殼聚糖復(fù)合保鮮劑對(duì)熒光假單胞菌的抑菌活性

倪榮，郭雪松，韓艷霞，張妍，李丹丹，張振*

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)食品與健康學(xué)院，遼寧錦州 121000）（2.錦州醫(yī)科大學(xué)生物信息工程學(xué)院，遼寧錦州 121000）

熒光假單胞菌（Pseudomonasfluorescens，P.fluorescens），屬于γ-變形桿菌綱，是冷藏水產(chǎn)品中常見(jiàn)的一類(lèi)革蘭氏陰性菌，可導(dǎo)致水產(chǎn)品的脂肪氧化酸敗，蛋白質(zhì)表達(dá)改變[1]。陶飛燕[2]通過(guò)對(duì)微凍貯藏南美白對(duì)蝦的高通量測(cè)序表明，在貯藏4 周后，假單胞菌屬、希瓦氏菌屬成為各組樣品的優(yōu)勢(shì)菌屬，導(dǎo)致對(duì)蝦腐敗變質(zhì)。

殼聚糖（Chitosan，CS），是甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物，其不易溶解于水，多使用酸性溶液溶解，在酸性溶液中有更強(qiáng)的抑菌性，CS 對(duì)微生物通過(guò)阻隔蛋白質(zhì)的形成，破壞微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，達(dá)到對(duì)食品的抑菌保鮮目的[3]。雖然單一殼聚糖抑菌活性好，但存在抗氧化能力弱、抑菌譜較窄等不足，通過(guò)圍欄理論，加入不同類(lèi)型保鮮劑，形成復(fù)合型保鮮劑起到協(xié)同抑菌效果。ε-聚賴(lài)氨酸（ε-Polylysine，ε-PL）對(duì)各種細(xì)菌、真菌及部分病原體等有廣譜抑菌性，通過(guò)改變細(xì)胞膜的完整性和通透性來(lái)顯示其抗菌活性[4]。D-異抗壞血酸鈉（Sodium D-isoascorbate，D-SE）是食品良好的護(hù)色劑和保鮮劑，能夠有效抑制食品發(fā)生氧化，李月番等[5]表明D-異抗壞血酸鈉對(duì)冷卻牛肉在儲(chǔ)藏期內(nèi)有效抑制微生物及脂質(zhì)的氧化，延長(zhǎng)貨架期。有研究證明聚賴(lài)氨酸-殼聚糖結(jié)合物組合能形成更強(qiáng)的抗菌活性，增加細(xì)胞膜通透性[6]。本文以前期從4 ℃中國(guó)對(duì)蝦中分離得到的優(yōu)勢(shì)腐敗菌P.fluorescens為實(shí)驗(yàn)菌[7]，研究殼聚糖復(fù)合保鮮劑對(duì)P.fluorescens抑菌機(jī)理，先測(cè)定最小抑菌濃度，生長(zhǎng)曲線和抑菌圈，殼聚糖復(fù)合保鮮劑的抑菌能力，然后測(cè)定保鮮劑作用于P.fluorescens的AKP、ATP 酶活力、SEM、蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)，深入探討殼聚糖復(fù)合保鮮劑對(duì)P.fluorescens細(xì)胞膜破壞性，分析殼聚糖復(fù)合保鮮劑對(duì)P.fluorescens的抑菌機(jī)理，為水產(chǎn)品保鮮的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

熒光假單胞菌由實(shí)驗(yàn)前期分離純化得到；殼聚糖（脫乙酰度≥95%），上海阿拉丁科技有限公司；D-異抗壞血酸鈉，江西省德興市百勤異抗壞血酸鈉有限公司；ε-聚賴(lài)氨酸（食品級(jí)，含量≥99.8%），陜西晨明生物科技有限公司；超微量Na+K+-ATP 酶測(cè)試盒、堿性磷酸酶（AKP）測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所；考馬斯亮藍(lán)R-250，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、PBS 緩沖液、戊二醛溶液，購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 主要儀器

SHA-B 水浴恒溫振蕩器，金壇市科系儀器有限公司；VarioskanFlashT 多功能酶標(biāo)儀，山東普朗（DNM-9602G）；GL-25MS 高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀器有限公司；DCodeTM System 蛋白電泳儀，美國(guó)BIO-Rad 公司；ZQPW-70 全溫振蕩培養(yǎng)箱，天津萊玻特瑞；UV1810 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，鑫貝西科學(xué)儀器有限公司；蔡司SIGMA HD 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，德國(guó)卡爾蔡司公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 復(fù)合保鮮劑制備殼聚糖復(fù)合保鮮劑：殼聚糖溶于1.0%（體積分?jǐn)?shù)）的冰乙酸與ε-聚賴(lài)氨酸、D-異抗壞血酸鈉按一定比例復(fù)配，配比質(zhì)量濃度為CS 15 g/L、ε-PL 1.4 g/L、D-SE 1.5 g/L。

1.3.2 最小抑菌濃度測(cè)定（MIC）

根據(jù)劉海晴等[8]方法對(duì)濃度較高的初始保鮮劑以二倍稀釋法分為5 個(gè)梯度，各取100 μL 加入96 孔酶標(biāo)板中再取100 μL 實(shí)驗(yàn)菌株的菌懸液加入不同梯度保鮮液的酶標(biāo)孔里，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，陽(yáng)性對(duì)照組有菌生長(zhǎng)，陰性對(duì)照組無(wú)菌生長(zhǎng)，三次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 抑菌圈測(cè)定

參考Zhang 等[9]的方法，采用濾紙片法測(cè)定保鮮劑對(duì)P.fluorescens的抑制效果。

1.3.4 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定

參考寧亞維等[10]的方法適當(dāng)修改，調(diào)整菌液濃度為105CFU/mL，加入保鮮劑以30 ℃，160 r/min 振蕩培養(yǎng)，12 h 內(nèi)每間隔2 h 測(cè)定600 nm 處吸光值，繪制生長(zhǎng)曲線，另以不添加保鮮劑為對(duì)照組。

1.3.5 細(xì)胞膜完整性測(cè)定

參考于曉慧等[11]的方法略作改動(dòng)，調(diào)整菌液濃度為105CFU/mL，處理后菌懸液中加入等量保鮮劑，置于30 ℃，160 r/min 搖床中震蕩培養(yǎng)，12 h 內(nèi)每間隔2 h 培養(yǎng)液離心，取上清液，用紫外分光光度計(jì)于260 nm 處測(cè)定吸光值，以無(wú)菌生理鹽水代替保鮮劑作為對(duì)照組。

1.3.6 菌體AKP、ATP 酶活性測(cè)定

按照AKP、ATP 測(cè)定試劑盒說(shuō)明分別測(cè)量細(xì)菌胞內(nèi)堿性磷酸酶含量（AKP）、三磷酸腺苷（ATP）含量。

1.3.7 復(fù)合保鮮劑對(duì)細(xì)菌微觀形態(tài)的影響

參考Wei 等[12]的方法，進(jìn)行適當(dāng)修改：調(diào)整菌液濃度為105CFU/mL，處理組加入保鮮劑，對(duì)照組加入滅菌的生理鹽水，在30 ℃，170 r/min 培養(yǎng)12 h后，各組菌液6 000 r/min 離心10 min，棄上清液，PBS 沖洗菌體沉淀三次，隨后用2.5%（V/V）戊二醛于4 ℃固定12 h，用無(wú)菌水洗滌和離心兩次后，梯度乙醇脫水，離心，37 ℃下干燥72 h。噴灑金后，通過(guò)SEM 對(duì)細(xì)菌的微觀形態(tài)進(jìn)行表征，未經(jīng)處理的細(xì)菌作為對(duì)照組。

1.3.8 SDS-PAGE

參考Li等[13]的方法，處理各組菌液與保鮮劑進(jìn)行培養(yǎng)后，按照SDS-PAGE 凝膠試劑盒說(shuō)明制膠、脫色，拍照記錄。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Graphpad Prism 8 和Excel 2010 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析及繪圖，不同試驗(yàn)均進(jìn)行3 次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

以從冷藏中國(guó)對(duì)蝦中分離出來(lái)的熒光假單胞菌為測(cè)試菌，對(duì)一定濃度的復(fù)合保鮮劑，進(jìn)行二倍稀釋后測(cè)定OD600吸光值，得到復(fù)合保鮮劑的最小抑菌濃度，結(jié)果如表1 所示。

表1 殼聚糖復(fù)合保鮮劑的最小抑菌濃度Table 1 Minimum inhibitory concentration of chitosan composite preservatives

從表1 可以看出，當(dāng)殼聚糖復(fù)合保鮮劑質(zhì)量濃度為1.12 mg/mL 時(shí)測(cè)得的吸光值與陽(yáng)性對(duì)照管相同，說(shuō)明在此質(zhì)量濃度下有菌生長(zhǎng)，從而得出復(fù)合保鮮劑對(duì)熒光假單胞菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為2.24 mg/mL。

2.2 抑菌圈的測(cè)定

殼聚糖復(fù)合保鮮劑對(duì)P.fluorescens的抗菌性能如圖1 所示。四組實(shí)驗(yàn)組對(duì)菌都有抑制作用，0.56 mg/mL組作用于菌的抑菌圈直徑為7.8 mm，而1.12 mg/mL組與2.24 mg/mL 組都有較好的抑菌能力抑菌圈直徑分別為8.83、10.83 mm，4.48 mg/mL 組的抑菌能力非常明顯，抑菌圈直徑13.2 mm，抑菌圈直徑顯著（P＜0.05）高于其它處理組，說(shuō)明殼聚糖復(fù)合保鮮劑對(duì)P.fluorescens有很好的抑菌性。

2.3 殼聚糖復(fù)合保鮮劑對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響

細(xì)菌生長(zhǎng)曲線在一定條件下，表現(xiàn)出微生物的生長(zhǎng)規(guī)律，通過(guò)測(cè)定生長(zhǎng)曲線的變化，表征復(fù)合保鮮劑對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響，如圖2，通過(guò)OD600nm下紫外吸收值的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，隨著復(fù)合保鮮劑濃度的增加，對(duì)菌體生長(zhǎng)曲線的影響越明顯，對(duì)照組的菌體（CK）生長(zhǎng)狀況良好，隨著復(fù)合保鮮劑濃度的增加，OD600的吸收值受到抑制，2.24 mg/mL 質(zhì)量濃度下，吸收值變化與0 h 時(shí)變化不明顯，表明此濃度使細(xì)菌生長(zhǎng)得到抑制，與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果是相一致的，低于2.24 mg/mL 質(zhì)量濃度的實(shí)驗(yàn)組，OD600值有所增加，但低于對(duì)照組。結(jié)果表明2.24 mg/mL 是最適抑菌濃度，為后續(xù)展開(kāi)抑菌機(jī)理研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖2 殼聚糖復(fù)合保鮮劑對(duì)熒光假單胞菌的生長(zhǎng)曲線影響Fig.2 Effect of chitosan compound preservative on growth curve of P. fluorescens

2.4 殼聚糖復(fù)合保鮮劑對(duì)菌液紫外吸收的影響

細(xì)胞膜保護(hù)細(xì)胞，控制細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的進(jìn)出，核酸等大分子物質(zhì)無(wú)法通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞壁膜的微孔道進(jìn)出，但在細(xì)胞膜破壞后，細(xì)胞內(nèi)容物極易外滲，其中大分子物質(zhì)中的DNA、RNA 在260 nm 處具有強(qiáng)吸收值，因此，通過(guò)測(cè)定細(xì)菌在260 nm 的吸收物質(zhì)量，確定保鮮劑對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜完整性的破壞強(qiáng)度[14]。由圖3可知，對(duì)照組OD260隨著時(shí)間增加與0 h 吸收值相對(duì)變化不顯著（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組中OD260值隨著各組作用時(shí)間的增加而增大，4 h 前各質(zhì)量濃度組初期OD260值并沒(méi)有明顯區(qū)別，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在4 h之后，各質(zhì)量濃度之間有明顯差異，該結(jié)果與張楠楠[15]研究ε-賴(lài)氨酸對(duì)腐敗希瓦氏菌的紫外吸收結(jié)果相似。0.56 mg/mL 組菌懸液的OD260值與CK 組OD260值整體無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明0.56 mg/mL 質(zhì)量濃度對(duì)于菌體細(xì)胞膜的破壞作用較小，OD260值變化不明顯。加入2.24 mg/mL 和4.48 mg/mL 質(zhì)量濃度的菌液OD260值隨著時(shí)間的增加迅速上升，顯著高于其它組（P＜0.05）。結(jié)果初步表明殼聚糖復(fù)合保鮮劑能夠破壞熒光假單胞菌體細(xì)胞膜的完整性，使菌體內(nèi)核酸等內(nèi)容物外滲。

圖3 殼聚糖復(fù)合保鮮劑對(duì)熒光假單胞菌的紫外吸收的影響Fig.3 Effects of chitosan compound preservatives on UV absorption of P. fluorescens

2.5 殼聚糖復(fù)合保鮮劑對(duì)假單胞菌AKP 和ATP 酶活性的影響

由圖4a 可見(jiàn)，各處理組處理后的Na+、K+-ATP酶活力顯著低于CK 組（P＜0.05），說(shuō)明殼聚糖復(fù)合保鮮劑能夠?qū)?xì)菌的細(xì)胞膜進(jìn)行破壞，并顯著抑制ATP 酶活力。處理組之間ATP 酶的活力也存在顯著性差異（P＜0.05），而經(jīng)4.48 mg/mL 組處理后的ATP酶的活力遠(yuǎn)低于各組的Na+、K+-ATP 酶活力值，抑制能力突出。說(shuō)明殼聚糖復(fù)合保鮮劑處理后，抑制了酶活力，造成ATP 能量不能正常供給，從而導(dǎo)致細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝被阻礙，進(jìn)而菌體死亡。此項(xiàng)研究表明殼聚糖復(fù)合保鮮劑能夠破壞菌體細(xì)胞膜的完整性，造成ATP 酶活力降低，有效抑制假單胞菌的生長(zhǎng)繁殖。徐宇辰[16]研究表明阿魏酸甲酯作用于腐敗希瓦氏菌會(huì)降低ATP 酶活力，破壞細(xì)胞膜完整性。由圖4b 可見(jiàn)，經(jīng)各處理組處理后的細(xì)菌AKP酶活力顯著低于CK組（P＜0.05），各處理組之間AKP 酶活力值也存在顯著性差異（P＜0.05），說(shuō)明殼聚糖復(fù)合保鮮劑抑制菌體AKP 酶活力的能力顯著有效，這與王明等[17]研究結(jié)果相似。分析認(rèn)為，殼聚糖與ε-聚賴(lài)氨酸在進(jìn)入菌體的細(xì)胞壁膜后，抑制生物膜形成，破壞細(xì)菌生長(zhǎng)代謝[18,19]。因此ATP 與AKP 酶的活力降低，可能是保鮮劑進(jìn)入菌體內(nèi)部，通過(guò)破壞了細(xì)菌生長(zhǎng)代謝環(huán)境，抑制酶的活性，破壞了菌體細(xì)胞膜的完整性。殼聚糖復(fù)合保鮮劑通過(guò)三種保鮮劑復(fù)配使用具有協(xié)同效果，抑菌性更強(qiáng)。

圖4 殼聚糖復(fù)合保鮮劑對(duì)假單胞菌Na+/K+-ATP 酶(a)和AKP 酶活性的變化(b)Fig.4 Changes of chitosan complexes on Na+/K+-ATPase (a) and AKP enzyme activities (b) of P. fluorescens

2.6 殼聚糖復(fù)合保鮮劑對(duì)菌體微觀形貌的影響

各處理組對(duì)P.fluorescens的微觀形貌見(jiàn)圖5 可知，未經(jīng)處理對(duì)照組（CK）每一個(gè)單菌落形態(tài)完整，均勻分布。但隨著抑菌濃度增加，能看到菌體出現(xiàn)明顯的凹陷、內(nèi)容物外滲、菌體之間粘連聚團(tuán)等現(xiàn)象。分析認(rèn)為，殼聚糖復(fù)合保鮮劑的抑菌機(jī)理是因?yàn)棣?聚賴(lài)氨酸與D-異抗壞血酸鈉的加入，改善了單一殼聚糖的性能，使膜的有序性增強(qiáng)，殼聚糖分子中的-NH2質(zhì)子化-NH3+與細(xì)菌細(xì)胞壁膜上的脂多糖帶負(fù)電的陰離子結(jié)合增強(qiáng)靜電作用能力[20,21]，改變了細(xì)菌的通透性，保鮮劑作用菌體后，可能使內(nèi)容物中的多糖類(lèi)物質(zhì)外滲，造成菌體成團(tuán)狀聚集出現(xiàn)，通過(guò)微觀結(jié)構(gòu)驗(yàn)證了殼聚糖復(fù)合保鮮劑對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞壁，細(xì)胞膜完整性有一定破壞性。

圖5 殼聚糖復(fù)合保鮮劑處理后熒光假單胞菌的SEM 圖Fig.5 SEM image of Pseudomonas fluorescens treated with chitosan composite preservative

2.7 SDS 電泳蛋白

蛋白質(zhì)是生命體完整活動(dòng)的重要承擔(dān)者，參與生命體的代謝及生長(zhǎng)，通過(guò)測(cè)定細(xì)菌的蛋白質(zhì)可以得知細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況，側(cè)面反映保鮮劑的抑菌效果。結(jié)果如圖6 所示，CK 組的蛋白條帶完整清晰且顏色較深，而經(jīng)0.56、1.12、2.24 mg/mL 組處理的蛋白條帶與對(duì)照組相比數(shù)量無(wú)明顯變化但顏色變淺且條帶變窄。4.48 mg/mL 組的蛋白條帶與其它組相比有明顯差異，蛋白條帶顏色非常淺，分子質(zhì)量在11～25 ku 之間的蛋白條帶消失，說(shuō)明復(fù)合保鮮劑對(duì)細(xì)菌合成蛋白的抑制能力強(qiáng)，結(jié)合掃描電鏡結(jié)果，初步判斷復(fù)合保鮮劑通過(guò)影響菌體細(xì)胞的完整性和通透性，導(dǎo)致內(nèi)容物外泄，大分子合成機(jī)制受阻，蛋白質(zhì)成分及含量減少，最終實(shí)現(xiàn)抑制菌體生長(zhǎng)。

圖6 殼聚糖復(fù)合保鮮劑處理后熒光假單胞菌的電泳圖Fig.6 Electrophoresis of Pseudomonas fluorescens treated with chitosan composite preservative

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以配比質(zhì)量濃度殼聚糖15 g/L、ε-賴(lài)氨酸1.4 g/L、D-異抗壞血酸鈉1.5 g/L 為殼聚糖復(fù)合保鮮劑，MIC 質(zhì)量濃度為 2.24 mg/mL，作用于P.fluorescens，研究保鮮劑的抑菌活性及作用機(jī)理。研究表明，殼聚糖復(fù)合保鮮劑可以有效抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，破壞細(xì)胞膜的完整性以及阻礙蛋白質(zhì)合成，Na+、K+-ATP 酶和AKP 酶活力被顯著抑制，保鮮劑通過(guò)影響細(xì)菌代謝及表達(dá)進(jìn)一步使細(xì)菌死亡達(dá)到抑菌目的。經(jīng)殼聚糖復(fù)合保鮮劑處理后的菌體表面發(fā)生凹陷、內(nèi)容物流出、菌體聚集成團(tuán)的現(xiàn)象。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了殼聚糖復(fù)合保鮮劑對(duì)熒光假單胞菌有著良好的抑菌性能，為該可食性涂膜保鮮劑的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。