轉(zhuǎn)錄因子Ascl1誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程為神經(jīng)元的研究進(jìn)展*

張瑩丹, 陳 莉

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,南寧 530021

細(xì)胞重編程是指分化的細(xì)胞在特定條件下被重新編程恢復(fù)到全能狀態(tài),或者轉(zhuǎn)分化成另一種細(xì)胞類型的過程[1]。導(dǎo)入外源性特定神經(jīng)元決定基因(neuronal determination genes)到非神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)(即異位表達(dá)),可將非神經(jīng)元細(xì)胞直接重編程為具有功能的誘導(dǎo)神經(jīng)元(induced neurons,iNs),從而改善神經(jīng)功能,為神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了新的治療策略[2-4]。其中,神經(jīng)母細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)移因子——Achaete-scute家族bHLH轉(zhuǎn)錄因子1(achaete scute homolog-1,Ascl1)及其相關(guān)的重編程機(jī)制在指導(dǎo)終末分化的非神經(jīng)元細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)神經(jīng)元的研究中取得突破。本文將主要圍繞Ascl1重編程神經(jīng)元這一主要科學(xué)問題,就Ascl1對不同非神經(jīng)元細(xì)胞的重編程及其機(jī)制進(jìn)行闡述。

1 Ascl1重編程非神經(jīng)元細(xì)胞為神經(jīng)元的可行性

1958年,Gurdon等[5]將非洲爪蟾胚胎晚期的細(xì)胞核移植到卵細(xì)胞中,使移植后的卵細(xì)胞獲得了細(xì)胞全能性,表明終末分化細(xì)胞的基因狀態(tài)不是靜止的,推翻了細(xì)胞分化是不可逆過程的理論,為細(xì)胞重編程研究的發(fā)展打下基礎(chǔ)。特定因子的異位表達(dá)如骨骼肌調(diào)節(jié)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子MyoD可將成纖維細(xì)胞(fibroblast,Fb)重編程為成熟的肌細(xì)胞[6],這表明可能存在著特定譜系調(diào)節(jié)因子影響細(xì)胞發(fā)育和分化。

Ascl1是堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic-helix-loop-helix,bHLH)轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員,該家族在神經(jīng)源性命運(yùn)決定(neurogenic fate determination)中起著重要作用[7]。Ascl1基因位于12號染色體長臂22區(qū)至23區(qū)上,其蛋白主要由兩組極性氨基酸殘基和位于第118～170號氨基酸序列組成的典型的堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,可以與目的基因啟動子的E-box模塊結(jié)合,促進(jìn)神經(jīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性,主要在發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)[8];Ascl1在神經(jīng)發(fā)育過程中有助于γ-氨基丁酸能中間神經(jīng)元的產(chǎn)生,參與了前腦發(fā)育過程中神經(jīng)決定(neural determination)和神經(jīng)元表型的確定,也在泛神經(jīng)發(fā)生(panneurogenic)和神經(jīng)元亞型決定中起著重要作用[9-10],并且對小腦、脊髓及視網(wǎng)膜等特定的細(xì)胞亞型也有著多重貢獻(xiàn)[11]。此外,Ascl1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的異位表達(dá)可以改變神經(jīng)祖細(xì)胞的分化方向,從而調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)[9]。

Heins等[12]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)源性的決定因子Pax6可以指導(dǎo)體外星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte,AST)轉(zhuǎn)分化為具有一定功能的神經(jīng)元,進(jìn)一步驗(yàn)證了特定因子的表達(dá)可以增強(qiáng)細(xì)胞的神經(jīng)元譜系特性,甚至指導(dǎo)非神經(jīng)元細(xì)胞的神經(jīng)發(fā)生,表明通過調(diào)控特定轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)可改變終末分化細(xì)胞的命運(yùn),并將其重編程為神經(jīng)元細(xì)胞。隨后,許多研究也證實(shí)了成纖維細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞或其他細(xì)胞能夠響應(yīng)Ascl1的異位表達(dá)重編程為誘導(dǎo)神經(jīng)元(induced neurons,iNs),并且能夠在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮功能,促進(jìn)了相關(guān)神經(jīng)功能的恢復(fù)[13]。

2 Ascl1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化

成纖維細(xì)胞起源于胚胎中胚層的間充質(zhì),增殖能力強(qiáng)且代謝旺盛,在體內(nèi)分布廣、數(shù)量多,并且具有多向分化能力,尤其是分化為成骨和成軟骨細(xì)胞、去分化為多能干細(xì)胞甚至轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元細(xì)胞[14-17]。目前已有多項研究利用Ascl1或多因子組合將成纖維細(xì)胞直接重編程為具有功能的誘導(dǎo)神經(jīng)元。

2.1 Ascl1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化

2010年,Vierbuchen等[18]篩選了在神經(jīng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子Ascl1、Brn2和Myt1,并以慢病毒為載體過表達(dá)于小鼠成纖維細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)單獨(dú)表達(dá)Ascl1能夠在體外誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞為具有未成熟電生理特性的iNs,而共表達(dá)Ascl1、Brn2和Myt1(ABM)三因子時,iNs表現(xiàn)出與內(nèi)源性成熟神經(jīng)元相似的膜電生理特性,并且這些iNs大多數(shù)為興奮性神經(jīng)元。Pfisterer等[19]在ABM三因子組合的基礎(chǔ)上共轉(zhuǎn)染指導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元命運(yùn)決定轉(zhuǎn)錄因子Lmx1a和FoxA2,觀察到成纖維細(xì)胞在體外誘導(dǎo)為功能性多巴胺能神經(jīng)元(induced dopaminergic neurons,iDANs),實(shí)現(xiàn)將成纖維細(xì)胞向特定神經(jīng)元亞型的成功轉(zhuǎn)化。非人類靈長類狨猴成纖維細(xì)胞在Ascl1結(jié)合microRNA-9/9*和microRNA-124誘導(dǎo)下也轉(zhuǎn)分化為具有自發(fā)神經(jīng)元活動的神經(jīng)元[20]。

以上研究僅證明了過表達(dá)Ascl1可將體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞重編程為iNs。Caiazzo等[21]將Ascl1、Nurr1和LMX1a因子共表達(dá)于小鼠、健康成人及帕金森患者供體來源的成纖維細(xì)胞,獲得了功能性iDANs,并成功移植到新生小鼠腦室中,對重編程技術(shù)在由體外到體內(nèi)移植的應(yīng)用進(jìn)行了研究,觀察到iNs能夠整合到宿主神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中獲得完整的神經(jīng)元多巴胺能細(xì)胞命運(yùn),并長期保持電生理活動。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),將Ascl1、Ngn2、Sox2、Nurr1和Pitx3多因子轉(zhuǎn)化的iDANs移植到帕金森大鼠疾病模型上后,iDANs能夠在體發(fā)揮多巴胺能神經(jīng)元的功能,緩解帕金森大鼠的相關(guān)運(yùn)動癥狀[22],實(shí)現(xiàn)了重編程iDANs由轉(zhuǎn)變形態(tài)到發(fā)揮功能的應(yīng)用。這一發(fā)現(xiàn)為未來帕金森疾病的治療提供了一個潛在有效的治療策略。

2.2 Ascl1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向氨基酸類神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化

除了多巴胺能神經(jīng)元外,Ascl1也能將成纖維細(xì)胞重編程為氨基酸類神經(jīng)元。Ascl1與Foxg1、Sox2、Dlx5和Lhx6多因子共同重編程成纖維細(xì)胞的功能性γ-氨基丁酸能神經(jīng)元,能夠整合到宿主神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中抑制宿主海馬體的興奮性神經(jīng)元[23],這一研究為治療癲癇或平衡其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的神經(jīng)元回路中抑制/興奮信號傳導(dǎo)提供了新的治療策略。

此外,Ascl1、Brn2、Myt1三因子(ABM)與其他因子共轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞為具有電生理特性的前腦谷氨酸能神經(jīng)元,這些iNs移植到哺乳動物腦室能夠與中樞神經(jīng)系統(tǒng)宿主神經(jīng)元建立突觸連接[24]。另一項研究通過將ABM因子與bHLH家族的NeuroD1在胎兒和人出生后成纖維細(xì)胞中共表達(dá),獲得的谷氨酸能神經(jīng)元,能夠形成功能性突觸整合到體外小鼠皮層神經(jīng)元共培養(yǎng)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中,但是在體內(nèi)的研究未能進(jìn)一步完善深入[25]。在此之前,科學(xué)家們應(yīng)用的重編程策略多為ABM三因子或在ABM因子的條件下添加其他因子誘導(dǎo)成熟神經(jīng)元的產(chǎn)生,但在沒有其他因子輔助的情況下,Chanda等[26]也證實(shí)了單因子Ascl1也足以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞為成熟谷氨酸能神經(jīng)元。

2.3 Ascl1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向5-羥色氨酸能神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化

FEV、Lmx1b和FoxA2是5-羥色胺能神經(jīng)元終末分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,Xu等[27]將其同Ascl1轉(zhuǎn)染于人成纖維細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞檢測到5-HT、AADC等神經(jīng)元標(biāo)志物的表達(dá),表現(xiàn)出自發(fā)動作電位和自發(fā)興奮性突觸后電流,表明經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為5-羥色胺能神經(jīng)元(Induced serotonergic neurons,iSNs)。這項研究與之前誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化研究一致,即在沒有Ascl1表達(dá)的條件下,神經(jīng)元的產(chǎn)生效率明顯受到影響。同年,Vadodaria等[28]發(fā)現(xiàn)在人成纖維細(xì)胞中過表達(dá)5-羥色胺能神經(jīng)元中高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子NKX2.2、FEV、GATA2和LMX1B與神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄因子Ascl1、NGN2,能高效轉(zhuǎn)化為5-羥色胺能神經(jīng)元。

除此之外,通過Ascl與其他因子共同作用于成纖維細(xì)胞重編程可誘導(dǎo)出視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、去甲腎上腺素能神經(jīng)元等[29-31]。

2.4 Ascl1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化的相關(guān)機(jī)制

ABM因子重編程成纖維細(xì)胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化過程中存在著分級機(jī)制,即Ascl1結(jié)合成纖維細(xì)胞中許多同神經(jīng)祖細(xì)胞相似的神經(jīng)元靶基因位點(diǎn),并打開封閉的染色質(zhì)、快速誘導(dǎo)染色質(zhì)重塑和核小體定相,在重編程早期具有主導(dǎo)靶向能力,發(fā)揮著“先驅(qū)轉(zhuǎn)錄因子”的作用[32-33]。進(jìn)一步單細(xì)胞測序分析提示,外源性Ascl1的過表達(dá)導(dǎo)致成纖維細(xì)胞相關(guān)基因的沉默和增強(qiáng)子的失活、神經(jīng)元靶基因的上調(diào)以及細(xì)胞周期基因的下調(diào),并參與神經(jīng)元形態(tài)學(xué)定義基因的表達(dá),從而誘導(dǎo)細(xì)胞退出細(xì)胞周期,進(jìn)入神經(jīng)元發(fā)育的起始階段,與此同時Ascl1重編程細(xì)胞過程中伴隨不同啟動子的高甲基化的發(fā)生,如單獨(dú)誘導(dǎo)非CG甲基化的獨(dú)特神經(jīng)元特征,而其他輔助轉(zhuǎn)錄因子如Brn2和Myt1等則針對競爭性成肌細(xì)胞程序,在從頭甲基化中抑制供體成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中的成肌細(xì)胞程序,從而指導(dǎo)更準(zhǔn)確的神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化程序,為神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化后期的成熟發(fā)育創(chuàng)造了有利條件[34-36]。

3 Ascl1誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化

星形膠質(zhì)細(xì)胞是成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布最為廣泛的細(xì)胞,約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的20%～40%[37]。在成人大腦中,成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞一般處于靜止?fàn)顟B(tài),當(dāng)大腦處于損傷或應(yīng)激狀態(tài)下,星形膠質(zhì)細(xì)胞則反應(yīng)性增生肥大,表達(dá)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein)、巢蛋白(nestin)等神經(jīng)前體細(xì)胞蛋白,此時星形膠質(zhì)細(xì)胞具有多能神經(jīng)干細(xì)胞的潛能[38],是神經(jīng)元重編程中最理想的細(xì)胞來源類型。

3.1 Ascl1誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化

Berninger等[39]利用Ascl1和Neurogenin2共同誘導(dǎo)出生后早期小鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化獲得iNs,這些iNs存在動作電位,但未建立功能性突觸輸出,也未確定具體亞型。Liu等[40]證實(shí)僅Ascl1的表達(dá)足以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的出生后及成年小鼠的中腦背側(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為功能性神經(jīng)元;該研究進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明,使用GFAP啟動子的腺相關(guān)病毒作為載體感染體內(nèi)中腦背側(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Ascl1,能夠有效將中腦背側(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為功能性GABA能及谷氨酸能神經(jīng)元。在DLX2協(xié)同Ascl1的作用下,體外皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞可定向誘導(dǎo)出功能性GABA能神經(jīng)元并建立功能性突觸輸出[41],而移植到內(nèi)側(cè)顳葉癲癇伴海馬硬化癥模型小鼠海馬體中的皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞可重新編程以產(chǎn)生GABA能iNs,并與顆粒細(xì)胞建立GABA能突觸整合到癲癇網(wǎng)絡(luò)中,以減少自發(fā)性復(fù)發(fā)性海馬癲癇發(fā)作[42]。

除氨基酸類神經(jīng)元外,Ascl1同NeuroD1、LMX1A、MiR218體外實(shí)驗(yàn)將人星形膠質(zhì)細(xì)胞重編程為多巴胺能神經(jīng)元,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)將帕金森成年小鼠紋狀體星形膠質(zhì)細(xì)胞重編程為多巴胺能神經(jīng)元,并實(shí)現(xiàn)對帕金森模型小鼠部分運(yùn)動障礙癥狀一定程度上的改善[3,43]。

在Ascl1誘導(dǎo)下,星形膠質(zhì)細(xì)胞可向不同的神經(jīng)元亞型轉(zhuǎn)分化,這可能是由于星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Notch1信號通路的水平導(dǎo)致了星形膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元重編程的敏感性不同[44],而不同的轉(zhuǎn)錄因子輔助以及星形膠質(zhì)細(xì)胞起源影響著重編程的方向[45],這對深入研究誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞定向重編程為特定亞型神經(jīng)元提供了新的切入點(diǎn),為治療人類神經(jīng)疾病補(bǔ)充各種神經(jīng)元亞型的細(xì)胞來源提供了新的可能。

3.2 Ascl1介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元的相關(guān)機(jī)制

Ascl1在重編程星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化過程中早期誘導(dǎo)了神經(jīng)源性程序——上調(diào)參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)發(fā)生調(diào)節(jié)的Insm1、Sox11、Sox4、Dll1等以及下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞中Aqp4、Slc1a3、Fgfr3和膠質(zhì)祖細(xì)胞中的Pax6、Fabp7、Vimentin等典型基因的表達(dá),提高Rcor2、Ncor2、Cbfa2t3等轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性[46],并結(jié)合了多個靶標(biāo)基因如KLF10、MyT1、MyT1L等進(jìn)行調(diào)控iNs細(xì)胞軸突形成及電生理成熟[47]。同時,Ascl1絲氨酸磷酸化受體位點(diǎn)突變增強(qiáng)成人皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)元轉(zhuǎn)化[48];神經(jīng)元富含的線粒體抗氧化蛋白如SOD1和PRDX2,通過對抗異常的活性氧來增加更多的細(xì)胞進(jìn)入神經(jīng)元轉(zhuǎn)化過程[49];作為抑制因子,NOTCH1信號傳導(dǎo)介導(dǎo)Ascl1驅(qū)動的星形膠質(zhì)細(xì)胞到神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化[50]。

4 Ascl1誘導(dǎo)Müller膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化及機(jī)制

Müller膠質(zhì)細(xì)胞具有干細(xì)胞潛能,是視網(wǎng)膜再生的可靠來源[51]。Müller膠質(zhì)細(xì)胞中Ascl1或協(xié)同Atoh1、Pou4f2,Islet1表達(dá),可轉(zhuǎn)化為視網(wǎng)膜神經(jīng)元,與宿主視網(wǎng)膜神經(jīng)元建立突觸連接,并對光做出反應(yīng),有效刺激視網(wǎng)膜再生[52-53]。

Ascl1在重編程Müller膠質(zhì)細(xì)胞的過程中,可與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)基因如Tubb3、NeuroD4等結(jié)合調(diào)控神經(jīng)發(fā)生[54],同時受到STAT信號途徑的調(diào)控影響,STAT信號途徑激活或與Ascl1結(jié)合誘導(dǎo)分化基因抑制劑(inhibitor of differentiation,Id)表達(dá),從而抑制Ascl1在Müller膠質(zhì)細(xì)胞亞群中啟動神經(jīng)發(fā)生;此外,STAT途徑的抑制導(dǎo)致Ascl1與非STAT靶標(biāo)的結(jié)合增加,導(dǎo)致神經(jīng)元基因的富集,實(shí)現(xiàn)Ascl1在神經(jīng)發(fā)生所需的基因上更有效的結(jié)合,促進(jìn)重編程的發(fā)生[55]。

5 Ascl1誘導(dǎo)其他非神經(jīng)元細(xì)胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化

在轉(zhuǎn)錄因子Ascl1重編程策略下,其他非神經(jīng)元細(xì)胞的研究也取得了一定進(jìn)展。在成年鼠損傷大腦皮層NG2膠質(zhì)細(xì)胞中過表達(dá)Ascl1和Sox2可誘導(dǎo)皮層的功能性iNs發(fā)生[56],體內(nèi)海馬原位神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中Ascl1和Dlx2可誘導(dǎo)GABA能iNs,減少內(nèi)側(cè)顳葉癲癇伴海馬硬化癥小鼠癲癇發(fā)作[36],Ascl1協(xié)同其他因子將成年人腦周細(xì)胞、多能干細(xì)胞成功重編程為功能性iNs[57-59],更有Ascl1對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行重編程的成功驗(yàn)證[60-61]。

6 總結(jié)和展望

近年來在直接神經(jīng)元重編程領(lǐng)域取得了長足的進(jìn)步,尤其是Ascl1相關(guān)的重編程方案正日趨成熟。利用Ascl1將非神經(jīng)元細(xì)胞直接重編程為神經(jīng)元細(xì)胞以代替特異性神經(jīng)元發(fā)揮功能,這對于更深入地研究神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的同一性和可塑性具有重大價值,同時為治療人腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病細(xì)胞代替治療、藥物發(fā)現(xiàn)和再生醫(yī)學(xué)研究開辟了一條全新的道路。體內(nèi)外的重編程已使得模型動物的神經(jīng)功能和相應(yīng)運(yùn)動癥狀得到顯著改善,但迄今為止僅僅局限于對局部神經(jīng)元、局部神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和相關(guān)運(yùn)動障礙癥狀的觀察。使用重編程的神經(jīng)元替換退化或損傷的神經(jīng)元,重編程后的神經(jīng)元產(chǎn)量如何維持穩(wěn)定、身份特性是否能維持長期穩(wěn)定,其新形成的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是否存在異常連接,正常的神經(jīng)通路是否受損以及如何整合到神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮功能仍未得到解答。此外,將非神經(jīng)元細(xì)胞如膠質(zhì)細(xì)胞在體重編程為誘導(dǎo)神經(jīng)元,其局部非神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)量和功能如何維系,也應(yīng)得到重視。神經(jīng)系統(tǒng)的重編程更深入的機(jī)制仍不十分明朗,這將不利于將細(xì)胞重編程技術(shù)應(yīng)用于未來神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中。因此,要將這項前沿技術(shù)運(yùn)用到實(shí)際臨床中,仍需對神經(jīng)元細(xì)胞直接重編程的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)連接以及重編程中的分子機(jī)制和細(xì)胞微環(huán)境進(jìn)一步探索。