缺氧腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-182通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN的m6A修飾促進(jìn)前列腺癌紫杉醇耐藥*

周 艦, 程 耿, 戚曉紅, 張朝陽(yáng)

武漢市第三醫(yī)院泌尿外科,武漢 430060

前列腺癌(prostate cancer,PCa)是全球男性泌尿生殖系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]。紫杉醇(paclitaxel,PTX)是一種紫杉烷類抗癌藥物,已廣泛應(yīng)用于PCa的治療,但對(duì)其耐藥導(dǎo)致的預(yù)后不佳仍是臨床上的一個(gè)重要挑戰(zhàn)[2]。

目前的研究認(rèn)為,缺氧是腫瘤微環(huán)境中的一個(gè)關(guān)鍵促癌因素,缺氧環(huán)境可以影響外泌體的釋放,缺氧腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體中攜帶的RNA已被證明是調(diào)節(jié)腫瘤生物學(xué)和重塑腫瘤微環(huán)境的重要因素[3]。此外也有研究表明,缺氧腫瘤細(xì)胞外泌體能夠促進(jìn)PCa細(xì)胞的存活[4],但其具體機(jī)制尚不明確。以往研究表明miR-182的過(guò)度表達(dá)能夠促進(jìn)PCa細(xì)胞的增殖、集落形成并抑制凋亡[5-6]。

新近研究發(fā)現(xiàn)PCa組織和細(xì)胞系中脂肪和肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)表達(dá)下調(diào),m6A水平增加,而該表達(dá)失調(diào)與PCa進(jìn)程顯著相關(guān)[7]。磷脂酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、粘附、浸潤(rùn)及遷移等方面發(fā)揮重要作用,其水平升高能夠抑制PCa進(jìn)展[8]。另外PTEN被發(fā)現(xiàn)能夠增強(qiáng)PCa細(xì)胞對(duì)PTX的敏感性,并促進(jìn)PTX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[9]。

本研究旨在闡明缺氧腫瘤細(xì)胞外泌體在PCa中的作用及其機(jī)制,為了解PCa耐藥的分子機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑

經(jīng)STR鑒定正確的人前列腺癌DU145細(xì)胞及人正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1均購(gòu)自武漢普諾賽生物科技有限公司。RPMI l640培養(yǎng)液、EDTA溶液、胰蛋白酶購(gòu)自上海雅心生物技術(shù)有限公司;免疫磁珠購(gòu)自德國(guó)美天旎公司;轉(zhuǎn)染用載體及l(fā)ipofectaminTM3000購(gòu)自Invitrogen公司;外泌體分離及純化試劑盒均購(gòu)自上海翌圣生物公司;雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購(gòu)自Promega公司;Trizol試劑盒、MTT溶液、Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司;紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)購(gòu)自上海美析儀器有限公司;過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及其siRNA干擾質(zhì)粒、各自對(duì)照產(chǎn)物均由上海吉瑪基因公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2 生物信息學(xué)分析方法

借助NCBI網(wǎng)站的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)查詢PCa相關(guān)芯片,借助在線分析工具GEO2R對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。差異篩選條件設(shè)置為adj.P.Value<0.05和|LogFoldChange|>1,limma package用于差異分析,ggplot2繪制表達(dá)火山圖,heatmap package繪制熱圖。Targetscan網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測(cè)與miRNA存在結(jié)合位點(diǎn)的基因。Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/)用于預(yù)測(cè)基因的RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein)。Disgenet網(wǎng)站(https://www.disgenet.org/home/)查找Malignant neoplasm of prostate(C0376358)疾病風(fēng)險(xiǎn)基因。借助在線Venn工具(http://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/index.html)取預(yù)測(cè)結(jié)果交集,通過(guò)DAVID網(wǎng)站(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)代謝途徑分析。GSCALite網(wǎng)站(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/web/GSCALite/)用于基因?qū)λ幬锩舾行缘念A(yù)測(cè)。以UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因在PCa中的表達(dá)進(jìn)行預(yù)測(cè)。SRAMP(http://www.cuilab.cn/sramp/)用于尋找基因的m6A甲基化修飾位點(diǎn)。

1.3 臨床資料與組織樣本獲取

選取2019年1月至2020年6月收治于本院腫瘤科與泌尿外科的PCa患者52例(PCa組),患者均于PCa根治術(shù)前行造影檢查,患者組織活檢后均經(jīng)2名以上病理學(xué)專家確診為PCa。患者均為男性,年齡51～79歲,中位年齡68歲。納入標(biāo)準(zhǔn):①臨床資料完整且均簽署知情同意書(shū);②患者均為初次進(jìn)行診療;③既往無(wú)其他惡性腫瘤史也未接受過(guò)抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn):①有嚴(yán)重心肝腎功能障礙的患者;②合并系統(tǒng)性疾病;③患有自身免疫性疾病的患者。另選取50例因良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)行電切手術(shù)的患者(Control組),患者均為男性,年齡49～79歲,中位年齡65歲。PCa組與Control組患者均于術(shù)后留取組織。患者組織經(jīng)切除后立即置于凍存管中,并用液氮轉(zhuǎn)移至-80℃條件下保存。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與PTX耐藥細(xì)胞系建立

人前列腺上皮細(xì)胞系RWPE-1在添加有0.05 mg/mL BPE、5 ng/mL EGF生長(zhǎng)因子和1% P/S(青鏈霉素合劑)的K-SFM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。DU145細(xì)胞在補(bǔ)充有10% FBS和1% P/S的Ham’s F-12 K培養(yǎng)液中培養(yǎng)。所有的細(xì)胞均在含5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DU145細(xì)胞分為常氧細(xì)胞外泌體組和缺氧細(xì)胞外泌體組,常氧細(xì)胞置于20% O2、37℃、5% CO2中進(jìn)行培養(yǎng)。缺氧條件設(shè)置為1% O2、37℃、5%CO2,細(xì)胞處理48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)逐步增加培養(yǎng)液中PTX的濃度獲得PTX耐藥(PTX resistance,PR)[10]的DU145細(xì)胞(DU145/PR)。

1.5 外泌體的分離、純化和鑒定

收集常氧和缺氧條件處理的細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至EP管,以12000 r/min離心后收集上清,添加外泌體提取試劑,混勻后轉(zhuǎn)移至4℃條件下靜置2 h。隨后再次離心1 h,收集沉淀,用1×PBS吹打沉淀產(chǎn)物,25000 r/min離心2 min后棄去沉淀,保留上清。采用3 kD超濾管再次將上清進(jìn)行30000 r/min離心,30 min后即可獲得純化后的外泌體顆粒,隨后借助0.22 μm的濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌。采用透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察外泌體形態(tài),蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)CD63、CD9、CD81的表達(dá)。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與共培養(yǎng)

取耐藥培養(yǎng)后的第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,采用胰蛋白酶消化,轉(zhuǎn)染前24 h用無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng),采用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑將oe-FTO-NC(過(guò)表達(dá)FTO陰性對(duì)照載體)、oe-FTO(過(guò)表達(dá)FTO載體)、si-FTO-NC(敲減FTO陰性對(duì)照載體)、si-FTO(敲減FTO載體)、oe-PTEN-NC(過(guò)表達(dá)PTEN陰性對(duì)照載體)、oe-PTEN(過(guò)表達(dá)PTEN載體)、mimic-NC(miR-182 mimic陰性對(duì)照載體)、miR-182 mimic(轉(zhuǎn)染miR-182 mimic載體)、inhibitor-NC(轉(zhuǎn)染miR-182-inhibitor陰性對(duì)照載體)、miR-182-inhibitor(轉(zhuǎn)染miR-182-inhibitor)分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。6 h后更換培養(yǎng)液,在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)48 h。將1×105個(gè)各轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞與約150 μL的外泌體懸液共培養(yǎng)48 h,進(jìn)行后續(xù)功能實(shí)驗(yàn),另將等量PBS與各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞共培養(yǎng)作為對(duì)照組。

1.7 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

收集PCa組患者前列腺癌組織及對(duì)照組正常增生前列腺組織各約100 mg,生理鹽水沖洗,借助Trizol試劑提取組織中的總RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)量吸光度以檢測(cè)RNA純度,以總RNA為模板借助反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,隨后以cDNA為模板按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說(shuō)明書(shū)在熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件均依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平,miRNA以U6為內(nèi)參,其余目的基因以GAPDH為內(nèi)參,詳細(xì)引物序列見(jiàn)表1。本方法同樣適用于細(xì)胞檢測(cè)。當(dāng)檢測(cè)對(duì)象為外泌體時(shí),借助外泌體RNA分離試劑盒提取常氧PCa細(xì)胞外泌體及缺氧PCa細(xì)胞外泌體中的總RNA,其余操作相同。

表1 qRT-PCR引物序列

1.8 免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)

組織和細(xì)胞用RIPA消化,BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。裂解物通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠(10%)電泳分離,然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。5%的脫脂牛奶封閉膜以抑制非特異性結(jié)合,2 h后在4℃條件下添加以下檢測(cè)抗體孵育過(guò)夜:抗FTO(1∶10000)、抗PTEN(1∶1000)、CD63(1∶1000)、CD9(1∶1000)、CD81(1∶1000;)。次日洗滌后,用山羊抗兔IgG(1∶2000)作為第二抗體進(jìn)一步孵育膜2 h。根據(jù)制造商的說(shuō)明,使用ECL Western blot檢測(cè)試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行可視化,并通過(guò)Quantity One 4.6.2分析軟件對(duì)蛋白條帶的灰度進(jìn)行量化,目的蛋白與內(nèi)參蛋白(GAPDH)條帶灰度值比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 m6A RNA甲基化定量及MeRIP檢測(cè)

根據(jù)制造商的說(shuō)明,用EpiQuik m6A RNA甲基化定量試劑盒測(cè)量提取的RNA的總m6A水平。使用polyA SpinTM純化mRNA后根據(jù)Magna MeRIPTMm6A試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行MeRIP檢測(cè)。將mRNA片段化為大約100 nt的寡核苷酸。將Magna ChIP蛋白A/G磁珠與m6A特異性抗體(anti-FTO,1∶10000)在免疫沉淀緩沖液中于室溫下孵育1 h。然后將混合物與MeRIP反應(yīng)混合物在4℃下孵育過(guò)夜。洗脫的RNA用于qRT-PCR分析,后續(xù)操作同1.7部分。

借助放線菌素D檢測(cè)RNA穩(wěn)定性,用5 μg/mL放線菌素D處理細(xì)胞以抑制轉(zhuǎn)錄。然后分別在0、2、4、8 h時(shí)收集細(xì)胞。使用qRT-PCR檢測(cè)mRNA水平。

1.10 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

借助Targetscan預(yù)測(cè)miR-182與FTO之間的相互作用位點(diǎn),構(gòu)建熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,pmirGLO-FTO-WT(FTO-WT)和pmirGLO-FTO-MUT(FTO-MUT)。將含有miR-182結(jié)合位點(diǎn)的FTO 3′UTR克隆到pmirGLO載體中。同樣,將含有miR-182突變結(jié)合位點(diǎn)的FTO 3′UTR結(jié)構(gòu)域插入pmirGLO載體以構(gòu)建FTO-MUT。HEK-293T細(xì)胞接種至96孔板中,每孔1×105個(gè)細(xì)胞。根據(jù)制造商的說(shuō)明,借助LipofectaminTM3000將miR-182 mimic(模擬物)與mimic-NC(miR-182 mimic模擬物陰性對(duì)照)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。24 h后使用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。熒光密度由微板閱讀器定量,以海腎熒光素酶作為對(duì)照熒光素酶報(bào)告基因,將其進(jìn)行歸一化處理。

1.11 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PTX藥物敏感性

將1×104個(gè)DU145/PR細(xì)胞接種在96孔板中,用不同劑量的PTX(0～300 nmol)處理細(xì)胞24 h。隨后添加MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h。去除培養(yǎng)上清液后,加入200 μL DMSO溶解。使用微板閱讀器在490 nm波長(zhǎng)下檢查吸光度值。借助相對(duì)生存曲線確定IC50值。

1.12 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡

使用Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。DU145/PR用100 nmol PTX暴露24 h后用PBS清洗,結(jié)合緩沖液重懸,避光加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC染色10 min,5 μL PI染色5 min。使用流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行分析。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件分析本研究中數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,組內(nèi)兩兩比較使用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧腫瘤細(xì)胞外泌體促進(jìn)PCa細(xì)胞PTX耐藥

如圖1A所示,TEM結(jié)果顯示常氧和缺氧條件下培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞外泌體呈盤(pán)狀囊泡結(jié)構(gòu),Western blot結(jié)果證實(shí)外泌體標(biāo)記物CD9、CD81、CD63在常氧細(xì)胞外泌體和缺氧細(xì)胞外泌體中均有表達(dá),但缺氧細(xì)胞外泌體中CD9、CD81、CD63的表達(dá)水平較常氧細(xì)胞外泌體組更高(均P<0.05)(圖1B),提示缺氧增強(qiáng)了PCa細(xì)胞外泌體的分泌。PTX毒性檢測(cè)結(jié)果顯示,DU145/PR細(xì)胞對(duì)PTX的敏感性變低,PTX半數(shù)抑制濃度較DU145組細(xì)胞顯著升高,提示PTX耐藥細(xì)胞模型構(gòu)建成功(圖1C)。為了明確缺氧細(xì)胞外泌體對(duì)常氧PCa細(xì)胞的影響,本研究用PBS、常氧和缺氧細(xì)胞外泌體處理DU145/PR細(xì)胞。如圖1D所示,在不同濃度的PTX處理后,常氧和缺氧細(xì)胞外泌體明顯提高了DU145/PR細(xì)胞的存活率和PTX的半數(shù)抑制濃度,且缺氧外泌體組細(xì)胞存活率和PTX半數(shù)抑制濃度更高(均P<0.05)。此外,細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖1E),與PBS組相比,常氧和缺氧細(xì)胞外泌體組細(xì)胞凋亡減少且缺氧細(xì)胞外泌體組細(xì)胞凋亡率更低(均P<0.05),而以上變化均能被外泌體抑制劑GW4869部分挽救(均P<0.05)。以上結(jié)果表明,缺氧PCa細(xì)胞分泌的外泌體能夠促進(jìn)PCa細(xì)胞的PTX耐藥。

A:TEM觀察外泌體形態(tài);B:外泌體標(biāo)志蛋白CD63、CD9、CD81的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果;C:PTX耐藥細(xì)胞模型(DU145/PR)鑒定結(jié)果;D:PTX處理后各組細(xì)胞存活率和各組細(xì)胞的PTX半數(shù)抑制濃度檢測(cè)結(jié)果;E:各組細(xì)胞凋亡率;1:DU145/PR+PBS組;2:DU145/PR+常氧細(xì)胞外泌體組;3:DU145/PR+缺氧細(xì)胞外泌體組;4:DU145/PR+缺氧細(xì)胞外泌體+GW4869組;與常氧細(xì)胞外泌體組比較,**P<0.01;與DU145組比較,##P<0.01;與DU145/PR+PBS組比較,△P<0.05 △△P<0.01;與DU145/PR+缺氧細(xì)胞外泌體組比較,&P<0.05 &&P<0.01

2.2 miR-182在缺氧腫瘤細(xì)胞外泌體中高表達(dá)

GSE36802數(shù)據(jù)集里面包含21對(duì)PCa組織及正常前列腺組織中的miRNAs表達(dá)情況,GEO2R在線分析共篩選出35個(gè)差異表達(dá)miRNAs,選擇上調(diào)最顯著的10個(gè)miRNAs并繪制熱圖(圖2A),鑒于以往關(guān)于miR-182和PCa的報(bào)道不夠深入,將miR-182納入本研究。圖2B、2C結(jié)果顯示miR-182在PCa組織樣本中表達(dá)顯著升高(logFC=1.16549,adj.P.value=0.0000254)。圖2D結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,miR-182在PCa樣本組織中表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。與RWPE-1細(xì)胞相比,DU145細(xì)胞和DU145/PR細(xì)胞中miR-182水平上調(diào)且DU145/PR細(xì)胞中miR-182水平更高(P<0.05)(圖2E)。對(duì)常氧和缺氧細(xì)胞外泌體中miR-182的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)缺氧條件處理的細(xì)胞分離的外泌體其miR-182水平更高(P<0.05)(圖2F)。進(jìn)一步將外泌體與DU145/PR細(xì)胞共培養(yǎng)并且檢測(cè)miR-182表達(dá)發(fā)現(xiàn),與DU145/PR+PBS組比較,常氧細(xì)胞外泌體和缺氧細(xì)胞外泌體處理的DU145/PR細(xì)胞中miR-182水平上調(diào)且DU145/PR+缺氧細(xì)胞外泌體處理組中miR-182水平更高(P<0.05)(圖2G),提示缺氧細(xì)胞外泌體中miR-182能夠轉(zhuǎn)移到DU145/PR細(xì)胞中。

A～B:GSE36802數(shù)據(jù)集中顯著上調(diào)的miRNAs;C:miR-182在GSE36802數(shù)據(jù)集樣本中的表達(dá);D:qRT-PCR檢測(cè)miR-182在對(duì)照組(n=50)及PCa組(n=52)患者前列腺組織中的表達(dá)水平,與對(duì)照組比較,**P<0.01;E:miR-182在RWPE-1、DU145以及DU145/PR細(xì)胞中的表達(dá)水平,與RWPE-1細(xì)胞比較,##P<0.01;F:miR-182在常氧細(xì)胞外泌體和缺氧細(xì)胞外泌體中的表達(dá)水平;G:miR-182在PBS、常氧細(xì)胞外泌體及缺氧細(xì)胞外泌體處理的DU145/PR細(xì)胞中的表達(dá)水平,與PBS組比較,△P<0.05 △△P<0.01

2.3 miR-182 inhibitor部分逆轉(zhuǎn)缺氧細(xì)胞外泌體對(duì)PCa細(xì)胞PTX耐藥的促進(jìn)作用

相對(duì)于DU145/PR+PBS組,DU145/PR+缺氧細(xì)胞外泌體組細(xì)胞的存活率和PTX半數(shù)抑制濃度增加,細(xì)胞凋亡減少(均P<0.05);而相對(duì)于DU145/PR+缺氧細(xì)胞外泌體+inhibitor-NC組,DU145/PR+缺氧細(xì)胞外泌體+miR-182 inhibitor組細(xì)胞的存活率和PTX半數(shù)抑制濃度降低,細(xì)胞凋亡率升高(均P<0.01,圖3)。提示缺氧細(xì)胞外泌體對(duì)PCa細(xì)胞PTX耐藥的影響是通過(guò)miR-182實(shí)現(xiàn)的。

1:DU145/PR+PBS組;2:DU145/PR+缺氧細(xì)胞外泌體組;3:DU145/PR+缺氧細(xì)胞外泌體+inhibitor-NC組;4:DU145/PR+缺氧細(xì)胞外泌體+miR-182 inhibitor組;A:PTX處理后各組細(xì)胞存活率和各組細(xì)胞的PTX半數(shù)抑制濃度檢測(cè)結(jié)果;B:各組細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果;與DU145/PR+PBS組比較,**P<0.01;與DU145/PR+缺氧細(xì)胞外泌體+inhibitor-NC組比較,##P<0.01

2.4 FTO為miR-182的作用靶點(diǎn)

為確定miR-182可能作用的靶點(diǎn),Targetscan對(duì)其下游靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示miR-182與FTO存在靶向結(jié)合位點(diǎn)(圖4A)。雙熒光素酶報(bào)告分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖4B),相對(duì)于mimic-NC和FTO-WT共轉(zhuǎn)染組,miR-182 mimic和FTO-WT共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著降低(均P<0.05)。圖4C顯示FTO在PCa組中表達(dá)水平較對(duì)照組顯著下調(diào)(P<0.05),且與miR-182水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.83,P<0.01)(圖4D)。另外,與RWPE-1組相比,FTO在DU145和DU145/PR細(xì)胞中水平顯著下降(均P<0.05)(圖4E)。圖4F顯示,與PBS組比較,常氧細(xì)胞外泌體和缺氧細(xì)胞外泌體處理的DU145/PR細(xì)胞中FTO的表達(dá)降低且缺氧細(xì)胞外泌體組FTO表達(dá)更低(均P<0.05)。綜上結(jié)果表明,miR-182可靶向抑制FTO的水平。

2.5 FTO抑制PCa細(xì)胞的PTX耐藥但該作用能夠被缺氧細(xì)胞外泌體逆轉(zhuǎn)

相對(duì)于DU145/PR+oe-FTO-NC組,DU145/PR+oe-FTO組細(xì)胞的存活率和PTX半數(shù)抑制濃度降低,細(xì)胞凋亡率增加(均P<0.05)。而相對(duì)于DU145/PR+oe-FTO+PBS組,DU145/PR+oe-FTO+缺氧細(xì)胞外泌體組中細(xì)胞存活率和PTX半數(shù)抑制濃度增加,細(xì)胞凋亡率降低(均P<0.05)。上述結(jié)果表明FTO能夠抑制PCa細(xì)胞的PTX耐藥但該作用能夠被缺氧細(xì)胞外泌體挽救(圖5)。

1:DU145/PR+oe-FTO-NC組;2:DU145/PR+oe-FTO組;3:DU145/PR+oe-FTO+PBS組;4:DU145/PR+oe-FTO+缺氧細(xì)胞外泌體組;A:PTX處理后各組細(xì)胞存活率和各組細(xì)胞的PTX半數(shù)抑制濃度檢測(cè)結(jié)果;B:各組細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果;與oe-FTO-NC組比較,**P<0.01;與oe-FTO+PBS組比較,##P<0.01

2.6 FTO抑制PTEN的m6A修飾并上調(diào)其在PCa中的表達(dá)

為探究缺氧細(xì)胞外泌體/miR-128/FTO的下游機(jī)制,以Starbase對(duì)FTO的結(jié)合因子進(jìn)行預(yù)測(cè),并且通過(guò)Disgenet網(wǎng)站以Malignant neoplasm of prostate(C0376358)為關(guān)鍵詞查找PCa疾病風(fēng)險(xiǎn)基因,做Venn圖取交集后得到1673個(gè)基因(圖6A)。KEGG富集分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了PCa通路(圖6B)。GSCALite網(wǎng)站預(yù)測(cè)顯示E2F2,BCL2,E2F3,RAF1,PTEN,EP300,MTOR,PIK3CA的表達(dá)與耐藥性呈負(fù)相關(guān),即其在PCa組織中表達(dá)水平越高,PCa組織對(duì)紫杉醇敏感性越高。StarBase預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,PTEN在PCa中低表達(dá)(圖6C),且PTEN與FTO在PCa中的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.22,P=6.77 e-06)(圖6D)。SRAMP網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,PTEN存在多個(gè)具有非常高可信度的m6A甲基化修飾位點(diǎn)。另外,PCa組織中m6A水平上升(均P<0.01)(圖6E);而PTEN表達(dá)水平在PCa組織及細(xì)胞中均下調(diào)(均P<0.01)(圖6F、6G)。敲減FTO后PTEN穩(wěn)定性下降(P<0.01),過(guò)表達(dá)FTO后PTEN穩(wěn)定性增強(qiáng)(均P<0.01)(圖6H)。MeRIP結(jié)果(圖6I)顯示FTO抑制了PTEN的m6A修飾,而敲減FTO則促進(jìn)了PTEN的m6A修飾(均P<0.01)。綜上結(jié)果表明,FTO通過(guò)抑制PTEN的m6A水平增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性,進(jìn)而上調(diào)PTEN在PCa中的表達(dá)。

1:si-FTO-NC;2:si-FTO;3:oe-FTO-NC;4:oe-FTO;A:StarBase與Disgene預(yù)測(cè)結(jié)果交集;B:KEGG富集分析結(jié)果;C～D:GSCALite、StarBase預(yù)測(cè)結(jié)果;E:m6A水平檢測(cè)結(jié)果;F～G:qRT-PCR檢測(cè)PTEN在PCa組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平;H:放線菌素D實(shí)驗(yàn)結(jié)果;I:MeRIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果;與對(duì)照組比較,**P<0.01;與RWPE-1細(xì)胞比較,##P<0.01;與si-FTO-NC組比較,△△P<0.01;與oe-FTO-NC組比較,&&P<0.01

2.7 PTEN對(duì)PCa細(xì)胞PTX耐藥的影響被si-FTO部分挽救

圖7A結(jié)果顯示,oe-PTEN促進(jìn)PTEN的表達(dá),但該效果能被si-FTO部分逆轉(zhuǎn)(均P<0.05)。圖7B、7C結(jié)果顯示,與DU145/PR+oe-PTEN-NC組比較,oe-PTEN組細(xì)胞存活率降低,PTX半數(shù)抑制濃度降低,細(xì)胞凋亡率增加(均P<0.05)。另外,與DU145/PR+oe-PTEN+si-FTO-NC組比較,DU145/PR+oe-PTEN+si-FTO組DU145/PR細(xì)胞存活率和PTX半數(shù)抑制濃度增加,細(xì)胞凋亡減少(均P<0.05)。提示PTEN的作用被si-FTO挽救,結(jié)合結(jié)果2.6認(rèn)為FTO通過(guò)上調(diào)PTEN進(jìn)而影響PCa的PTX耐藥。本研究機(jī)制見(jiàn)圖7D。

1:DU145/PR+oe-PTEN-NC組;2:DU145/PR+oe-PTEN組;3:DU145/PR+oe-PTEN+si-FTO-NC組;4:DU145/PR+oe-PTEN+si-FTO組;A:各組細(xì)胞PTEN的mRNA表達(dá)水平;B:各組DU145/PR細(xì)胞的存活率和PTX半數(shù)抑制濃度;C:各組細(xì)胞凋亡率;D:本研究機(jī)制圖;與DU145/PR+oe-PTEN-NC組比較,**P<0.01;與DU145/PR+oe-PTEN+si-FTO-NC組比較,##P<0.01

3 討論

缺氧與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān),也是惡性腫瘤的重要標(biāo)志,外泌體是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分,缺氧條件下的外泌體能夠通過(guò)調(diào)節(jié)免疫、傳遞貨物分子等途徑促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[11]。另外也有研究表明缺氧PCa細(xì)胞來(lái)源的外泌體能夠促進(jìn)原始PCa細(xì)胞的干性和侵襲性,促進(jìn)PCa的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[12-13]。首先本研究對(duì)常氧和缺氧細(xì)胞中分離的外泌體對(duì)PTX耐藥細(xì)胞的影響進(jìn)行探討,發(fā)現(xiàn)常氧和缺氧細(xì)胞外泌體均增加了PCa細(xì)胞對(duì)PTX的耐藥性并減少了凋亡,但缺氧細(xì)胞外泌體的作用更顯著,這可能與缺氧條件下腫瘤細(xì)胞的惡性程度更高和增殖更多有關(guān)。

運(yùn)輸RNA和蛋白質(zhì)等貨物分子是外泌體參與腫瘤進(jìn)展的重要途徑,如缺氧結(jié)直腸癌細(xì)胞分泌的外泌體能通過(guò)傳遞Wnt4至常氧細(xì)胞,以激發(fā)常氧腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[14]。缺氧的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞源性介導(dǎo)高水平的miR-21傳遞可促進(jìn)常氧細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性[15]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-182在PCa中表達(dá)增強(qiáng),關(guān)于PCa的研究也證實(shí)miR-182過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)PCa細(xì)胞增殖和侵襲[16]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-182在缺氧條件處理的PCa細(xì)胞外泌體中表達(dá)顯著增強(qiáng)。功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明缺氧細(xì)胞外泌體能夠促進(jìn)DU145/PR細(xì)胞的存活,抑制細(xì)胞凋亡,但是敲減miR-182后上述情況則改善,提示缺氧細(xì)胞外泌體對(duì)PCa細(xì)胞PTX耐藥的影響可能是通過(guò)運(yùn)輸miR-182實(shí)現(xiàn)的。

FTO作為去甲基化酶被證實(shí)參與了PCa的進(jìn)展,有研究表明FTO在PCa中表達(dá)降低且其表達(dá)與PCa患者預(yù)后有關(guān)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)FTO和miR-182存在結(jié)合位點(diǎn)并且證實(shí)了二者直接的結(jié)合關(guān)系。此外FTO在DU145/PR細(xì)胞以及缺氧細(xì)胞外泌體中表達(dá)降低,可能是受到miR-182的靶向抑制。功能實(shí)驗(yàn)顯示過(guò)表達(dá)FTO能夠抑制PTX處理的PCa細(xì)胞的存活率并且促進(jìn)細(xì)胞凋亡,提示FTO能夠抑制PCa細(xì)胞的PTX耐藥但該作用能夠被缺氧細(xì)胞外泌體挽救,結(jié)合缺氧細(xì)胞外泌體中miR-182高表達(dá)以及FTO和miR-182的靶向關(guān)系我們推測(cè)缺氧細(xì)胞外泌體能夠分泌miR-182進(jìn)而調(diào)控FTO并影響PCa細(xì)胞對(duì)PTX的耐藥。

進(jìn)一步對(duì)FTO可能調(diào)節(jié)的下游因子進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其能夠與PTEN結(jié)合,PTEN作為PCa的抑癌因子證據(jù)較為充分[18],且本研究通過(guò)GSCALite網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)其與PCa耐藥呈負(fù)相關(guān)。FTO對(duì)其結(jié)合靶點(diǎn)的修飾有多種途徑,比較常見(jiàn)的就是通過(guò)調(diào)節(jié)其靶基因的m6A水平進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因表達(dá),如FTO被發(fā)現(xiàn)能夠抑制CLIC4 mRNA的m6A修飾水平進(jìn)而增加CLIC4的表達(dá)和穩(wěn)定性[19]。本研究對(duì)FTO和PTEN的關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)FTO過(guò)表達(dá)增加了PTEN的穩(wěn)定性,而敲減FTO則能夠抑制PTEN的穩(wěn)定性,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)FTO對(duì)PTEN的調(diào)節(jié)是通過(guò)影響PTEN的m6A修飾水平實(shí)現(xiàn)的。功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明過(guò)表達(dá)PTEN后PTX處理的DU145/PR細(xì)胞存活率下降,細(xì)胞凋亡增加,但加入si-FTO后DU145/PR細(xì)胞的存活率增加,細(xì)胞凋亡減少,可能是敲減FTO后PTEN的穩(wěn)定性受到了影響。

綜上所述,本研究揭示了缺氧腫瘤細(xì)胞外泌體能夠通過(guò)向常氧細(xì)胞傳遞高水平的miR-182,進(jìn)一步靶向FTO,上調(diào)PTEN的m6A修飾水平進(jìn)而抑制PTEN表達(dá),促進(jìn)PCa細(xì)胞對(duì)PTX的耐藥。本研究認(rèn)為缺氧細(xì)胞外泌體源性miR-182可以作為針對(duì)PCa耐藥性治療的一個(gè)新的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。