鋅誘導對香菇菌絲生長速度及金屬硫蛋白含量的影響

姜海云 孫振英 劉貴巧*

(1.邯鄲市食品藥品檢驗中心,河北 邯鄲 056002;2.河北工程大學 生命科學與食品工程學院,河北 邯鄲 056038)

香菇在民間一直都有“山珍之王”的美譽,作為一種深受大家喜愛營養(yǎng)保健食品[1],為了為香菇菌絲創(chuàng)造一個更加有利的發(fā)育環(huán)境,通常選用人工栽培中的代料栽培[2],通過培養(yǎng)基培養(yǎng)的方式在恒溫條件下進行菌絲的培養(yǎng)生長[3]。

1957年,美國科學家MARGOSHOES等[4]在研究過程中從動物的器官之中分離出鎘的金屬硫蛋白被稱為金屬硫蛋白(簡稱MT)。MT含有較多的半胱氨酸,具有良好的重金屬解毒功能[5],MT可根據微量元素的狀況對鋅等金屬進行吸收[6],可以此來探討不同品種的香菇中金屬硫蛋白含量對香菇重金屬吸附能力影響。重金屬污染指的是通過重金屬或者其化合物造成環(huán)境污染。據徐麗紅等[7]調研,浙江省食用菌重金屬超標是主要安全隱患。

香菇是世界上栽培量最大的食用菌之一,含有多種有效的藥用成分[8]。目前各國科學家所研究的降解食用菌中重金屬含量的方法主要有化學法降解、生物分子分解等[9],鋅會與食用菌中的氨基酸結合成有機鋅,安全穩(wěn)定[10],但是當重金屬富集達到一定濃度后對食用菌的生長還是會產生不利影響。

徐爾尼等[11]發(fā)現香菇比茶樹菇、金針菇對鋅富集作用更強,但該富集作用一旦超過500 mg/kg,將會隨鋅濃度增加而逐漸減弱。且香菇營養(yǎng)特性和保健功能較于其他真菌類品種較好[12]本實驗將選取食用菌中的香菇作為研究對象,模擬重金屬對香菇的污染,測定所收獲的不同香菇中元素鋅及其金屬硫蛋白的含量和影響作用并分析原因,金屬硫蛋白具有較高吸附率和可回收金屬離子的功能[13],也可為金屬硫蛋白的應用前景進行展望。

1 實驗部分

1.1 原料與培養(yǎng)基

土豆購于邯鄲市水院北路農貿市場;4-12、74、808三個香菇品種,均由河北工程大學食品微生物實驗室提供;PDA培養(yǎng)基(固/液兩種)。

1.2 實驗試劑及主要儀器

硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硝酸、硫酸鋅、葡萄糖均為分析純(>99.7%),Tris-鹽酸溶液、氯仿-乙醇溶液、金屬硫蛋白(MT)酶聯免疫分析試劑盒均購于上海莼試生物技術有限公司。

BPXUN立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠),DNP-9162BS-Ⅲ電熱恒溫培養(yǎng)箱,SW-CJ系列凈化工作臺(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司),PL-103S電熱鼓風干燥箱(天津市通達實驗電爐廠),KDN-12C消化爐(浙江托普儀器有限公司),TCL-16B高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠),THZ-C恒溫振蕩器(北京瑞邦興業(yè)科技有限公司),TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司),電子天平(上海精密科學儀器有限公司天平儀器廠制造),Utrao-SM800酶標儀(上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司),AA800型原子吸收分光光度儀(美國PE公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 香菇菌種的活化及長速測定

按土豆200 g/L、瓊脂20 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸二氫鉀2 g/L、硫酸鎂1 g/L、自來水1 L的比例配PDA固體培養(yǎng)基。將煮沸的培養(yǎng)基以每瓶100 mL的量分裝于錐形瓶中,各個錐形瓶中按每100 mL培養(yǎng)基加入1、3、5、7 mmol/L的濃度梯度加入ZnSO4·7H2O并配空白濃度后高壓滅菌取出以備使用。將滅好菌的培養(yǎng)基以每個菌種每個濃度倒入三個平板為宜,待液體凝固后將保藏好的三個不同品種的香菇菌種進行接種,此環(huán)節(jié)要在無菌環(huán)境下進行,接種后將培養(yǎng)皿封口放到25 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)保存,并觀察各菌塊每天的生長情況,并測量出每個菌落的三個不同方向的生長直徑,取平均值。

按上述步驟再次配制液體PDA培養(yǎng)基,設置0.5 g/L和1 g/L的金屬硫蛋白誘導劑ZnSO4濃度,以每瓶200 mL分裝于500 mL的錐形瓶內,高壓滅菌后在無菌操作臺上用打孔器進行接種,每瓶接0.5 cm3的菌種6塊,之后放到25 ℃,150 r/min的搖床中進行培養(yǎng),由于香菇菌絲在高濃度金屬鹽溶液培養(yǎng)下細胞內平衡遭到破壞,因此不同濃度下的菌絲生長可能會有不同[14],因此要每天觀察菌種的生長情況。

1.3.2 香菇中金屬硫蛋白粗提取

取6.055 g Tris試劑加入到800 mL無菌去離子水后加1% HCl溶液調至pH值為8.2,定容至1 L,高溫高壓滅菌后室溫保存以備使用。

將培養(yǎng)好的菌絲用漏斗過濾掉液體培養(yǎng)基,之后用無菌去離子水沖洗菌絲體3～4次,將洗好的純凈菌絲展開鋪到濾紙上,放到45 ℃的烘干箱內大約25～30 min,烘干菌絲體外部水分,得到濕樣,收集菌絲濕樣在天平上稱其重量,并取相同質量的三種不同品種的香菇菌絲進行下列實驗操作。按2 mL/g加入0.05 mol/L、pH=8.2的Tris-HCl緩沖溶液,將菌絲和溶液混合物放到研缽中進行研磨,直至成勻漿狀態(tài)后進行超聲波破碎細胞。將破碎好的漿狀物取出后加入與菌絲/Tris-HCl緩沖溶液混合物等體積的氯仿-乙醇混合溶液(0.08∶1),攪拌約3 min變性除離心去雜蛋白質。9 000 r/min離心機離心25 min,將液體混合好離心后提取上清液部分。將上清液放置于80 ℃的恒溫水浴鍋中熱變性15 min除去雜蛋白,用燒杯盛取適量自來水將上清液放置其中迅速冷卻,靜置約30 min后再次用離心機以10 000 r/min的轉速離心25 min,取上清液部分即得到金屬硫蛋白的粗提取液。

1.3.3 香菇中金屬硫蛋白的吸光度

將上面實驗得到的金屬硫蛋白的粗提取液在紫外分光光度計中進行檢測。首先進行光譜測量,對粗提取液進行210～320 nm紫外區(qū)域的連續(xù)掃描,光度方式為Abs,速度中等,距離間隔為0.5 nm,校正零基準線后開始測量得到金屬硫蛋白紫外吸收光譜圖,記清波峰位置及與之相對應的波長長度。第二步進行光度測量,將上一步處于波峰位置的波長在此次實驗中設定為測量波長,先用參比液進行調零,再用同一濃度的三種菌絲金屬硫蛋白粗體液依次進行測定。

1.3.4 金屬鋅含量的測定

取三個不同品種且含不同鋅濃度的菌絲體濕樣各0.1 g加入5 mL濃硝酸在消化爐上進行消化,另取標品作為對照樣同樣加濃硝酸進行消解,直至液體加熱至澄清,在消解管中剩余少量液體為宜,充分將酸揮發(fā),避免影響實驗結果。將消解完全的液體取出,用無菌去離子水定容到25 mL,然后根據國家標準GB/T 5009.14—2003《食品中鋅的測定》進行實驗與計算。

1.3.5 香菇中金屬硫蛋白含量的測定

此過程依據MT酶聯免疫分析法測定原理,根據所購試劑盒說明書嚴格進行各步驟實驗,并根據最后結果進行計算分析。

以標準物的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,利用Excel 2007繪圖軟件繪出標準曲線,用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度;再乘以稀釋倍數5,這樣便可以得到樣品的實際濃度。

2 結果與分析

2.1 鋅濃度對固體培養(yǎng)基中香菇菌種生長速度的影響

模擬重金屬對香菇的污染,在栽培基質料中添加不同濃度的重金屬鹽溶液,研究不同濃度的重金屬鋅對香菇長速的影響,模擬重金屬對香菇的污染,在栽培基質料中添加不同濃度的重金屬鹽溶液,研究不同濃度的元素鋅對香菇長速的影響。

2.1.1 不同濃度鋅誘導下香菇4-12菌種的生長情況

研究不同濃度的元素鋅對香菇4-12菌種長速的影響(圖1)。通過10 d的長速觀察發(fā)現,培養(yǎng)的第4 d前菌絲處于前期吸收營養(yǎng)物質狀態(tài),并未生長,從第4 d開始菌絲出現明顯的生長狀態(tài),第4 d 1 mmo/L鋅濃度下菌落直徑為1.93 cm,3 和5 mmol/L分別為1.26、1.22 cm,7 mmol/L下菌落尚未生長,1～5 mmol/L菌落雖然均較空白組有促進作用,但是效果還不明顯;從第5 d開始,1 mmol/L菌落直徑為2.97 cm,3和5 mmol/L菌塊直徑分別為1.57和1.46 cm,7 mmol/L菌塊依然未生長,從第4 d到第10 d整體來看,1～7 mmol/L菌落直徑一直呈現依次遞減狀態(tài),從數據上看出隨著鋅濃度的增大,促進作用逐漸減弱,抑制作用逐漸明顯。

1 mmol/L的鋅濃度對4-12的生長起到比較明顯的促進作用,促進生長率可達到60.47%,從3 mmol/L開始,雖然菌絲還在生長,但已經相較于空白已開始有抑制作用,當鋅濃度達到7 mmol/L時菌絲已經完全停止生長。5 mmol/L鋅濃度作用下的其中一組數據可能由于搖晃不均勻,導致在制作固體培養(yǎng)基時濃度偏低,在第7 d時菌落直徑已達到2.2 cm,以此單獨在此提出。

因此可分析得知,當鋅濃度在1 mmol/L時,菌絲生長最快;到5 mmol/L時鋅對4-12菌絲產生明顯的抑制作用,但達到7 mmol/L時對菌塊的生長造成嚴重的影響。

2.1.2 不同濃度鋅誘導下香菇74菌種的生長情況

研究不同濃度的元素鋅對香菇74菌種長速的影響,通過圖2可看到第4 d前并沒有長出菌落,培養(yǎng)到第4、5、6 d時空白與5 、7 mmol/L鋅濃度培養(yǎng)條件下的菌落生長直徑相差不大,5 mmol/L菌落直徑變化從1.33到1.87 cm,7 mmol/L菌落直徑從1.34到1.76 cm,較空白組菌落直徑從1.24到1.89 cm的變化沒有明顯的影響;而1和3 mmol/L直徑的變化分別為從1.67到2.30 cm和從1.69到2.29 cm,較空白組有較為明顯的促進作用。

圖2 不同鋅濃度下74品種菌落生長情況Figure 2 Colony growth of 74 species under different zinc concentrations.

但是,從第7 d開始,5和7 mmol/L的鋅濃度對菌落的生長的抑制作用開始變得明顯,抑制率可以達到54.8%以上;而1和3 mmol/L鋅濃度條件下培養(yǎng)的菌落從一開始到第10 d一直有生長上的優(yōu)勢,雖然兩個濃度的菌落只有0.1 cm以內的差距,但是相比而言,3 mmol/L的鋅濃度促進作用更大一些。

因此可以分析得到,當鋅濃度在3 mmol/L時,菌絲生長最快,前期促進效率高達90%以上,但從5 mmol/L的鋅濃度開始對74菌絲的抑制作用開始顯現。

2.1.3 不同濃度鋅誘導下香菇808菌種的生長情況

研究不同濃度的元素鋅對香菇808菌種長速的影響,由圖3可知菌絲培養(yǎng)第4 d到第5 d直徑的變化分別是:空白組1.07到1.72 cm;1 mmol/L鋅濃度下1.87到2.44 cm;3 mmol/L鋅濃度下1.88到2.58 cm;5 mmol/L鋅濃度下1.43到1.80 cm;7 mmol/L鋅濃度下1.44到1.76 cm。通過分析可知3 mmol/L的增速最快,這兩天在鋅作用下的菌塊均比空白組菌落生長快,有明顯的促進作用。但是從第6 d開始到第10 d觀察結束,1和3 mmol/L鋅濃度均有較為明顯的促進作用,而5和7 mmol/L的抑制作用則凸顯出來。

圖3 不同鋅濃度下808品種菌落的生長情況Figure 3 Colony growth of 808 varieties under different zinc concentrations.

通過圖3可看到1和3 mmol/L鋅濃度對808菌塊生長的影響相接近,5和7 mmol/L的鋅濃度對菌塊的影響相差不明顯。第4、5 d時5和7 mmol/L的鋅濃度條件下的菌塊比空白菌塊長速相對較快,但是由于金屬濃度較高,到后期培養(yǎng)之時,長速下降并呈現抑制作用。相比較之下,前兩個鋅濃度較小,因此對菌塊的長勢起到促進的作用。

因此,當鋅濃度在3 mmol/L時,菌絲生長最快,當鋅濃度達到5 mmol/L時對808菌絲出現生長抑制作用。

2.2 不同濃度鋅作用下香菇菌絲中金屬硫蛋白含量及鋅含量對比

探究不同濃度鋅作用下香菇菌絲中金屬硫蛋白含量及鋅含量對比,通過進行香菇對金屬硫蛋白含量相關性研究,從而為香菇及其他食用菌富集重金屬的原因及其富集機理的研究提供參考(圖4)。

圖4 不同濃度下三種菌絲吸附重金屬鋅含量對比Figure 4 Comparison of heavy metal zinc content adsorbed by three kinds of mycelia at different concentrations.

根據國家標準GB/T 5009.14—2003《食品中鋅的測定》,對試樣中鋅含量進行計算:

(1)

X——試樣中鋅的含量,mg/kg或mg/L;

A1——測定試樣消化液中鋅含量,μg/mL;

A2——試劑空白液中鋅含量,μg/mL;

V——試樣消化液總體積,mL;

M——試樣質量或體積,g或mL。

根據資料顯示不同的吸附時間對鉛的吸收效果也會不同[15]。因此推斷出時間可能對鋅吸附效果也有一定影響[16],但在此實驗中只以最后一天長成時間作為截止時間,以此不做分析。

在0、1、3、5、7 mmol/L鋅誘導濃度下,4-12品種富鋅量從0.33 mg/g開始依次增長,最終在7 mmol/L濃度下達到最大吸附量17.12 mg/g;74品種空白組富鋅量很低只要0.16 mg/g,之后隨著鋅濃度的增加,菌體內的富鋅量也在增加;808的品種每個濃度下與74的含量相差不大,雖然中間吸附量有低于74品種,但最后的含量比74要高。

在3 mmol/L濃度下,4-12、74、808的吸附量分別為8.79、6.62、5.46 mg/g,5 mmol/L鋅濃度下4-12、74、808的吸附量分別為14.97、13.97、13.81 mg/g,對比之前的吸附量,在3和5 mmol/L之間鋅吸附量增長率很高。

通過圖4顯示來看,同一菌種在不同濃度梯度下菌絲的鋅含量隨著培養(yǎng)液鋅濃度的增加而增加;同一鋅濃度作用條件下,4-12富鋅量較其他兩個品種較高,74與808富鋅量相差不大,整體上808稍微高出一點。

2.3 香菇菌絲中金屬硫蛋白的含量

圖5顯示,通過標品吸光度值得到回歸線性方程為:

圖5 金屬硫蛋白標品標準曲線圖及回歸方程式Table 5 Standard chart and regression formula of metallothionein labeling.

y=0.0429x+0.1943

(2)

將各個待測樣品的吸光度值代入方程式中得到粗提液中金屬硫蛋白濃度。

菌絲中金屬硫蛋白濃度含量=OD值×稀釋倍數×粗提液體積×初始菌絲濕重質量÷制取粗提掖菌絲濕重質量

(3)

即可得到三種品種菌絲體不同元素濃度下吸附的金屬硫蛋白含量。

空白組4-12、74、808三個品種內金屬硫蛋白含量分別為0.53、0.47、0.49 mg/g,隨著菌絲體吸附鋅含量的增加,菌體內金屬硫蛋白含量相對應也在增加;在最高鋅誘導濃度條件下,4-12、74、808三個品種內金屬硫蛋白含量可以達到9.33、5.61、7.99 mg/g。結果如圖6所示,同一菌絲吸附鋅含量越多,其菌絲體內金屬硫蛋白含量越高。整體來看,同一濃度下4-12所含金屬硫蛋白含量最高。

圖6 不同濃度下三種香菇菌種原菌絲中的金屬硫蛋白含量Figure 6 Metallothionein content in the mycelium of three lentinus species at different concentrations.

2.4 香菇菌絲富鋅含量與金屬硫蛋白的含量相關性分析

采用 SPSS 數據分析軟件 Pearson檢驗法和Excel 2007辦公軟件進行菌絲體富鋅含量與金屬硫蛋白含量的相關性分析。R2為P值,P>0.6說明具有顯著性意義[17]。

通過對圖4中不同濃度下三種菌絲吸附鋅含量對比和圖6中不同濃度下三種香菇菌種原菌絲中的金屬硫蛋白含量(mg/g)的對比可以看到:香菇菌絲富鋅含量與金屬硫蛋白的含量相關性關系為正相關。香菇菌絲內富鋅含量越多,菌絲體中所含金屬硫蛋白含量越高[19]。

通過SPSS 數據分析 Pearson檢驗法和Excel 工作表繪圖可以精確得到圖7～9三個不同香菇品種各自菌體內富鋅量和金屬硫蛋白含量的相關聯性[20]。

圖7 4-12菌種菌絲體富鋅含量與菌體內MT含量相關性回歸曲線[18]Figure 7 Regression curve of correlation between zinc-rich content in mycelium of 4-12 strains and MT content in mycelium [18]

以菌絲體內金屬硫蛋白含量為橫坐標,菌絲富鋅含量為縱坐標,繪制4-12菌種MT含量與富鋅量的相關性回歸曲線,如圖7所示,4-12菌種MT含量與富鋅量有極顯著正相關(R2=0.967,P>0.6),表明4-12菌種富鋅含量的多少明顯影響MT含量的大小,且富鋅量越大越大,MT的含量越大。圖8、9中74和808菌種MT含量與富鋅量相關性系數分別為R2=0.922>0.6和R2=0.962>0.6,因此,三個菌種MT含量與富鋅量均是極顯著正相關。

圖8 74菌種菌絲體富鋅含量與菌體內MT含量相關性回歸曲線Figure 8 Regression curve of correlation between zinc-rich content in mycelium and MT content in mycelium of 74 strains.

圖9 808菌種菌絲體富鋅含量與菌體內MT含量相關性回歸曲線Figure 9 808 Regression curve of correlation between zinc rich content in mycelium and MT content in mycelium of 808 strain.

3 結論

本實驗主要以香菇和金屬鋅為研究的主要內容,從整體來看,香菇菌絲的三個品種中4-12生長的最快。4-12品種的菌絲收獲量最大,比另兩種菌絲生長更加旺盛,同一香菇品種富鋅含量隨著鋅濃度作用梯度的增加而增加。吸收鋅含量越多,菌絲體內金屬硫蛋白含量越多。

在今后的研究中可以擴大真菌和重金屬關聯的研究范圍,以便更好地進行真菌中金屬硫蛋白與重金屬之間關系的研究。