黑米花青素對(duì)食源性肥胖小鼠脂代謝紊亂及腸道菌群的影響

王蕾，孫漢巨，劉淑蕓，高玲艷，顧滎熒

（合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽合肥 230000）

作為一種全球性的流行病，肥胖與健康并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，包括高脂血癥、2 型糖尿病、心血管疾病和某些癌癥[1]。流行病學(xué)證據(jù)表明，高脂肪飲食（HFD）會(huì)促進(jìn)肥胖和相關(guān)代謝紊亂的發(fā)展，并且飲食中的脂肪含量與肥胖程度之間存在直接關(guān)系[2]。

脂代謝與肥胖癥關(guān)系密切，脂代謝紊亂是其發(fā)病機(jī)制之一。脂代謝紊亂會(huì)引起諸如肥胖、高血脂癥、非酒精性脂肪肝等多種疾病[3]。而肥胖癥自身又可導(dǎo)致脂類代謝紊亂，從而形成一種惡性循環(huán)。此外，肥胖會(huì)導(dǎo)致參與脂質(zhì)代謝的酶和激素的異常表達(dá)。肥胖患者脂肪組織中的脂肪酸水解酶及對(duì)激素敏感性的脂肪酸酯酶活力下降，使脂肪組織中的脂肪分解能力下降[4]。肥胖會(huì)造成脂肪細(xì)胞激素分泌異常，血漿中甘油三酯和膽固醇的水平升高，脂蛋白代謝異常，從而使脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)異常的激素（如瘦素、脂聯(lián)素等）的水平降低，導(dǎo)致脂代謝異常[5]。脂質(zhì)代謝異常還與誘導(dǎo)游離脂肪酸的釋放有關(guān)，游離脂肪酸釋放會(huì)增加空腹血漿TAG 濃度，降低高密度脂蛋白和膽固醇，并改變低密度脂蛋白[6]。天然植物提取物由于其各種生物活性和無副作用，已被證明在預(yù)防和臨床管理肥胖及其合并癥方面是安全有效的[7]。

花青素是一類廣泛存在于水果和蔬菜中的水溶性黃酮類化合物，通常母體以2-苯基苯并吡喃陽離子的形式呈現(xiàn)，穩(wěn)定性較差[8]。花青素具有多種生物活性，如抗氧化性、抗炎、抑菌性、抗腫瘤等[9,10]。近年來花青素被確定為脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)劑，是降低代謝綜合征風(fēng)險(xiǎn)的潛在候選者[11]。大部分花青素不能在上消化道被吸收，從而到達(dá)大腸，在那里它們被腸道微生物群生物轉(zhuǎn)化為其代謝物，然后被吸收[12]?；ㄇ嗨匾脖徽J(rèn)為是具有益生元活性的物質(zhì)。它們可促進(jìn)益生菌的生長，抑制有害細(xì)菌的生長，改善腸道微生態(tài)[13]。有充分證據(jù)表明，腸道菌群在維持能量平衡和正常物質(zhì)代謝的過程中也發(fā)揮著重要作用[14]。因此，也有學(xué)者認(rèn)為腸道菌群不僅與脂代謝有密切關(guān)系，也和肥胖的發(fā)生有潛在聯(lián)系。目前已有研究比較了超重和體脂偏低個(gè)體的擬桿菌門和厚壁菌門的豐度[15]，結(jié)果表明超重受試者和體脂偏低受試者之間腸道微生物群有顯著差異，與超重組相比，體脂偏低個(gè)體的長雙歧桿菌和厚壁菌門豐度更高。厚壁菌門與擬桿菌門的比例越增加，肥胖發(fā)生的機(jī)率越大。有研究表明黑加侖花青素緩解了HFD 誘導(dǎo)的肥胖、高脂血癥和肝脂肪變性。此外，黑加侖花青素補(bǔ)充劑通過調(diào)節(jié)與脂質(zhì)和膽固醇的合成和降解相關(guān)的基因的表達(dá)來改善肝脂代謝。微生物分析表明，補(bǔ)充黑加侖花青素顯著改變了腸道微生物群的整體結(jié)構(gòu)和組成[16]。因此花青素可能通過影響腸道菌群的組成來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。本研究旨在研究黑米花青素（BRE）對(duì)HFD 喂養(yǎng)小鼠脂代謝紊亂的調(diào)節(jié)機(jī)制及腸道菌群組成的影響。

1 材料與方法

1.1 原料

黑米花青素粗提物（矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞35%），購于天津康友生物有限公司。茶多酚購于山東思揚(yáng)生物科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

全波長掃描酶標(biāo)儀，美國Thermo 公司；高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑米花青素的鑒定

黑米提取物中花青素的鑒定采用安捷倫1260 UPLC 系統(tǒng)（安捷倫，美國）和LC-ESI-MS/MS 電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜（安捷倫，美國）進(jìn)行鑒定。二極管陣列檢測(cè)器為520 nm?；ㄇ嗨厥褂肁gilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm）分離，流速為0.2 mL/min。流動(dòng)相由A（水:甲酸=90:10，V/V）和B（乙腈）組成。0～5 min，95%～90% A；5～10 min，90% A；10～17 min，90%～76% A；17～27 min，76%～10% A；27～30 min，10% A；30～35 min，10%～95% A；35～40 min，95% A。質(zhì)量分析在Agilent 6430 三重四極桿LC/MS 系統(tǒng)進(jìn)行，掃描間隔為200～1 000m/z。溫度為310 ℃，N2流速為11.0 psi。毛細(xì)管電壓為4 kV，干燥氣體流速為5 L/min。數(shù)據(jù)用Agilent MassHunter 軟件進(jìn)行處理。

1.3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

雄性C57BL/6J 小鼠50 只，6 周齡，平均質(zhì)量為（19.34±0.84）g，自由飲食飲水1 周后隨機(jī)分為五組，每組10 只。五組分別命名為高脂膳食組（HFD）、低劑量BRE 處理組（LBRE）、中劑量BRE 組（MBRE）、高劑量BRE 組（HBRE）及陽性對(duì)照茶多酚組（TP），每組10只。高脂飼料由質(zhì)量分?jǐn)?shù)為34.89%脂肪、26.23%蛋白質(zhì)、31.50%碳水化合物、5.81%礦物質(zhì)、1.57%的維生素組成（每100 g 飼料中能量為2 192.42 kJ）。低、中、高劑量黑米花青素組小鼠分別喂食含有200、400及600 mg/kg 黑米花青素的高脂膳食。陽性對(duì)照茶多酚組小鼠給予含有240 mg/kg 茶多酚（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞90%）的高脂膳食?？傇囼?yàn)周期8 周，并將體質(zhì)量變化每周記錄在冊(cè)。

1.3.3 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

將小鼠禁食12 h，CO2窒息后立即從眼眶取血并收集。將取得的血液迅速在4 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，分離出上層血清，4 ℃下保存。通過使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各組小鼠血清中甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度值蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平[17]。

1.3.4 肝臟組織病理形態(tài)觀察

用滅菌后的工具剪取肝臟組織，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液進(jìn)行浸泡固定，再依次進(jìn)行包埋、切片、脫蠟、HE 染色等操作，完成肝臟組織切片的制作，在400 倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照記錄[18]。

1.3.5 肝臟組織中脂代謝相關(guān)基因表達(dá)水平分析

取新鮮的小鼠肝臟組織，用消毒后的刀片將肝臟組織切割成綠豆大小，所切組織塊的長寬高≤0.5 cm，然后用預(yù)冷的RNase-free 水快速?zèng)_洗肝臟組織[19]。將處理后的肝臟組織迅速放入RNase-free的螺紋凍存管中并標(biāo)記，全部操作過程在冰浴下進(jìn)行。將螺旋管置于液氮迅速冷卻1 h 后，于-80 ℃保存，避免反復(fù)凍融。本研究樣品送至蘇州帕諾米克生物醫(yī)藥科技有限公司作宏基因組分析。通過分析各組小鼠肝臟脂代謝相關(guān)基因的mRNA 表達(dá)水平，并以此為依據(jù)推測(cè)黑米花青素改善高脂膳食飼喂小鼠脂代謝紊亂的途徑[20,21]。

1.3.6 腸道內(nèi)容物腸道菌群差異性分析

將各組小鼠麻醉后處死，分別取小鼠腸道內(nèi)容物2 g 并標(biāo)記，隨即將樣品放入凍存管中，液氮冷凍1 h后，放入-80 ℃保存，在干冰保存條件下寄送至蘇州帕諾米克生物醫(yī)藥科技有限公司。處死小鼠后取出盲腸，在超凈臺(tái)中用干凈的鑷子取盲腸內(nèi)容物于1.5 mL管中，密封后迅速放入液氮中凍存。并從中提取細(xì)菌DNA，將DNA 樣品在Illumina 平臺(tái)上進(jìn)行擴(kuò)增、純化和測(cè)序。對(duì)測(cè)序后得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾篩選，確認(rèn)其有效性和準(zhǔn)確性后再進(jìn)行分析[22]。將各組小鼠腸道菌群進(jìn)行對(duì)比，篩選出差異菌群。最后總結(jié)分析黑米花青素對(duì)小鼠腸道菌群的豐度、結(jié)構(gòu)、功能等產(chǎn)生的影響。

（1）OTU 分析

使用QIIME2 軟件，將相似性大于97%的序列進(jìn)行OTU 聚類分析，再通過RDP 數(shù)據(jù)庫（Release 11.1http://rdp.cme.msu.edu/）注釋。

（2）組間相似性分析

基于主坐標(biāo)分析（PCoA）評(píng)估組間物種的β-多樣性及腸道微生物差異性。

（3）腸道群落組成分析

通過QIIME 2 軟件，對(duì)腸道微生物進(jìn)行物種分類學(xué)注釋，并在門、屬水平上進(jìn)行分析，明確黑米花青素對(duì)高脂膳食小鼠腸道微生物組成和結(jié)構(gòu)的影響。

1.3.7 腸道內(nèi)容物短鏈脂肪酸含量檢測(cè)

取禁食12 h后的小鼠糞便200 mg于5 mL離心管中，加入2 mL 磷酸充分混勻。再將樣本在4 ℃、10 000 r/min下離心15 min，吸取0.3 mL 上清液移入離心管中，加入0.1 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的H2SO4和0.8 mL 內(nèi)標(biāo)2-乙基丁酸，渦旋振蕩10 min 后離心15 min（4 ℃，10 000 r/min）。最后，將上清液轉(zhuǎn)移至-20 ℃保存，以備后續(xù)檢測(cè)[23]。Agilent 7890 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀配備Agilent HP-5 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm ID×0.25 μm）檢測(cè)樣品中短鏈脂肪酸含量。進(jìn)樣口溫度為220 ℃，溶劑延遲6 min，進(jìn)樣量1 μL，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃；程序升溫起始溫度80 ℃，保持1 min，然后以40 ℃/min 的速率升溫至100 ℃，保持5 min，再以20 ℃/min 的速率升溫至210 ℃，保持30 min；載氣為氦氣，載氣流速1.0 mL/min。質(zhì)譜條件：電子撞擊模式，電子能量為70 eV。小鼠糞便中短鏈脂肪酸含量通過公式1 計(jì)算。

式中：

Ccon——樣本中目標(biāo)化合物的含量，mg/kg；

Cs——提取液中目標(biāo)物質(zhì)量濃度，mg/L；

V1——加入內(nèi)標(biāo)溶液體積，mL；

V2——取出純水上清液體積，mL；

V3——加入純水體積，mL；

M——稱樣量，mg。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

使用Origin Pro 2021 軟件對(duì)取得數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3 次，數(shù)值以平均值±SD 表示。當(dāng)P＜0.05 時(shí)為顯著，P＜0.01 為極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑米提取物中花青素的組成

如圖1 所示，黑米提取物中花青素所占比例為88.24%，共有5 個(gè)峰，其中峰2 為主要花青素單體。然后，通過HPLC-ESI-MS/MS 對(duì)各峰進(jìn)行表征，花青素的質(zhì)譜和化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2 所示。

圖1 黑米提取物在520 nm 處的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the black rice extract detected at 520 nm

圖2 黑米提取物在520 nm 處的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrum of black rice extract at 520 nm

如圖2a 所示，峰1 在m/z611 處有一個(gè)分子離子[M]+，在m/z287 處有一個(gè)片段離子。由于花青素-3,5-二葡萄糖苷的理論數(shù)據(jù)為m/z611，分子離子損失162 個(gè)，表明在峰的結(jié)構(gòu)中存在葡萄糖部分，峰1 的m/z數(shù)據(jù)（m/z611）為矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷。如圖2b 所示，觀察到m/z449 處的分子離子[M]+，并且分子離子可以在m/z287 處碎裂成一個(gè)離子[M-162]+，表明一個(gè)葡萄糖部分的損失。因此，峰2 為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷。在m/z595 處存在分子離子[M]+，在m/z287[M-308]處顯示初級(jí)碎片離子+，對(duì)應(yīng)一個(gè)蕓香苷部分的分子離子損失。因此，峰3（圖2c）可以鑒定為矢車菊素-3-O-蕓香糖苷。由于m/z463 的分子離子和m/z301[M-162]+的分子離子的特征碎裂模式，峰4 中（圖2d）成分為芍藥素-3-O-葡萄糖苷。峰5的MS 圖譜（圖2e）在m/z609 處存在分子離子[M]+，在m/z301[M-308]處顯示初級(jí)碎片離子，對(duì)應(yīng)一個(gè)蕓香苷部分的分子離子損失。因此，峰5 為芍藥素-3-O-蕓香糖苷。

2.2 黑米花青素對(duì)高脂小鼠體質(zhì)量的影響

小鼠每周體質(zhì)量變化隨時(shí)間增長逐漸增大，符合小鼠生長發(fā)育的一般規(guī)律。8 周試驗(yàn)周期結(jié)束后，HFD組小鼠平均體質(zhì)量為28.24 g，LBRE、MBRE 及HBRE組小鼠平均體質(zhì)量分別為26.22、25.94 及24.72 g。而陽性對(duì)照組（TP 組）小鼠體質(zhì)量為25.23 g（圖3）。顯然，與HFD 組相比，黑米花青素和茶多酚干預(yù)后的小鼠體質(zhì)量顯著降低，且具有劑量效應(yīng)。隨著黑米花青素的添加量越多，體質(zhì)量降低的趨勢(shì)也越顯著。

圖3 黑米花青素對(duì)小鼠體質(zhì)量增長的影響Fig.3 Effect of black rice anthocyanins on body weight gain in mice

2.3 黑米花青素對(duì)高脂小鼠血清生化指標(biāo)的影響

當(dāng)TP 及不同劑量黑米花青素干預(yù)8 周后，五組小鼠血脂水平發(fā)生不同變化。采用生化分析儀對(duì)小鼠血清中總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和甘油三酯（TG）的含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4 所示。與HFD 組相比，HBRE 組血清TG、TC 和LDL 水平顯著降低，與陽性對(duì)照組（TP 組）變化趨勢(shì)相似。

圖4 黑米花青素對(duì)小鼠血脂異常的影響Fig.4 Effect of black rice anthocyanin on dyslipidemia in mice

如圖4 所示，HFD 喂養(yǎng)小鼠的TG、TC、LDL-C水平顯著高于其他組（P＜0.05），而添加黑米花青素顯著降低了上述升高參數(shù)的水平。與HFD 組相比，LBRE 組的TG、LDL 及TC 水平分別降低了14.30%、12.75%及3.73%，而HDL水平則提高了16.28%。HBRE組血清中TG、LDL 及TC 水平分別降低了42.33%、22.28%及11.13%，而HDL 水平則提高了30.86%。這表明高劑量的黑米花青素干預(yù)降血脂效果更顯著。結(jié)果表明，與TP 效果相似，黑米花青素能夠有效降低HFD 小鼠血清TC、TG 和LDL-C 水平，增加血清HDL-C 水平，其降脂作用明顯，并呈量效關(guān)系。

2.4 黑米花青素對(duì)高脂小鼠肝臟組織形態(tài)的影響

小鼠肝臟組織的病理學(xué)變化如圖5 所示。HFD 組小鼠肝臟有明顯的脂肪泡，部分細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)腫大，并伴有炎性浸潤。不同劑量黑米花青素組分別不同程度的改善了肝臟組織的病理學(xué)結(jié)構(gòu)變化，隨著黑米花青素劑量的增加，改善作用越大。與HFD 組相比，HBRE 及TP 組的小鼠肝組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、清晰、沒有明顯變性，以中央靜脈為中心，周圍呈放射狀分布，肝小葉結(jié)構(gòu)正常。研究發(fā)現(xiàn)，黑米花青素對(duì)高脂飼料誘導(dǎo)的小鼠肝內(nèi)脂質(zhì)沉積有明顯的抑制作用，且在8 周內(nèi)，BRE 對(duì)高脂飼料誘導(dǎo)的小鼠肝內(nèi)脂肪的含量明顯降低，炎癥細(xì)胞的浸潤減少。經(jīng)不同劑量黑米花青素干預(yù)8 周，肝組織細(xì)胞界限更加清楚，無明顯退行性改變，脂肪空泡減少。這些現(xiàn)象不僅表明黑米花青素可以有效預(yù)防高脂膳食小鼠肝臟中脂質(zhì)沉積，同時(shí)可以緩解小鼠肝臟組織炎癥。

圖5 BRE 及TP 攝入對(duì)小鼠肝臟的影響Fig.5 The effects of BRE and TP intake on mouse liver

2.5 肝臟中基因表達(dá)差異分析

在圖6 中，以FC≥1 且P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選顯著差異表達(dá)基因。顯著差異的基因中上調(diào)基因被顯示為紅色，下調(diào)基因則為藍(lán)色。由圖6 可知，通過LBRE/HFD 比較，發(fā)現(xiàn)了422 個(gè)上調(diào)和225 個(gè)下調(diào)的顯著差異表達(dá)基因。而MBRE 組與HFD 組相比，發(fā)現(xiàn)419 個(gè)上調(diào)基因，286 個(gè)基因顯著下調(diào)。而HBRE組中顯著差異基因中上調(diào)了770 個(gè)，下調(diào)了296 個(gè)。與HFD 組相比，TP 組中被上調(diào)的顯著差異基因數(shù)目為504 個(gè)，下調(diào)的基因?yàn)?22 個(gè)。隨著黑米花青素劑量增大，顯著差異基因中上調(diào)和下調(diào)的基因數(shù)目也增多，這表明攝入黑米花青素對(duì)高脂膳食小鼠的基因轉(zhuǎn)錄圖譜產(chǎn)生了較大影響，且與劑量呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系。

圖6 不同劑量黑米花青素對(duì)HFD 小鼠肝臟的顯著差異基因的影響Fig.6 The effect of different doses of black rice anthocyanins on significantly different genes in the liver of HFD mice

2.6 黑米花青素對(duì)高脂小鼠肝臟脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

肝臟是代謝過程的主要場所，如脂質(zhì)的合成、組裝、重塑和分解。因此，肝臟是研究肥胖模型的一個(gè)重要目標(biāo)。人體膽固醇的主要來源是甲羥戊酸的生物合成。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶（HMGCR）作為從頭合成膽固醇的限速酶，同時(shí)也是內(nèi)源性膽固醇合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶[24]。Cyp7a1可以催化膽固醇向膽汁酸生物轉(zhuǎn)化，促進(jìn)體內(nèi)膽固醇的分解代謝[25]。Ldlr是LDL-c 的受體，參與膽固醇從血漿到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)與膽固醇的分解過程[26]。PPARs是一類過氧化物酶體增殖激活受體，包括三種亞型：PPARα、PPARβ/δ和PPARγ[27]。其中，PPARγ參與脂肪生成、能量平衡和脂質(zhì)生物合成等脂代謝途徑。已有研究表明，PPAR-γ失調(diào)與肥胖、2 型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和其他疾病的發(fā)展有關(guān)，而PPARγ表達(dá)下調(diào)已被證明具有抗肥胖作用[28]。由圖7 可知，BRE 干預(yù)對(duì)高脂膳食飼喂小鼠肝臟脂代謝相關(guān)基因的mRNA 表達(dá)水平有較顯著的影響，與HFD 組相比，PPARγ、HMGCR的表達(dá)量分別下調(diào)了46.82%和41.92%，Cyp7a1、LdIr、PPARα的表達(dá)量分別上調(diào)了189.41%、102.42%和197.80%。說明黑米花青素可減少機(jī)體因高脂膳食機(jī)體肝臟膽固醇的合成，降低脂肪酸從頭合成速率。這表明黑米花青素可能會(huì)減少高脂肪飲食誘導(dǎo)的肝臟內(nèi)大量膽固醇的合成，并減少脂肪酸的從頭合成。

2.7 黑米花青素對(duì)高脂小鼠腸道菌群的影響

2.7.1 OTU 分析

基于OTU 繪制韋恩圖，統(tǒng)計(jì)多組樣品中所共有和獨(dú)有的OTU 數(shù)目[29]，比較各組小鼠間腸道菌群的OTU數(shù)目組成相似性及特異性差異，結(jié)果如圖8所示。通過Venn 圖分析了高脂組、低中高劑量黑米花青素組和茶多酚組五組間共有和獨(dú)有的OTU 數(shù)目。五組小鼠盲腸內(nèi)容物樣品中總OTU 數(shù)目為10 033 個(gè)，共有的OTU 數(shù)目為136 個(gè)，約為總OTU 數(shù)目的1.36%。五組樣品獨(dú)有的OTU 數(shù)目如下：HFD 組2 551 個(gè)（25.43%）、LBRE 組1 609 個(gè)（16.04%）、MBRE 組722 個(gè)（7.20%）、HBRE 組1 090 個(gè)（10.86%）及TP組2 024 個(gè)（20.17%），各組特有的OTU 數(shù)目所占比例較大，說明各組間細(xì)菌群落組成存在較大的差異性。去除共有的OTU 數(shù)目后，HFD 組中特異性的OUT 數(shù)目顯著高于低中高劑量花青素組，表明攝入黑米花青素的小鼠與HFD 組小鼠的菌群分布具有顯著差異性。

圖8 各組腸道菌群OTU 數(shù)目的韋恩圖Fig.8 Venn diagram of the number of OTUs of each group of intestinal flora

2.7.2 多樣本聚類分析

PCoA 圖可表明樣本間差異性，距離與差異呈正比。如圖9 所示，樣本層次聚類與主成分分析均顯示，組間物種組成相似性呈現(xiàn)較大差異。HFD 組菌群與其余各組的距離較遠(yuǎn)，表明攝入黑米花青素后菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著差異。結(jié)果表明BRE 干預(yù)對(duì)高脂小鼠的腸道微生物群有調(diào)節(jié)作用。

圖9 基于主成分分析（a）和聚類分析（b）的微生物群落結(jié)構(gòu)差異Fig.9 Deference of microbial community structure based on principal component analysis (a) and cluster analysis (b)

2.7.3 腸道群落組成分析

根據(jù)物種注釋結(jié)果，門和屬水平下相對(duì)豐度的物種及其比例見圖10 和圖11。腸道菌群中可檢出的占主導(dǎo)地位的門水平下細(xì)菌種類分別是厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）。其中，物種相對(duì)豐度排名前三的分別是厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門。厚壁菌門和擬桿菌門在腸道菌群中參與能量代謝。厚壁菌門與擬桿菌門的比值（F/B）是反應(yīng)腸道菌群紊亂的重要指標(biāo)，比值增加表明體內(nèi)出現(xiàn)炎癥，而肥胖者腸道中這兩種菌的比值較高。

圖10 門水平微生物組成柱狀圖Fig.10 Column diagram of microbial composition at phylum level

圖11 不同劑量BRE 對(duì)腸道菌群屬水平相對(duì)豐度的影響Fig.11 Effect of different doses of BRE on the relative abundance of gut flora genus levels

如圖10 所示，在門水平上，與HFD 組相比，BRE組均降低了厚壁菌門/擬桿菌門的比值。HBRE 組厚壁菌門相對(duì)豐度下降（13.16%）擬桿菌門相對(duì)豐度增加（26.92%）。與HFD 組相比，L-BRE 組中擬桿菌門的相對(duì)豐度降低了19.23%，厚壁菌門/擬桿菌門比值為1.29，而變形菌門升高18.18%。在物種分類學(xué)分析結(jié)果中，BRE 干預(yù)在各個(gè)分類水平上調(diào)節(jié)了高脂小鼠腸道微生物組成。與高脂組相比，LBRE、MBRE、HBRE組和TP 組在門水平上均降低了變形菌門的數(shù)量，增加了擬桿菌門的數(shù)量。

如圖11 所示，與HFD 組相比，不同劑量BRE組及TP 組，尤其是HBRE 組，顯著提高了益生菌（如乳桿菌屬、嗜黏蛋白阿克曼菌屬、瘤胃球菌、雙歧桿菌屬和擬桿菌屬）的相對(duì)豐度。阿克曼氏菌屬（Akkermanni）可以降低與小鼠高脂肪飲食相關(guān)的內(nèi)毒素水平，并通過降解腸道中的黏蛋白，調(diào)節(jié)腸道內(nèi)粘液厚度和維持腸道屏障完整性進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體代謝。因此，阿克曼菌屬在調(diào)節(jié)腸道代謝功能和改善免疫反應(yīng)方面都起著重要作用。蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）與宿主機(jī)體內(nèi)膽汁酸水平密切相關(guān)，膽汁酸濃度升高會(huì)導(dǎo)致蘇黎世桿菌細(xì)菌生長被抑制。雙歧桿菌（Bifidobacterium）可粘附于腸上皮細(xì)胞作為腸道粘膜屏障穩(wěn)定劑，改善腸道微環(huán)境，增強(qiáng)腸道屏障。瘤胃球菌代謝后產(chǎn)生丁酸鹽，發(fā)揮抗炎作用，維持腸道健康。

其中，阿克曼氏菌屬（Akkermanni）、瘤胃球菌屬（Ruminococcaceae）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和擬桿菌屬（Bacteroides）的相對(duì)豐度分別增加了53.29%、51.87%、23.80%、54.28%及69.38%。同時(shí)BRE 也能顯著下調(diào)致病菌屬的豐度，如羅姆布茨菌屬（Romboutsia）、毛茛菌屬（Muribaculacea）和蘇黎世桿菌（Turicibacter）的豐度分別降低了56.40%、64.29%及53.53%。上述結(jié)果表明，添加BRE 對(duì)高脂膳食引起的腸代謝紊亂有顯著的調(diào)節(jié)作用并能顯著提高腸道菌群的多樣性。黑米花青素具有促進(jìn)益生菌及抑制有害菌的作用，可作為一種潛在的益生元物質(zhì)。

2.7.4 黑米花青素對(duì)高脂小鼠腸道短鏈脂肪酸的影響

BRE 在胃腸道中幾乎不被消化吸收，通常也被認(rèn)為是有效的益生元[30]。但腸道微生物可以利用BRE，產(chǎn)生短鏈脂肪酸等代謝產(chǎn)物。短鏈脂肪酸可以維持腸道黏膜屏障完整性和免疫功能[31]、調(diào)節(jié)腸道抗炎反應(yīng)[32,33]、促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、降低血糖和膽固醇水平、參與脂肪代謝和能量供應(yīng)[34]。

表1 中顯示了HFD、LBRE、MBRE、HBRE 與TP 組小鼠糞便中短鏈脂肪酸濃度，并將各組小鼠糞便中短鏈脂肪酸濃度進(jìn)行對(duì)比分析。乙酸（12～18 mg/kg）是小鼠糞便中的主要短鏈脂肪酸，其次是丙酸（2～7 mg/kg）和丁酸（1～4 mg/kg）。還檢測(cè)到少量的戊酸（0.04～0.09 mg/kg），異戊酸（0.02～ 0.04 mg/kg）和異丁酸（0.02～0.06 mg/kg）。與HFD 組相比，LBRE、MBRE 及HBRE 組干預(yù)均提高了小鼠糞便中乙酸、丙酸及丁酸的濃度。其中，HBRE 組對(duì)小鼠腸道內(nèi)產(chǎn)生短鏈脂肪酸的促進(jìn)作用最顯著。陽性對(duì)照組（TP 組）也與BRE 組的變化趨勢(shì)相似。因此，攝入BRE 可以提高腸道短鏈脂肪酸含量，增強(qiáng)腸道屏障功能，也有助于改善機(jī)體代謝穩(wěn)態(tài)。

表1 各組小鼠糞便中SCFAs 的含量(mg/kg)Table 1 Contents of SCFAs in feces of mice in each group (mg/kg)

3 結(jié)論

本研究通過開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探究黑米花青素對(duì)高脂膳食小鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝及腸道菌群的影響。黑米花青素顯著降低高脂膳食小鼠血清中TC、TG 和LDL-C的濃度，并提高了HDL-C 濃度。結(jié)果表明黑米花青素可以降低高脂膳食誘導(dǎo)的小鼠血脂水平。通過對(duì)小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，低、中及高劑量黑米花青素組均提高了小鼠肝臟中PPARα的表達(dá)水平，Hmgcr和Cyp7a1基因的表達(dá)也被調(diào)節(jié)，這些基因與PPARα相關(guān)并參與脂質(zhì)代謝。同時(shí)，黑米花青素干預(yù)也顯著影響了氧化應(yīng)激相關(guān)通路，這表明其具有調(diào)節(jié)脂代謝紊亂的作用。通過分析不同組小鼠盲腸組織中的腸道菌群豐度差異性，可知不同劑量BRE 及陽性對(duì)照組均可顯著提高小鼠腸道中益生菌豐度，如雙歧桿菌、擬桿菌屬、乳酸桿菌及嗜黏蛋白阿克曼菌等。其中，HBRE 組與HFD 組差異最為顯著。除此之外，不同劑量BRE 組及TP 組均降低了蘇黎世桿菌、羅姆布茨菌及毛茛菌等有害菌屬的豐度，表明對(duì)有害菌具有抑制作用。本研究表明，BRE 對(duì)高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖小鼠具有調(diào)節(jié)腸道菌群，增強(qiáng)腸道屏障等有益作用。

綜上所述，本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究了黑米花青素對(duì)高血脂癥的影響，并探討了黑米花青素改善脂代謝紊亂及調(diào)節(jié)腸道菌群的作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)不同劑量黑米花青素均能顯著抑制高脂飲食下小鼠的體質(zhì)量增加，降低血脂并改善脂代謝。此外，黑米花青素也對(duì)腸道菌群產(chǎn)生了較顯著的影響，提高了小鼠體內(nèi)短鏈脂肪酸含量。因此，黑米花青素被證明可能通過改善脂代謝及腸道菌群組成從而改善高血脂癥。