廣金錢草不同極性萃取物體外降脂及降血糖活性的比較

張會香，湯霞利，林軍全，陳海珊，林偉國，梁筱彬，李霞，關(guān)媛*

（1.桂林理工大學化學與生物工程學院，廣西桂林 541006）（2.廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所，廣西桂林 541006）（3.廣西中恒中藥材產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，廣西梧州 543000）

廣金錢草（Desmodiumstyracifolium(Osb.) Merr.）屬于豆科植物，是一種重要的中藥材，藥用價值豐富，產(chǎn)于廣西、海南及四川等省區(qū)[1]，具有清熱解毒、利膽、利尿的功效，多用于尿路結(jié)石、肝炎、石淋等病癥的治療[2]，黃酮、多糖、酚類化合物是其主要的藥效成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，廣金錢草具有抗結(jié)石[3]、抗氧化[4]、抗炎[5]、利膽鎮(zhèn)痛[6]等生物活性。糖尿病和高血脂病癥對于人們生活健康有著重要影響，長期給予藥物治療會對人體產(chǎn)生副作用，從而影響身體健康，尋找天然且副作用小的藥用植物變得尤為重要。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶作為機體減少葡萄糖吸收的關(guān)鍵酶，是降低餐后血糖的有效分子靶標。通過抑制胰脂肪酶和膽固醇酯酶活性可以減緩機體對脂肪的消化吸收，達到預(yù)防與治療肥胖的目的。由于多種酶參與機體內(nèi)血糖和血脂的代謝，通常以酶為靶標來尋找降血糖和降脂的活性物質(zhì)。近年來有學者對高良姜[7]、辣木葉[8]、葫蘆茶[9]、琴葉榕根[10]提取物對酶活性抑制的研究，發(fā)現(xiàn)它們具有較好的降脂和降血糖活性，表明中藥對于治療高血糖和血脂有一定的開發(fā)價值和廣闊的市場前景。

目前，對廣金錢草的研究主要集中在多糖[11]、總黃酮[12]提取工藝和化學成分分析[13]等方面。對廣金錢草不同極性萃取物對脂肪類和淀粉類水解酶的抑制活性鮮有報道，本研究以廣金錢草為原料，通過不同極性溶劑對廣金錢草乙醇提取物分級萃取，測定各萃取相中總黃酮、總酚含量，并對其體外降脂和降血糖活性進行綜合評價，以期尋找發(fā)揮藥效活性的化學成分，為深入研究廣金錢草藥理活性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

廣金錢草（Desmodiumstyracifolium(Osb.) Merr.）購買于廣西桂林市（由桂林理工大學鑒定）；α-葡萄糖苷酶50 U/mg、4-硝基苯基α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）、奧利司他（Orlistat）、阿卡波糖水合物，阿拉丁試劑有限公司；蘆丁、沒食子酸，上海源葉生物科技有限公司；α-淀粉酶3 700 U/g，索萊寶科技有限公司；脂肪酶15～35 U/mg（牛胰腺），西亞化學科技有限公司；膽固醇酯酶100 U/g（豬胰腺），上海麥克林生化科技有限公司；福林酚、Al(NO3)3、NaNO2、C2H5OH、CH3OH、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇，均為分析純，西隴化工股份有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

Practum224-1CN 電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；HH-S2 數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療器械有限公司；YK722PC 紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器有限公司；F50 多功能酶標儀，瑞士TECAN 公司；XD-5210A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海賢德實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 廣金錢草不同極性萃取物的制備

將干燥的廣金錢草4 kg，用φ=75%乙醇浸泡過夜，料液比1:20，75 ℃加熱提取，每次2 h，提取3 次，過濾合并醇提液，旋蒸至浸膏。取適量浸膏加蒸餾水超聲溶解，依次用石油醚（500 mL×6）、乙酸乙酯（500 mL×6）、正丁醇（500 mL×6）分級萃取，萃取6 次，萃取液經(jīng)減壓旋蒸至浸膏，備用。提取路線圖如圖1。

圖1 廣金錢草提取路線圖Fig.1 Extraction roadmap from Desmodium styracifolium

1.2.2 總黃酮含量的測定

根據(jù)文獻[14]方法測定，取質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL蘆丁標準液（0.0、0.2、0.8、1.4、2.0、2.6、3.2 mL）于10 mL 試管中，補加甲醇至4 mL，加入0.4 mLm=5% NaNO2溶液和m=10% Al(NO3)3溶液，混勻靜置5 min，再加4 mLm=4% NaOH 溶液，補加甲醇至刻度，反應(yīng)15 min，于510 nm 波長處測吸光度，繪制標準曲線。在相同條件下測定不同極性萃取液的吸光度，求廣金錢草各萃取相中總黃酮含量（mg/g）。

式中：

M——總黃酮含量，mg/g；

C——標準曲線計算出的總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——提取液總體積，mL；

N——稀釋倍數(shù)；

m——樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 總酚含量的測定

根據(jù)文獻[14]的方法測定，取質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL沒食子酸標準液（0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL）于10 mL 試管中，加6 mL 蒸餾水，0.5 mL 福林酚溶液，反應(yīng)5 min，再加1.5 mL 10% Na2CO3溶液，定容至刻度，避光反應(yīng)90 min，于波長760 nm 處測吸光度，繪制標準曲線。在相同條件下測定不同極性萃取液的吸光度，求廣金錢草各萃取相中總酚含量（mg/g），計算方法同公式（1）。

1.2.4 胰脂肪酶抑制活性的測定

根據(jù)文獻[15]的方法測定，按表1 反應(yīng)體系進行，取50 μL（50 mmol/L，pH 值8.0）磷酸緩沖液，50 μL 10 mg/mL 胰脂肪酶溶液和50 μL 樣品溶液，混勻，37 ℃孵育10 min，再加50 μL 0.5 mmol/L 底物月桂酸4-硝基苯酯溶液，37 ℃反應(yīng)20 min，于405 nm 波長處測反應(yīng)體系的吸光度，以O(shè)rlistat 作陽性對照，胰脂肪酶抑制率計算公式為式（2）。

式中：

X——胰脂肪酶抑制率，%；

A1——抑制劑組的吸光度；

A2——緩沖液代替酶液的吸光度，作背景對照組；

A3——緩沖液代替抑制劑的吸光度，作空白組；

A4——緩沖液代替酶液和抑制劑的吸光度，作空白對照組。

1.2.5 膽固醇酯酶抑制活性的測定

根據(jù)文獻[16]的方法測定，按表2 反應(yīng)體系進行，取1 mL（0.1 mol/L，pH 值7.0）緩沖液，50 μL 酶液（100 U、7.2 U/mL），50 μL 樣品溶液和20 μL 4 mmol/L 底物4-硝基苯基丁酸酯于離心管中，混勻，25 ℃反應(yīng)0.5 h，于波長405 nm 處測吸光度，以O(shè)rlistat 作陽性對照。膽固醇酯酶抑制率計算公式同式（2）。

表2 膽固醇酯酶活性反應(yīng)體系Table 2 Reaction system of cholesterol esterase activity

1.2.6α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

根據(jù)文獻[17]修改如下，按表3 反應(yīng)體系進行，取112 μL 磷酸緩沖液（pH 值6.8），50 μL 樣品溶液，20 μL 0.8 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液和8 μL DMSO 于96孔板中，混勻，37 ℃孵育20 min，再加20 μL 10 mmol/L底物pNPG 溶液，反應(yīng)15 min，加80 μL NaCO3溶液終止反應(yīng)，于波長405 nm 處測吸光度，以阿卡波糖作陽性對照。α-葡萄糖苷酶抑制率計算公式同式（2）。

表3 α-葡萄糖苷酶活性反應(yīng)體系Table 3 Reaction system of α-glucosidase activity

1.2.7α-淀粉酶抑制活性的測定

根據(jù)文獻[17]修改如下，按表4 反應(yīng)體系進行，取0.4 mL 樣品溶液和α-淀粉酶（0.3 U/mL），37 ℃反應(yīng)20 min，加入0.4 mLm=5%底物淀粉溶液，混勻，反應(yīng)5 min，再加1 mL 2 mol/L HCl 溶液終止酶活，最后加0.2 mL 0.01 mol/mL 碘標準溶液和5 mL 蒸餾水，于波長660 nm 處測吸光度。以阿卡波糖作陽性對照。α-淀粉酶抑制率計算公式為式（3）。

表4 α-淀粉酶活性反應(yīng)體系Table 4 Reaction system of α-amylase activity

式中：

Y——α-淀粉酶抑制率，%；

A5——抑制劑組的吸光度；

A6——緩沖液代替酶液的吸光度，作背景對照組；

A7——緩沖液代替抑制劑的吸光度，作空白組；

A8——緩沖液代替酶液和抑制劑的吸光度，作空白對照組。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用Prism 8.0.1、Excel 2010 軟件繪圖分析，數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 廣金錢草不同極性萃取物的提取與得率

廣金錢草經(jīng)75%乙醇回流提取，旋蒸得到總浸膏300 g，取浸膏100 g 用蒸餾水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，將各萃取液及剩余水層溶液旋蒸至浸膏，分別得到石油醚相12.86 g，乙酸乙酯相10.00 g，正丁醇相30.50 g，水相31.00 g，得率分別為12.80%、10.00%、30.50%、31.00%。因不同溶劑存在極性差異，對萃取物的得率及化學成分的提取都有一定的影響。

2.2 總黃酮、總酚含量測定

采用比色法方法檢測廣金錢草乙醇提取物及各萃取相中總黃酮和總酚的含量。以吸光度（Y）與樣品濃度（X）作圖，總黃酮量得到方程為Y=10.537X+0.008 6（R2=0.998 7），總酚量計算方程為Y=101.17X+0.035 1（R2=0.998 6）。結(jié)果如圖2、3 所示。廣金錢草中乙酸乙酯相總黃酮及總酚含量最高，分別為154.57、34.27 mg/g，水相總黃酮含量最低為76.98 mg/g，石油醚相總酚含量最低為25.87 mg/g。

圖2 乙醇提取物及各萃取相總黃酮含量Fig.2 Total flavonoids content of ethanol extract and its extraction phase

圖3 乙醇提取物及各萃取相總酚含量Fig.3 Total polyphenol content of ethanol extract and its extraction phase

根據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果可知，總黃酮含量中石油醚相和正丁醇相之間沒有顯著性差異，總酚含量中乙醇提取物和正丁醇相之間沒有顯著性差異，其余各相不同字母之間存在顯著性（P＜0.05）。

2.3 體外降脂活性分析

2.3.1 胰脂肪酶抑制活性的測定

由圖4 可知，廣金錢草乙醇提取物及各萃取相對胰脂肪酶的抑制率隨質(zhì)量濃度增大而增強，呈一定的劑量關(guān)系。當質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL 時，對胰脂肪酶的抑制率表現(xiàn)為：正丁醇相＞水相＞石油醚相＞乙醇提取物＞乙酸乙酯相，其中正丁醇相、水相和石油醚相最高抑制率分別為77.39%、74.32%和60.04%，IC50值分別為2.21、2.62 和2.85 mg/mL。正丁醇萃取相的IC50值最小，抑制率高于陽性對照Orlista（tIC50=2.98 mg/mL）。顯著性分析表明，同一濃度下正丁醇萃取相對胰脂肪酶的抑制作用高于其他相，可見正丁醇萃取相對胰脂肪酶有較好的抑制活性。胰脂肪酶主要由胰腺分泌，是水解膳食脂肪較為重要的酶，它能夠?qū)⑹澄镏械挠椭到鉃楦视秃椭舅醄18]。當胰脂肪酶活性過高時，會使脂質(zhì)含量增加，進而產(chǎn)生血脂異常。因此，抑制胰脂肪酶活性，能夠減少脂質(zhì)代謝，降低機體對脂質(zhì)。香水蓮花雄蕊提取物[19]對胰脂肪酶的抑制活性表現(xiàn)最好的是乙酸乙酯相（IC50=5.64 mg/mL），說明不同藥用植物對其抑制活性不同，可能與所含化學成分的類型有關(guān)。本部分結(jié)果表明廣金錢草對胰脂肪酶有顯著的抑制作用，其中正丁醇萃取相作用最明顯，說明廣金錢草具有潛在的降脂活性。

圖4 乙醇提取物及各萃取相對胰脂肪酶抑制率Fig.4 Inhibition rate of pancreatic lipase of ethanol extract and its extractionphase

2.3.2 膽固醇酯酶抑制活性的測定

膽固醇酯酶可以催化膽固醇酯水解成膽固醇，抑制膽固醇酯酶活性，可降低膽固醇酯的分解，減少人體對膽固醇的利用和吸收，從而實現(xiàn)降血脂作用[20]。圖5 可知，隨質(zhì)量濃度的增加，廣金錢草乙醇提取物及各萃取相對膽固醇酯酶的抑制率逐漸增強。在質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL 時，對膽固醇酯酶的抑制率表現(xiàn)為：乙醇提取物＞石油醚相＞正丁醇相＞乙酸乙酯相＞水相，其中乙醇提取物對膽固醇酯酶的最高抑制率為53.24%，IC50值為2.57 mg/mL，以O(shè)rlistat 為陽性對照測得其對膽固醇酯酶的IC50值為0.092 mg/mL。顯著性分析表明，在同一濃度下不同萃取相對膽固醇酯酶的抑制能力之間差異性顯著，可見抑制膽固醇酯酶的活性物質(zhì)主要富集在乙醇提取物中。乙醇提取的石榴皮多糖[16]對膽固醇酯酶有一定的抑制活性（IC50=25.00 mg/mL），推測是該石榴皮中主要是多糖成分對膽固醇酯酶有較好的抑制作用。而廣金錢草對膽固醇酯酶也有一定的抑制效果，且乙醇提取物對膽固醇酯酶表現(xiàn)出最高的抑制活性。

圖5 乙醇提取物及各萃取相對膽固醇酯酶抑制率Fig.5 Inhibition rate of cholesterol esterase of ethanol extract and its extraction phase

2.4 體外降血糖活性分析

2.4.1α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

由圖6 可知，廣金錢草乙醇提取物及各萃取相對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制活性，在20～100 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，抑制率隨濃度升高而增強，質(zhì)量濃度在100 μg/mL 時，其抑制率大小為：乙醇提取物＞正丁醇相＞石油醚相＞水相＞乙酸乙酯相，它們的IC50值分別為36.69、80.51、81.12、58.44、90.20 μg/mL，乙醇提取物的IC50值最小。顯著性分析表明，在同一濃度下不同萃取相對α-葡萄糖苷酶的抑制能力之間有顯著性差異，乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率高于其他萃取相，表現(xiàn)出較好的抑制活性。研究表明[21]肉桂正丁醇萃取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率能達到100.00%，并表明發(fā)揮其活性的成分主要為鞣質(zhì)類。廣金錢草乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制效果最為明顯，說明廣金錢草中抑制α-葡萄糖苷酶的活性成分主要富集在乙醇提取物中。

圖6 乙醇提取物及各萃取相對α-葡萄糖苷酶抑制率Fig.6 Inhibition rate of α-glucosidase of ethanol extract and its extraction phase

2.4.2α-淀粉酶抑制活性的測定

由圖7 可知，在1～5 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，廣金錢草乙醇提取物及各萃取相對α-淀粉酶抑制效果隨濃度增大而增強，抑制率呈濃度依賴性。其中，石油醚相對α-淀粉酶抑制率上升最為明顯。在質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時，各樣品對α-淀粉酶的抑制率為：石油醚相＞乙醇提取物＞水相＞正丁醇相＞乙酸乙酯相，其中石油醚相對α-淀粉酶的抑制率最高為78.60%，IC50值為2.77 mg/mL，以阿卡波糖為陽性對照測得其對α-淀粉酶的IC50值為0.047 mg/mL。顯著性分析表明，在最高濃度下不同萃取相對α-淀粉酶的抑制能力之間有顯著性差異，總體上石油醚相對α-淀粉酶抑制活性最高。藥用植物乳苣[22]石油醚萃取物也對α-淀粉酶表現(xiàn)出最高的抑制活性。本部分的結(jié)果顯示，石油醚相對α-淀粉酶抑制清除效果最為明顯，說明廣金錢草中抑制α-淀粉酶的活性成分主要富集在石油醚萃取相中。

圖7 乙醇提取物及各萃取相對α-淀粉酶抑制率Fig.7 Inhibition rate of α-amylase of ethanol extract and its extraction phase

3 結(jié)論

本文測定了廣金錢草不同極性萃取物中總黃酮和總酚的含量，并對乙醇提取物及其各萃取相的體外降脂和降血糖活性進行了比較。實驗數(shù)據(jù)顯示，乙酸乙酯萃取相中總黃酮、總酚含量均高于其他萃取相，說明廣金錢草中黃酮類、酚類化合物主要集中在乙酸乙酯萃取相中。廣金錢草各萃取相中化學成分種類不同，發(fā)揮酶的抑制活性作用不同，黃酮、酚類物質(zhì)含量較多的乙酸乙酯相，作用效果并沒有乙醇提取物及其他萃取相明顯。乙醇提取物對膽固醇酯酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，中藥乙醇提取物通常為黃酮、萜類和生物堿等混合成分，本部分的研究結(jié)果說明廣金錢草中除了黃酮類物質(zhì)外，其余成分也參與發(fā)揮作用，混合組分在α-葡萄糖苷酶和膽固醇酯酶抑制方面具有一定的協(xié)同效應(yīng)。正丁醇萃取相對胰脂肪酶表現(xiàn)出較強的抑制活性，抑制率隨濃度增加而增強。石油醚萃取相對α-淀粉酶的抑制率最強，這可能與親脂性強的揮發(fā)油、甾體類等化合物相關(guān)。

綜上所述，廣金錢草對膽固醇酯酶、胰脂肪酶及α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶具有一定的抑制活性，表現(xiàn)出潛在的降脂和降血糖作用。后續(xù)將進一步分離鑒定其發(fā)揮作用的活性成分，深入探討作用機制，為新型降脂、降血糖藥物的研究提供理論參考。