一株海洋真菌與細(xì)菌共培養(yǎng)次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究

朱夏濠, 郝寶聰, 鄭 楊, 李申奧, 徐奧翔, 王夢(mèng)如, 陳 敏

(揚(yáng)州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 江蘇揚(yáng)州 225127)

海洋微生物,尤其是海洋真菌,是獲得結(jié)構(gòu)新穎、生物活性顯著的次級(jí)代謝產(chǎn)物的重要來源,為海洋藥物先導(dǎo)化合物的篩選和發(fā)現(xiàn)提供了豐富的活性模板分子[1]。然而,隨著對(duì)海洋真菌研究的不斷深入,部分菌株被重復(fù)研究,已知化合物的重復(fù)分離率逐漸增加,新化合物的發(fā)現(xiàn)概率逐年降低。研究[2]表明,在傳統(tǒng)的試驗(yàn)培養(yǎng)條件下,微生物只進(jìn)行一些常規(guī)基因的表達(dá),其體內(nèi)大部分編碼化合物的基因是處于沉默狀態(tài)的。因此,為從微生物中分離得到更多的結(jié)構(gòu)新穎的化合物,就必須想方設(shè)法激活微生物的沉默基因。共培養(yǎng)策略是利用微生物群落中的種間相互作用,來激發(fā)微生物沉默基因簇表達(dá)的一種直接有效且簡(jiǎn)便易行的方法[3-4]。本研究采用共培養(yǎng)技術(shù),將海洋真菌PenicilliumjanthinellumHK1-6與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) ATCC 43300共培養(yǎng),并對(duì)其共培養(yǎng)次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離與結(jié)構(gòu)鑒定,為新型抗生素類化合物的發(fā)現(xiàn)提供有效方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Micromass Q-TOF高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó) Waters公司); Bruker amazon SL離子阱液質(zhì)聯(lián)用儀(德國(guó)BRUKER公司); AVANCE 600/400核磁共振儀(德國(guó)BRUKER公司); WTF-203B暗箱式紫外分析儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司); KQ-250E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司); QYC-2112B雙層搖床(上海滬粵明科學(xué)儀器公司); CR21GIII超高速低溫冷凍離心機(jī)(日本HITACHI公司); L-2000高效液相色譜儀(HPLC) (日本HITACHI公司)。硅膠薄層層析板(煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)公司); 柱層析硅膠48～75 μm (青島海洋化工公司); Sephadex LH-20 (美國(guó)Amersham Biosciences公司); ODS反相硅膠(香港優(yōu)尼康公司); 色譜純甲醇(天津四友精細(xì)化學(xué)品公司)。

1.2 菌株來源

海洋真菌HK1-6分離于海南東寨港紅樹林自然保護(hù)區(qū)的海桑根際土壤樣品,經(jīng)分子生物學(xué)及形態(tài)學(xué)鑒定為微紫青霉(Penicilliumjanthinellum)[5], GenBank登錄號(hào)為KY412802。真菌P.janthinellumHK1-6 與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(S.aureus) ATCC 43300均保存于揚(yáng)州大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)研究所。

1.3 發(fā)酵、提取與分離

1) 發(fā)酵: 采用PDB-LB培養(yǎng)基(每1 L純凈水中加入10 g葡萄糖, 100 g土豆浸出液, 2.5 g酵母膏, 15 g海鹽, 5 g蛋白胨, 2.5 g NaCl, pH 7.0)進(jìn)行發(fā)酵, 每400 mL培養(yǎng)基中接種1 mL真菌以及接種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(吸光度為0.5) 200 μL, 共發(fā)酵液15 L, 于28 ℃搖床(140 r·min-1)上培養(yǎng)2周。

2) 提取: 利用超高速低溫冷凍離心機(jī)對(duì)菌體與發(fā)酵液進(jìn)行分離(8 000 r·min-1離心5 min), 取上清發(fā)酵液,用等體積的乙酸乙酯萃取3次,減壓濃縮后得到乙酸乙酯提取物7.5 g。

3) 分離: 上述提取物采用減壓硅膠柱層析,以石油醚-乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇為溶劑進(jìn)行梯度洗脫,分為12個(gè)組分(Fr.1-Fr.12), 再經(jīng)反復(fù)的正、反相硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析及HPLC分離純化,最終分別從Fr.2中分離得到化合物4(6.3 mg); 從Fr.3中分離得到化合物3(12.1 mg); 從Fr.4中分離得到化合物2(2.3 mg); 從Fr.6中分離得到化合物1(9.2 mg)和化合物5(12.0 mg)。

1.4 LC-MS/MS測(cè)試與分子網(wǎng)絡(luò)分析

采用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)提取物進(jìn)行檢測(cè)。色譜柱為YMC-Park-C18column (5 μm, 250 mm×4.6 mm)。流動(dòng)相為甲醇與水,流速為0.8 mL·min-1, 梯度洗脫條件如下: 0～7 min, 30%～70%甲醇; 7～14 min, 70%～85%甲醇; 14～20 min, 85%～90%甲醇; 20～25 min, 90%～95%甲醇; 25～27 min, 95%甲醇。進(jìn)樣量為8 μL。質(zhì)譜采用正離子模式,離子源為ESI源。

將mzXML格式的質(zhì)譜數(shù)據(jù)上傳至GNPS分子網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)構(gòu)建分子網(wǎng)絡(luò)。具體參數(shù)設(shè)置: 前體離子質(zhì)量誤差值2.0 Da, 碎片離子質(zhì)量誤差值0.5 Da, 匹配的二級(jí)質(zhì)譜碎片峰≥6, 節(jié)點(diǎn)之間相關(guān)余弦值≥ 0.7。 最終生成的質(zhì)譜分子網(wǎng)絡(luò)圖借助Cytoscape軟件實(shí)現(xiàn)可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為白色粉末。其核磁共振氫譜(1H NMR)和碳譜(13C NMR)表明結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)吲哚片段及一個(gè)羧基(δC173.5)。具體核磁數(shù)據(jù)如下:1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δH10.90 (1H, s, NH), 7.49 (1 H, d,J=8.0 Hz, 7-H), 7.34 (1 H, d,J=8.0 Hz, 4-H), 7.22 (1H, d,J=2.4 Hz, 2-H), 7.07 (1H, td,J=8.0, 1.2 Hz, 5-H), 6.97 (1H, td,J=8.0, 1.2 Hz, 6-H), 3.62 (2H, s, 10-H);13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δC173.5 (C, C-1), 136.1 (C, C-9), 127.3 (C, C-8), 123.9 (C, C-2), 121.0 (CH, C-6), 118.6 (CH, C-7), 118.4 (CH, C-5), 111.3 (CH, C-4), 107.8 (C, C-3), 31.2 (CH2, C-10)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道基本一致,因此鑒定化合物1為吲哚-3-乙酸(indole-3-aceticacid)。

化合物2為無色針狀結(jié)晶化合物,核磁數(shù)據(jù)如下:1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δH7.89 (1H, s, 4-OH), 5.41 (1H, brs, 6-Ha), 5.32 (1H, brs, 6-Hb), 5.13 (1H, s, 2-H), 3.86 (3H, s, 3-OCH3), 1.66 (3H, s, H-7);13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δC170.4 (C, C-1), 140.8 (C, C-5), 115.9 (CH2, C-6), 102.8 (C, C-4), 89.9 (CH, C-2), 60.28 (CH3O, C-8), 17.56 (CH3, C-7)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道基本一致,因此鑒定化合物2為青霉酸(penicillic acid)。

化合物3為淡黃色油狀物,是一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu),核磁數(shù)據(jù)僅出現(xiàn)一半信號(hào)。其氫譜如下:1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δH11.48 (2H, s, 3-OH, 3′-OH), 6.83 (2H, brs, 2-H, 2′-H), 6.59 (2H, brs, 4-H, 4′-H), 6.03 (2H, d,J=2.6 Hz, 6-H, 6′-H), 2.02 (6H, s, 5-H, 5′-H)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道基本一致,因此鑒定化合物3為二苯醚類化合物diorcinol。

化合物4為棕紅色油狀物。其結(jié)構(gòu)存在對(duì)稱軸,部分核磁數(shù)值重疊,具體核磁數(shù)據(jù)如下:1H NMR (acetone-d6, 600 MHz)δH9.03 (1H, s, 3-OH), 6.01 (1H, s, H-4),5.95 (1H, s, H-2), 2.15 (3H, s, H-7);13C NMR (acetone-d6,150 MHz)δC158.4 (C, C-1, C-3), 139.7 (C, C-5), 107.4 (C, C-4, C-6), 99.6 (C, C-2), 20.6 (CH3, C-7)。結(jié)合文獻(xiàn)[8]數(shù)據(jù),確定化合物4為苯酚類化合物orcinol?；衔?是化合物3的單體結(jié)構(gòu)。

化合物6為棕色油狀物。高分辨質(zhì)譜HR-ESI-MS給出m/z464.2562 [M+H]+, 提示分子式為C27H33N3O4(C27H34N3O4+理論值為464.2544)。其核磁數(shù)據(jù)如下:1H NMR (acetone-d6, 600 MHz)δH7.16 (1H, d,J=8.4 Hz, H-4), 6.70 (1H, d,J=8.4 Hz, H-5), 6.38 (1H, d,J=7.8 Hz, H-24), 4.98 (1H, d,J=7.8 Hz, H-25), 4.28 (1H, brs, Ha-12), 3.91 (1H, brs, Ha-16), 3.41 (1H, brs, Hb-12), 3.16 (1H, overlapped, H-20), 3.03 (1H, m, Hb-16), 2.52 (1H, brs, Ha-10), 2.42 (1H, m, Ha-15), 2.33 (1H, brs, Hb-10), 2.24 (1H, m, Ha-19), 2.10 (1H, m, Hb-19), 2.08 (1H, m, Hb-15), 1.80 (1H, m, H-14), 1.50 (3H, s, H-17), 1.43 (3H, s, H-27), 1.41 (3H, s, H-28), 1.14 (3H, s, H-22), 0.88 (3H, s, H-23);13C NMR (acetone-d6, 150 MHz)δC182.8 (C, C-2), 168.6 (C, C-18), 147.5 (C, C-6), 140.0 (CH, C-24), 136.5 (C, C-7), 134.6 (C, C-8), 125.8 (C, C-9), 122.1 (CH, C-4), 117.8 (CH, C-5), 116.1 (CH, C-25), 80.4 (C, C-26), 72.2 (C, C-13),65.0 (C, C-11), 63.6 (C, C-3), 57.6 (CH2, C-12), 53.5 (CH2, C-16), 52.3 (CH, C-20), 46.7 (C, C-21), 38.5 (CH2, C-15), 36.0 (CH2, C-10), 30.6 (CH3, C-28), 30.4 (CH3, C-27), 23.9 (CH, C-14), 23.1 (CH3, C-23), 20.8 (CH2, C-19), 20.5 (CH3, C-22), 12.4 (CH3, C-17)。通過與文獻(xiàn)[9]數(shù)據(jù)對(duì)比,確定該化合物為吲哚生物堿類化合物paraherquanide N。

2.2 化合物結(jié)構(gòu)

采用共培養(yǎng)技術(shù),將海洋真菌P.janthinellumHK1-6與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(S.aureus) ATCC 43300共培養(yǎng),并對(duì)其共培養(yǎng)次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離與結(jié)構(gòu)鑒定,最終獲得5個(gè)化合物(圖1), 包括吲哚-3-乙酸(1)、青霉酸(2)、二苯醚類化合物diorcinol (3)、苯酚類化合物orcinol (4)以及吲哚生物堿類化合物paraherquanide N (5)。運(yùn)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)獲得共培養(yǎng)產(chǎn)物的二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS), 通過全球天然產(chǎn)物分子網(wǎng)絡(luò)(GNPS)平臺(tái)形成質(zhì)譜-分子網(wǎng)絡(luò),又鑒定了處于吲哚生物堿類分子簇中的 3 個(gè)化合物notoamide B (6)、paraherquanide F (7)及paraherquamide E (8)(圖1)。

圖1 化合物1-8的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds 1-8

2.3 抗菌活性測(cè)試

本課題組在前期研究[10-11]中已測(cè)試化合物2和3的抗菌活性, 2個(gè)化合物均顯示出較強(qiáng)的抗菌活性,尤其是化合物2顯示出對(duì)S.aureusATCC 43300的強(qiáng)抗菌活性。本研究采用濾紙片法[12]測(cè)試了化合物1、4、5的抗菌活性,遺憾的是當(dāng)濃度為100 μg·片-1時(shí), 3個(gè)化合物對(duì)測(cè)試菌株均沒有顯示出抗菌活性。

2.4 質(zhì)譜-分子網(wǎng)絡(luò)分析

本研究采用基于 LC-MS/MS 的分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)對(duì)共培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)物的吲哚生物堿類化合物的化學(xué)多樣性進(jìn)行了重點(diǎn)分析,所形成的質(zhì)譜-分子網(wǎng)絡(luò)見圖2。該分子網(wǎng)絡(luò)中共含有257個(gè)節(jié)點(diǎn),節(jié)點(diǎn)數(shù)≥ 3個(gè)的分子簇有13個(gè)。經(jīng)與GNPS數(shù)據(jù)庫檢索比對(duì),可知部分分子簇為甾醇類、吡喃酮類及脂肪酸類化合物。同時(shí)還以分離到的吲哚生物堿化合物paraherquanide N (5)對(duì)應(yīng)的節(jié)點(diǎn)(m/z464)為指導(dǎo),凸顯出如圖2紅框所示的吲哚生物堿類化合物分子簇。該分子簇中包含4個(gè)母離子節(jié)點(diǎn),除paraherquanide N (m/z464)外,節(jié)點(diǎn)m/z448與GNPS數(shù)據(jù)庫中的notoamide B (6)[13]高度匹配。仔細(xì)分析4個(gè)節(jié)點(diǎn)的MS/MS裂解碎片(表1), 并結(jié)合各母離子之間的分子量差異,最終確定節(jié)點(diǎn)m/z462為化合物paraherquamide F (7)[14], 節(jié)點(diǎn)m/z478為化合物paraherquamide E (8)[15]。真菌P.janthinellumHK1-6在純培養(yǎng)時(shí)可代謝產(chǎn)生吲哚生物堿類化合物paraherquanide N (5)和paraherquamide E (8)等[16], 而化合物6和7為首次從該真菌發(fā)酵產(chǎn)物中檢測(cè)發(fā)現(xiàn),表明細(xì)菌與其共培養(yǎng)后,一定程度上激活了真菌分泌吲哚生物堿的代謝潛能。

表1 吲哚生物堿類化合物二級(jí)質(zhì)譜碎片離子Tab.1 Observed MS/MS fragmentation ions of indole alkaloids

圖2 共培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)譜-分子網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Mass Spectrometry-Molecular Network of the co-culture fermentation products

3 小結(jié)與討論

吲哚-3-乙酸(1)作為信號(hào)分子調(diào)控細(xì)菌基因表達(dá),并參與調(diào)節(jié)細(xì)菌多種生物學(xué)過程和行為[17]; 青霉酸(2)及diorcinol (3)衍生物均具有抗菌、細(xì)胞毒等多種生物學(xué)活性[10-11];而吲哚生物堿類化合物則具有良好的細(xì)胞毒、殺蟲等活性[12-13]。這些化合物作為真菌P.janthinellumHK1-6與細(xì)菌S.aureusATCC 43300共培養(yǎng)體系中的主要代謝產(chǎn)物,與2種微生物的化學(xué)防御機(jī)制密切相關(guān)。真菌HK1-6在細(xì)菌刺激下,產(chǎn)生強(qiáng)抗菌活性化合物青霉酸(2)及diorcinol (3)來抵御細(xì)菌帶來的生存壓力。青霉酸是真菌HK1-6純培養(yǎng)時(shí)的主要代謝產(chǎn)物; 當(dāng)真菌HK1-6與其他真菌共培養(yǎng)時(shí),其代謝產(chǎn)生青霉酸的產(chǎn)量有所提升[18]。由此可見,無論是與真菌還是與細(xì)菌共培養(yǎng),青霉酸均是HK1-6的重要化學(xué)防御物質(zhì)。Diorcinol (3)在真菌HK1-6純培養(yǎng)時(shí)并未被發(fā)現(xiàn),其是真菌HK1-6在細(xì)菌刺激下產(chǎn)生的。據(jù)報(bào)道diorcinol (3)經(jīng)常在真菌被細(xì)菌污染的混合培養(yǎng)體系中發(fā)現(xiàn),其與許多真菌的化學(xué)防御機(jī)制有關(guān)[19]。真菌HK1-6在共培養(yǎng)體系中還代謝產(chǎn)生純培養(yǎng)時(shí)不曾被發(fā)現(xiàn)的具有細(xì)胞毒等活性的吲哚生物堿類化合物notoamide B (6)和paraherquamide F (7)。同時(shí),細(xì)菌ATCC 43300也通過加強(qiáng)分泌對(duì)其生長(zhǎng)和機(jī)能修復(fù)有重要促進(jìn)作用的吲哚-3-乙酸(1)來提高生存競(jìng)爭(zhēng)力,在共培養(yǎng)體系中維護(hù)自身生長(zhǎng)。

綜上所述,在實(shí)驗(yàn)室條件下建立人工微型共培養(yǎng)體系,可有效激活微生物沉默基因簇的表達(dá),產(chǎn)生具有抗菌、細(xì)胞毒等活性的化合物,同時(shí)提高某些化學(xué)防御物質(zhì)的產(chǎn)量,從而抵御外來微生物帶來的生存競(jìng)爭(zhēng),獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生存空間。在共培養(yǎng)體系中被誘導(dǎo)產(chǎn)生的化合物均顯示出多種活性,尤其是抗菌活性。共培養(yǎng)作為一種非靶向的基因激活策略,可刺激微生物產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多樣化的抗生素類次級(jí)代謝產(chǎn)物,對(duì)發(fā)現(xiàn)新的抗生素類化合物具有十分重要的意義。