佤藥遠(yuǎn)志醇提物對(duì)斑馬魚的助眠作用

余熙，趙智全，吳海強(qiáng)，吳序櫟

（1.深圳市創(chuàng)華生物醫(yī)藥有限公司，廣東深圳 518000）（2.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，廣東深圳 518000）（3.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東深圳 518000）

失眠是所有年齡段最常見的睡眠障礙[1]，通常表現(xiàn)為不易入睡，睡后易醒，睡眠深度或頻度過(guò)短、早醒及睡眠時(shí)間不足或質(zhì)量差等，長(zhǎng)時(shí)間的失眠會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)衰弱和抑郁癥，對(duì)患者生活造成極大影響[2,3]。現(xiàn)代生活節(jié)奏快、作息不規(guī)律、心理壓力大，大多數(shù)人處于亞健康狀態(tài)，幾乎都有過(guò)失眠經(jīng)歷，慢性失眠病程長(zhǎng)，可長(zhǎng)達(dá)10 年以上，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量和身心健康[4-6]。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）調(diào)查結(jié)果顯示，全球?qū)⒔?/3 的人深受睡眠障礙問題困擾[5-7]?！吨袊?guó)睡眠研究報(bào)告（2022）》顯示，64.75%的國(guó)人每天實(shí)際睡眠時(shí)長(zhǎng)不足8 h[8]。流行病學(xué)研究表明，我國(guó)約有45.4%的老年人存在睡眠障礙問題[9]，成年人失眠發(fā)生率高達(dá)38.2%，已超過(guò)歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家，并且呈上升趨勢(shì)[10,11]。

目前，治療失眠的藥物主要是指西藥安眠藥，如安定、佐匹克隆片、思諾思等，但需頻繁用藥和長(zhǎng)期服用，其不良反應(yīng)如中樞神經(jīng)紊亂、依賴性、記憶力下降、性格改變、腎臟損害等問題也較多[12]。相較之下，中藥治療失眠的優(yōu)勢(shì)尤其突出，藥物的副作用小，對(duì)機(jī)體的傷害較小，比較適合長(zhǎng)期調(diào)理服用，既不會(huì)形成藥物依賴，也不會(huì)出現(xiàn)藥物的戒斷反應(yīng)，可以依據(jù)病情隨時(shí)停藥[2]。中藥治療失眠是從病因入手，從根源上治療，同時(shí)還可以改善機(jī)體的身體素質(zhì)，效果顯著且具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[13]。

佤族醫(yī)藥作為我國(guó)民族醫(yī)藥的重要組成部分，其藥食同源是佤族醫(yī)藥的一大特色，是沿用至今的保健及治療方法[14]。佤藥遠(yuǎn)志（Polygalatenuifolia），又名娘母良（Polygalacrotalarioides，佤文：Nya Miex Tiang），屬遠(yuǎn)志科遠(yuǎn)志屬多年生草本植物，為佤族稀有珍貴藥材，也是一味中醫(yī)常用的中藥，性善疏泄通達(dá)，是交通心腎、安定神志之佳品，具有益智安神的功效[15-17]。臨床上常應(yīng)用于治療失眠多夢(mèng)，健忘驚悸、腎虛陽(yáng)萎、宮寒帶下等癥，并且佤族民間早已驗(yàn)證其強(qiáng)壯、增力、抗疲勞等作用[15-17]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其主要成份細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷能通過(guò)抑制去甲腎上腺素，增強(qiáng)對(duì)小鼠的催眠作用，是遠(yuǎn)志發(fā)揮鎮(zhèn)靜安神效果的主要物質(zhì)之一[18-20]。

當(dāng)前，隨著我國(guó)居民生活水平不斷提高，消費(fèi)升級(jí)，人們的保健意思不斷增強(qiáng)，健康產(chǎn)業(yè)具有廣闊的發(fā)展前景[21]。因此，開發(fā)一款綠色健康、安全性高的睡眠友好型保健食品，意義非常重大，市場(chǎng)前景非常廣闊。本文選取佤藥遠(yuǎn)志為研究對(duì)象，采用高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)遠(yuǎn)志的主要活性成分及含量，以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，比較其不同劑量對(duì)于改善睡眠的作用，旨在探索佤藥遠(yuǎn)志的助眠功效，為針對(duì)性治療失眠，遠(yuǎn)志深加工及開發(fā)保健食品提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

遠(yuǎn)志，產(chǎn)于云南，購(gòu)自西安天行健天然生物制品有限公司；野生型AB 品系斑馬魚（許可證號(hào)為：SYXK(浙)2022-0004 ）；遠(yuǎn)志酮 III（批號(hào)111850-202006）、3,6’-二芥子?；崽牵ㄅ?hào)111848-202006）對(duì)照品，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷（批號(hào)LP12560）對(duì)照品，購(gòu)自河南標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)中心；二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO；批號(hào)BCCD8942），購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；褪黑素（批號(hào)F1804064），購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；戊四唑（Pentylenetetrazole，PTZ；批號(hào)A27O8L46880），購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；3516 六孔板，購(gòu)自美國(guó)Corning Incorporated 公司；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，購(gòu)自廣州彼西絡(luò)科技有限公司；色譜分析用水為娃哈哈純凈水，其它實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

LC-2030C（3D）高效液相色譜儀，日本Shimadzu公司；CP214 精密電子天平，美國(guó)OHAUS 公司；電熱恒溫干燥箱，上海昕?jī)x儀器儀表有限公司；1000Y高速多功能粉碎機(jī)，歐橡；98-1-1-B 型電子調(diào)溫電熱套，天津市泰斯特儀器有限公司；SB25-12DTD 型超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；JK-VWS 振動(dòng)篩，上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司；SZX7解剖顯微鏡，日本OLYMPUS 公司；Zebra Lab 3.22.3.31 行為分析儀，法國(guó)ViewPoint Life Sciences 公司；VertA1CCD 相機(jī)，上海土森視覺科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 遠(yuǎn)志醇提物制備稱取50 g 遠(yuǎn)志粉碎，過(guò)三號(hào)篩后，置于圓底燒瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)65%乙醇200 mL，煮沸1 h，放冷，搖勻后濾過(guò)，取沉淀物重復(fù)提取2 次，最后合并3 次上清液濃縮至20 mL，得遠(yuǎn)志乙醇提取物（2.5 g/mL）。

1.3.2 遠(yuǎn)志醇提物活性成分檢測(cè)

1.3.2.1 對(duì)照品溶液制備

參照《中國(guó)藥典》2020 年版，分別取細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對(duì)照品2.0 mg、遠(yuǎn)志酮III 對(duì)照品1.5 mg、3,6’-二芥子?；崽菍?duì)照品2.0 mg，精密稱定，甲醇溶解并超聲，搖勻，最后加甲醇稀釋得細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷1 mg/mL、遠(yuǎn)志酮III 0.15 mg/mL、3,6’-二芥子?；崽?.2 mg/mL，用0.22 μm 微孔濾膜抽濾之后，再進(jìn)樣。

1.3.2.2 供試品溶液制備

按“1.3.1”項(xiàng)下原材料預(yù)處理方法制備遠(yuǎn)志提取物，取1 mL 遠(yuǎn)志提取物置于100 mL 量瓶中，加蒸餾水溶解并搖勻，稀釋至刻度，得供試品母液。精密吸取供試品母液1 mL，加蒸餾水稀釋至1 mg/mL，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜后，再進(jìn)樣。

1.3.2.3 色譜條件

參照《中國(guó)藥典》2020 年版測(cè)定細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量[22]。色譜條件：檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；色譜柱為ShimNex CS C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.05%磷酸溶液（70:30，V/V）；柱溫25 ℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.3 不同質(zhì)量濃度遠(yuǎn)志醇提物改善睡眠作用

1.3.3.1 PTZ 誘導(dǎo)的斑馬魚失眠模型的建立

隨機(jī)選取野生型AB 品系斑馬魚（自然成對(duì)交配繁殖，年齡為受精后5 d）于六孔板中，每孔容量3 mL，600 μg/mL 戊四唑刺激1 h，建立PTZ 斑馬魚失眠模型。

1.3.3.2 斑馬魚最大耐受濃度測(cè)定（Maximum Talerated Concentration，MTC）

測(cè)定MTC 參考文獻(xiàn)[23]的方法并略有修改。設(shè)置正常對(duì)照組、PTZ 模型對(duì)照組以及5 個(gè)不同質(zhì)量濃度遠(yuǎn)志醇提物處理組（125、250、500、1 000、2 000 μg/mL）。每組隨機(jī)挑選30 尾斑馬魚置于六孔板中，每孔30 尾，每孔容量為3 mL。28 ℃處理1 d 后，觀察統(tǒng)計(jì)各組斑馬魚死亡數(shù)量和死亡率，測(cè)定MTC。

1.3.3.3 遠(yuǎn)志醇提物改善斑馬魚失眠功效實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[23]設(shè)計(jì)遠(yuǎn)志醇提物改善斑馬魚失眠功效實(shí)驗(yàn)，有修改。將隨機(jī)選取的斑馬魚置于六孔板中，每孔30 尾斑馬魚，每孔容量為3 mL。設(shè)置正常對(duì)照組和PTZ 模型對(duì)照組，另選取斑馬魚失眠模型，設(shè)置4 個(gè)不同質(zhì)量濃度遠(yuǎn)志醇提物處理組（125、250、500、1 000 μg/mL）以及陽(yáng)性對(duì)照褪黑素質(zhì)量濃度組125 μg/mL（見表2）。28 ℃處理1 d 后，每組隨機(jī)取10 尾斑馬魚采集數(shù)據(jù)，分析斑馬魚覺醒活動(dòng)量（D）和覺醒總時(shí)間（S），以此來(lái)評(píng)價(jià)遠(yuǎn)志的助眠作用。助眠作用計(jì)算公式如下：

式中：

ER——遠(yuǎn)志醇提物改善斑馬魚睡眠作用率，%；

D0——模型組斑馬魚覺醒活動(dòng)量，mm；

D1——處理組斑馬魚覺醒活動(dòng)量，mm。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-way ANOVA），進(jìn)行各個(gè)實(shí)驗(yàn)組間的差異分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SE）表示。通過(guò)GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，P＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 遠(yuǎn)志醇提物活性成分含量測(cè)定

按“1.3.2.1”和“1.3.2.2”項(xiàng)下方法，分別制備對(duì)照品及供試品溶液，按“1.3.2.3”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，面積歸一法計(jì)算遠(yuǎn)志樣品中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志酮III、3,6’-二芥子酰基蔗糖的含量。結(jié)果顯示細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.61%、遠(yuǎn)志酮III 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.01%、3,6’-二芥子?；崽堑馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)為38.78%（表1）。2020 年版藥典以要求細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量不低于2%，遠(yuǎn)志酮III 含量不低于0.15%、3,6’-二芥子?；崽呛坎坏陀?.5%，本實(shí)驗(yàn)方法所提取的遠(yuǎn)志的主要活性成分遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于藥典要求。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與張琳等[22]研究結(jié)果相比，三種主要活性成分均高于其研究的5 種野生遠(yuǎn)志。大量研究表明，遠(yuǎn)志屬植物化學(xué)成分類型非常豐富，主要含有皂苷、糖酯、酮類、生物堿、香豆素類等活性成分。本實(shí)驗(yàn)所用藥材遠(yuǎn)志的三種主要活性成分細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志酮III、3,6’-二芥子?；崽呛扛?，質(zhì)量合格，其中3,6’-二芥子?；崽堑拇x產(chǎn)物主要為3,4,5-三甲氧基肉桂酸（TMCA），而TMCA 具有鎮(zhèn)靜催眠的作用[24]，細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷能夠通過(guò)調(diào)節(jié)γ氨基丁酸（GABA）能系統(tǒng)增強(qiáng)對(duì)小鼠的助眠作用[18]。因此，本文將進(jìn)一步通過(guò)建立PTZ 誘導(dǎo)的斑馬魚模型，對(duì)遠(yuǎn)志進(jìn)行改善睡眠功效評(píng)價(jià)。

表1 遠(yuǎn)志醇提物主要成分表Table 1 Analysis of Polygala tenuifolia alcohol extract components

2.2 斑馬魚最大檢測(cè)濃度（MTC）

當(dāng)遠(yuǎn)志質(zhì)量濃度在125～1 000 μg/mL 時(shí)，處理組與正常對(duì)照組狀態(tài)相似，沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；當(dāng)遠(yuǎn)志質(zhì)量濃度為2 000 μg/mL 時(shí)，處理組5 與正常對(duì)照組相比，狀態(tài)較差，且有斑馬魚死亡現(xiàn)象，死亡率為3%。因此將改善睡眠功效MTC定為1 000 μg/mL，詳見表2。

表2 遠(yuǎn)志醇提物改善睡眠功效質(zhì)量濃度摸索實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=30）Table 2 Polygala tenuifolia alcohol extract improved sleep efficacy concentration and explored the experimental results

2.3 遠(yuǎn)志醇提物改善PTZ 模型斑馬魚行為

如圖1 所示，通過(guò)分析PTZ 模型斑馬魚行為軌跡發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，PTZ 模型對(duì)照組的斑馬魚運(yùn)動(dòng)狀態(tài)明顯活躍，與PTZ 模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照褪黑素組有效減少了PTZ 模型組斑馬魚活動(dòng)量，這表明成功建立了PTZ 誘導(dǎo)的斑馬魚失眠模型。通過(guò)每組30 尾斑馬魚的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)遠(yuǎn)志醇提物處理之后，與PTZ 模型組相比，各處理組的斑馬魚躁狂癥均有不同程度的緩解，其中1 000 μg/mL 遠(yuǎn)志醇提物相比陽(yáng)性對(duì)照褪黑素組，改善睡眠效果更加顯著。結(jié)果表明，遠(yuǎn)志醇提物具有一定的改善睡眠的功效。

圖1 不同質(zhì)量濃度遠(yuǎn)志醇提物處理后斑馬魚運(yùn)動(dòng)軌跡典型圖Fig.1 Typical movement trajectories of zebrafish after treatment with different concentrations

2.4 遠(yuǎn)志醇提物改善PTZ 模型斑馬魚睡眠功效評(píng)價(jià)

如表3 所示，通過(guò)分析斑馬魚覺醒活動(dòng)時(shí)間和活動(dòng)量發(fā)現(xiàn)，PTZ 模型對(duì)照組中，斑馬魚覺醒時(shí)間（13.7 s）和覺醒活動(dòng)量（531 mm），均遠(yuǎn)高于正常對(duì)照組的覺醒活動(dòng)時(shí)間（1.82 s，P＜0.001）和覺醒活動(dòng)量（45.7 mm，P＜0.001），與PTZ 模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性褪黑素組的覺醒活動(dòng)時(shí)間（9.30 s，P＜0.05）和覺醒活動(dòng)量（377 mm，P＜0.05）明顯減少，這表明成功建立了PTZ 誘導(dǎo)的斑馬魚失眠模型。陽(yáng)性褪黑素組改善睡眠作用為29.00%，遠(yuǎn)志醇提物4 個(gè)質(zhì)量濃度處理組（125、250、500、1 000 μg/mL）改善睡眠作用依次為6.97%、22.78%、33.14%、47.26%，其中質(zhì)量濃度為500 μg/mL 和1 000 μg/mL 的遠(yuǎn)志改善睡眠作用明顯優(yōu)于陽(yáng)性褪黑素組。結(jié)果表明遠(yuǎn)志醇提物對(duì)PTZ 誘導(dǎo)的斑馬魚失眠癥狀具有明顯的改善作用，但是在一定濃度范圍內(nèi)，呈劑量依賴性，濃度越高，作用越明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與陸婷婷[16]、任小娟等[25]研究結(jié)果相似，均表明遠(yuǎn)志具有助眠作用。遠(yuǎn)志對(duì)斑馬魚的助眠作用可能與其主要活性成分細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷和3,6’-二芥子?；崽怯嘘P(guān)，具體機(jī)制還需更深層次探索。

表3 不同質(zhì)量濃度遠(yuǎn)志醇提物改善睡眠功效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=10）Table 3 Experimental results of different concentrations of Polygala tenuifolia alcohol extract to improve sleep efficacy

3 結(jié)論

綜上所述，本文通過(guò)建立斑馬魚失眠模型，測(cè)定MTC，將改善睡眠功效MTC 定為1 000 μg/mL。采用MTC 設(shè)置給藥濃度，研究斑馬魚的行為軌跡，結(jié)果表明遠(yuǎn)志醇提物各質(zhì)量濃度處理組與PTZ 模型對(duì)照組相比均有不同程度的改善。通過(guò)分析斑馬魚覺醒活動(dòng)量和覺醒總時(shí)間，以此來(lái)評(píng)價(jià)遠(yuǎn)志鎮(zhèn)靜安神、改善失眠功效。結(jié)果顯示陽(yáng)性褪黑素組改善睡眠作用為29.00%，遠(yuǎn)志醇提物4 個(gè)質(zhì)量濃度處理組（125、250、500、1 000 μg/mL）改善睡眠作用依次為6.97%、22.78%、33.14%、47.26%，其中質(zhì)量濃度為500 μg/mL和1 000 μg/mL 的遠(yuǎn)志醇提物改善睡眠作用明顯優(yōu)于陽(yáng)性褪黑素組。研究結(jié)果表明遠(yuǎn)志醇提物具有鎮(zhèn)靜安神的功效，能夠改善睡眠障礙，但在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，呈劑量依賴性。本文對(duì)于遠(yuǎn)志醇提物改善睡眠作用的機(jī)制尚未進(jìn)行更深入的研究，后續(xù)還需要對(duì)遠(yuǎn)志進(jìn)行更加細(xì)致的探索，為未來(lái)遠(yuǎn)志的臨床應(yīng)用和食品保健等提供參考依據(jù)。