=4.42,95%CI:2.66、6.18)、GLB水平平均升高0.52 g/L(β=0.52,95%CI:0.21、0.83)、TBIL水平平均升高1.33 μmol/L(β=1.33,95%CI:0.70、1.96)、DBIL水平平均升高0.31 μmol/L(β=0.31,95%CI:0.04、0.58),而ALB水平平均降低1.93 g/L(β=-1.93,95%CI:-2.54、-1.32)、ALB/GLB水平平均降低1.36(β=-1.36,95%CI:-1.99、-0.73)、TP水平平均降低1.47 g/L(β=-1.47,95%CI:-2.08、-0.86)。其中,V在金屬混合暴露對AST/ALT(Weight=0.43)、GLB(Weight=0.52)、TBIL(Weight=0.48)的正向關聯(lián)中有最大的權重,而Cr在對DBIL(Weight=0.34)的正向關聯(lián)中權重最大。Mn、Cr、Cd分別在金屬混合暴露對ALB(Weight=0.52)、ALB/GLB(Weight=0.58)、TP(Weight=0.47)的負向關聯(lián)中權重最大。

圖1 加權分位數(shù)和(WQS)回歸中重金屬混合暴露與肝功能標志物的關聯(lián)及每種重金屬的權重(n=1266)Figure 1 The association between mixed heavy metal exposure and liver function biomarkers in weighted quantile sum(WQS) regression and weights of each heavy metal(n=1266).

2.3.2 Quantile g-computation模型的結果

Quantile g-computation模型的結果基本一致于GLM與WQS的結果。如表3及圖2所示,經(jīng)對數(shù)轉換后的5種重金屬水平同時增加1個分位數(shù),AST/ALT水平平均升高4.70(β=4.70,95%CI:2.86、6.55)、GLB水平平均升高0.32 g/L(β=0.32,95%CI:0.04、0.60)、TBIL水平平均升高0.97 μmol/L(β=0.97,95%CI:0.26、1.68)、DBIL水平平均升高0.23 μmol/L(β=0.23,95%CI:0.05、0.42),而ALB水平平均降低1.76 g/L(β=-1.76,95%CI:-2.29、-1.24)、TP水平平均降低1.41 g/L(β=-1.41,95%CI:-1.95、-0.87)。而Cr在混合金屬對GLB(Weight=0.57)、ALB/GLB(Weight=-0.65)中有最大的權重;Cd在GLB(Weight=-0.73)、ALB/GLB(Weight=0.56)、TP(Weight=-0.41)中權重最大;V在AST/ALT(Weight=0.40)、TP(Weight=1)、TBIL(Weight=0.44)中權重最大;Mn在ALB(Weight=-0.34)、DBIL(Weight=0.43)中權重最大;而Pb分別在AST/ALT(Weight=-1)、TBIL(Weight=-0.55)中占有最大的負向權重。

圖2 Quantile g-computation模型中每種金屬在混合暴露與肝功能標志物關聯(lián)中的權重Figure 2 Weights of each metal in combined effect on liver function biomarkers in the Quantile g-computation model.

表3 Quantile g-computation模型中重金屬混合暴露與肝功能標志物的關聯(lián)以及每種重金屬的權重(n=1266)

3 討論

本研究揭示了5種重金屬(Cr、Cd、V、Mn、Pb)的單一和混合暴露與肝功能標志物(ALT、AST、AST/ALT、ALB、GLB、ALB/GLB、TP、TBIL、DBIL)之間的關聯(lián)。結果表明,5種重金屬混合暴露均能夠影響肝功能標志物,且重金屬V、Cr、Cd貢獻占比最大。提示重金屬暴露可能會造成肝臟損傷,V、Cr、Cd等可能對此影響最大。本研究為血金屬與肝功能之間的關系提供了證據(jù),具有重要的公共衛(wèi)生意義。

肝功能指標檢測可用于判斷肝臟是否損傷,評估損傷程度,確定受損位置以及幫助鑒別診斷。當肝細胞受損時,ALT、AST被釋放到細胞外,從而導致血清中水平升高[11];本研究觀察到重金屬與AST/ALT的正向關聯(lián),LI等[12]對2011-2018年的NHANES數(shù)據(jù)研究同樣發(fā)現(xiàn)了重金屬Cd與AST/ALT的正向關聯(lián),這與本研究的結果一致。TP、ALB由肝臟合成,當肝細胞受損時,二者水平下降[13];來自印度和巴基斯坦的兩項Cr職業(yè)暴露人群的肝毒性研究報告顯示,與對照組相比,Cr暴露人群的TP水平明顯較低[14-15];此外,一項在中國人群中探討Cd暴露對肝腎功能影響的橫斷面研究發(fā)現(xiàn)了Cd暴露與ALB水平的負向關聯(lián)[16];最近的一項對中國浙江省807名一般人群進行的橫斷面研究表明,Cr與Pb暴露也均與TP、ALB水平呈負向關聯(lián)[17]。同樣,本研究也發(fā)現(xiàn)了重金屬Cr、Pb、Cd等與TP、ALB的負向關聯(lián)。GLB作為人體的一種血清蛋白,常被用于肝功能損害的敏感指標,診斷肝臟疾病[18]。而TBIL、DBIL通常用于鑒別肝膽疾病和溶血性疾病[19]。本研究發(fā)現(xiàn)了重金屬與GLB、TBIL、DBIL存在正向關聯(lián)。一項對NHANES數(shù)據(jù)的研究同樣觀察到重金屬Pb與TBIL的正向關聯(lián)[12]。然而,在中國浙江省開展的橫斷面研究觀察到Cr、Pb分別與TBIL、DBIL呈負向關聯(lián)[17],這與本研究觀察到二者正向關聯(lián)的結果不同,不一致的原因可能為:首先,前人研究采用的金屬介質為尿液、而考慮到血金屬更能反映體內的重金屬負荷[20],本研究采用血液作為金屬介質,生物介質的不同可能是結果不一致的主要原因;其次,前人研究選取的人群來源于中國國家人體生物監(jiān)測中心的一般暴露人群,而本研究人群來源于重金屬污染區(qū),金屬暴露水平的不同也可能導致結果的不同。此外,多項動物學研究同樣觀察到了重金屬暴露與肝功能損傷的關聯(lián)。對Wistar大鼠進行的幾項重金屬暴露實驗發(fā)現(xiàn),與對照組相比,Cr暴露組的TP水平下降[21]、Cd處理組ALB水平降低、Mn處理組的GLB水平顯著升高[22]。

重金屬廣泛存在于環(huán)境中,且存在較長的半衰期[5]。機制學研究表明,重金屬一旦被吸收,則會在肝、腎、骨骼等沉積,并通過氧化應激、DNA損傷等使人體造成嚴重損傷[23-24]。而當人體同時遭受多金屬的共同暴露時,可能產(chǎn)生更為復雜的效應。兩項關于小鼠的重金屬混合暴露實驗表明,小鼠同時暴露于Pb、Cd等金屬,其血清ALT、AST水平顯著高于對照及單金屬處理組[25-26]。這提示我們更應該關注多金屬的共同暴露。本研究發(fā)現(xiàn)多金屬混合暴露與肝功能標志物ALB、TP呈負向關聯(lián),與TBIL、DBIL呈正向關聯(lián)。此外,多項橫斷面研究同樣觀察到Cr、Cd、Pb等金屬混合暴露與ALB、TP水平的負向關聯(lián),與TBIL、DBIL的正向關聯(lián)[12,17,27]。這與本研究的結果一致。

4 結論

本研究擁有一些優(yōu)勢:1)采用了9種肝功能標志物來評價重金屬對肝臟的影響,能更全面地評估肝臟損傷;2)探討了5種金屬對肝臟的影響,并同時使用了WQS與Quantile g-computation模型研究混合金屬暴露對肝臟產(chǎn)生的總體效應,使結果更具可信性;3)本研究的金屬來源于血液樣本,其不受稀釋度等因素的影響,檢測的金屬水平更為穩(wěn)定。當然,本研究也存在一些局限性:1)研究為橫斷面研究,僅能提供關聯(lián)的方向,而不能說明因果;2)研究雖針對許多因素進行了調整,但可能仍存在未收集的混雜因素,如飲食;3)本研究未區(qū)分金屬的價態(tài),例如Cr3+可能有益于人體,而Cr6+則是有害的。

綜上所述,本研究為重金屬與肝功能損傷之間的關系提供了證據(jù),后續(xù)需進一步開展縱向研究來證明此種關聯(lián),這可能對識別肝病的非傳統(tǒng)危險因素有重要意義。