牙齦卟啉單胞菌通過上調(diào)HIF-1α抑制食管鱗癌細(xì)胞鐵死亡*

郭 苒, 石林林, 程月月, 陳 攀, 朱巧晴, 杜玉博, 伍當(dāng)柔, 齊義軍, 高社干△

1河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院(臨床醫(yī)學(xué)院),腫瘤醫(yī)院,河南省微生態(tài)與食管癌防治重點實驗室,河南省腫瘤表觀遺傳重點實驗室,洛陽 471003 2河南科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院,洛陽 471023

食管癌位居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第7位,2020年全世界新發(fā)食管癌病例約60.4萬人,其中一半以上來自中國[1-2]。在我國,食管鱗狀細(xì)胞癌(食管鱗癌,esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是食管癌的主要組織學(xué)亞型,占所有食管癌病例的90%以上[3]。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)是一種革蘭氏陰性厭氧菌,是牙周病的關(guān)鍵致病菌,可誘發(fā)口腔微生態(tài)失衡,造成牙周炎和牙齒缺失,與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-6]。流行病學(xué)研究表明,中國食管癌高發(fā)區(qū)林州市牙齒缺失居民的ESCC發(fā)生風(fēng)險顯著升高[6]。還有研究報道,河南食管癌高發(fā)區(qū)ESCC患者食管癌組織P.gingivalis豐度明顯高于癌旁組織,該研究認(rèn)為P.gingivalis富集與ESCC侵襲轉(zhuǎn)移等惡性演進(jìn)顯著相關(guān),是ESCC預(yù)后的獨立危險因素之一[7]。另有研究表明,P.gingivalis感染ESCC細(xì)胞后,能夠顯著增加ESCC細(xì)胞對順鉑、紫杉醇等化療藥物抵抗,并降低化療藥物作用后ESCC細(xì)胞的凋亡率[8]。

與壞死、凋亡等不同,鐵死亡是亞鐵離子依賴性,由脂質(zhì)過氧化物堆積導(dǎo)致的一種新型細(xì)胞死亡方式[9-10]。雖然凋亡是化療藥物引發(fā)腫瘤細(xì)胞死亡、降低腫瘤負(fù)荷的主要方式,但是,化療藥物也能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡,并與化療耐藥關(guān)系密切[11]。在大腸癌[11]、胃癌[12]、胰腺癌[13]、肺癌[14]、三陰性乳腺癌[15]等多種惡性腫瘤中,鐵死亡誘導(dǎo)劑與抗腫瘤藥物的聯(lián)合作用,能夠通過多種方式殺傷癌細(xì)胞,更高效地清除癌細(xì)胞。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是一種具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白,是介導(dǎo)缺氧狀態(tài)下腫瘤細(xì)胞適應(yīng)性調(diào)節(jié)的因子之一。HIF-1α可通過促進(jìn)糖酵解來增加腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng),從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[16]?，F(xiàn)有研究已表明,HIF-1α是調(diào)節(jié)鐵死亡的關(guān)鍵蛋白之一[17-19]。然而,鐵死亡在ESCC發(fā)生發(fā)展過程中的作用及機(jī)制,尤其是P.gingivalis感染對其的影響,目前尚不清楚。因此,本研究主要探討P.gingivalis感染對ESCC細(xì)胞鐵死亡的影響,以及HIF-1α抑制劑與鐵死亡誘導(dǎo)劑聯(lián)用對P.gingivalis感染陽性ESCC的治療效果。

1 材料與方法

1.1 食管鱗癌樣本來源

94例ESCC組織樣本來自河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院食管腫瘤外科接受初次手術(shù)治療的ESCC患者,所有ESCC患者術(shù)前均未接受放化療,手術(shù)切除樣本經(jīng)病理學(xué)診斷為食管鱗狀細(xì)胞癌,收集到的所有樣本均用于免疫組化染色分析,并經(jīng)過河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 免疫組化實驗

應(yīng)用PV-9000試劑盒(中杉金橋)進(jìn)行組織P.gingivalis、谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)和HIF-1α表達(dá)水平的免疫組化檢測。94例ESCC組織進(jìn)行包埋、切片、烤片、脫蠟、水化,EDTA抗原修復(fù)液于100℃進(jìn)行抗原修復(fù)20 min,冷卻至室溫后,分別加入鼠抗P.gingivalis(1∶100,ANT0085,DIATHEVA)、兔抗GPX4(1∶100,ab125066,Abcam)、兔抗HIF-1α(1∶100,ab51608,Abcam)等一抗4℃孵育過夜,抗鼠/兔二抗孵育1 h,DAB顯色,蘇木精復(fù)染。根據(jù)切片中胞質(zhì)及胞核著色的陽性細(xì)胞數(shù)和著色強(qiáng)度進(jìn)行免疫組化綜合評分,每張切片隨機(jī)選取5個視野(×200),用Image J進(jìn)行定量分析,計算每個視野陽性染色的百分比,評估P.gingivalis、GPX4和HIF-1α表達(dá)的陽性率。

1.3 食管鱗癌細(xì)胞和牙齦卟啉單胞菌培養(yǎng)

ESCC細(xì)胞KYSE30和KYSE70由河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤表觀遺傳實驗室保存,復(fù)蘇后用含10% FBS(164210,Procell)的RPMI-1640(PM150110,Pricella)培養(yǎng)液于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞生長至80%～90%融合度時傳代,取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。P.gingivalis33277來源于美國標(biāo)準(zhǔn)菌株庫ATCC,培養(yǎng)于含5% CO2、10% H2和85% N2的37℃厭氧培養(yǎng)箱中18～24 h后,取對數(shù)生長期的菌液(1×109CFU/mL,A600nm=1.5,以MOI 20感染ESCC細(xì)胞),12000 r/min、4℃離心5 min,棄去上清,PBS重懸,感染細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞活力、細(xì)胞內(nèi)丙二醛及活性氧水平測定

將對數(shù)生長期的KYSE30和KYSE70細(xì)胞接種至96孔板或10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞貼壁后,感染P.gingivalis,加入鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3 2.5 μmol/L(1219810-16-8,MCE)和(或)HIF-1α抑制劑LW6 10 μmol/L(934593-90-5,MCE)及鐵死亡抑制劑Ferrostain-1 60 nmol/L(347174-05-4,MCE)至各實驗終止時(12 h或24 h)檢測細(xì)胞活力,每孔加入10 μL CCK-8溶液(Invigentech),孵育2 h,酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度(A450nm),按公式計算細(xì)胞活力:細(xì)胞活力(%)=(A加藥組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。根據(jù)丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒(BC0025,Solarbio)和活性氧(reactive oxygen,ROS)檢測試劑盒(S0033S,碧云天)說明書檢測并計算細(xì)胞內(nèi)MDA和ROS含量。在前述分組基礎(chǔ)上,進(jìn)一步添加順鉑30 μmol/L(Cisplatin,P4394,Sigma)作為陽性對照,進(jìn)行上述細(xì)胞功能評估。

1.5 平板克隆實驗

取對數(shù)生長期的ESCC細(xì)胞,以500個/孔接種于6孔板中,待細(xì)胞貼壁,經(jīng)P.gingivalis感染24 h后使用RSL3和(或)LW6處理,于37 ℃、5% CO2條件下持續(xù)培養(yǎng)14 d,棄去培養(yǎng)液,PBS洗滌3次,4%甲醛固定1 h,結(jié)晶紫染液染色30～60 min,PBS洗去多余染料,晾干,拍照后計數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)。

1.6 Western blot實驗

取對數(shù)生長期的細(xì)胞,以3×105個/皿接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞貼壁后,經(jīng)P.gingivalis感染處理24 h,使用RSL3或LW6處理24 h后終止實驗,RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞、提取蛋白,BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE分離蛋白,電轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉,分別孵育一抗GPX4(1∶1000,ab125066,Abcam)、HIF-1α(1∶1000,ab51608,Abcam)和GAPDH(1∶2500,CW0100 M,康為世紀(jì))和相應(yīng)二抗(1∶5000),ECL曝光顯示目的蛋白條帶,以GAPDH為參照對目的蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量。

1.7 qRT-PCR檢測

取對數(shù)期生長的ESCC細(xì)胞,分組處理后,以Trizol(15596026,Invitrogen)提取總RNA,按HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(R211,Vazyne)操作說明,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(Q111,Vazyne)進(jìn)行PCR,檢測HIF-1α及其靶基因脂肪酸結(jié)合蛋白3(FABP3)、脂肪酸結(jié)合蛋白7(FABP7)的mRNA水平,用2-ΔΔCt方法計算每個基因的相對表達(dá)量。引物序列詳見表1。

表1 qRT-PCR引物序列表

1.8 免疫熒光實驗

將對數(shù)生長期的ESCC細(xì)胞以8×103個/皿接種于共聚焦培養(yǎng)皿中,以P.gingivalis感染24 h,洗滌、甲醛固定、透化、封閉,孵育HIF-1α一抗(1∶100,ab51608,Abcam)和熒光標(biāo)記的二抗,DAPI復(fù)染細(xì)胞核,共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。

1.9 動物實驗及分組

取6～8周齡BALB/c-nu雄性裸鼠(北京維通利華),體重18～20 g,共34只。于裸鼠右側(cè)后背部皮下接種經(jīng)P.gingivalis以MOI 20感染24 h和未感染的KYSE70細(xì)胞(3×106/只),皮下荷瘤長至100 mm3后,分為對照組、P.gingivalis感染組、RSL3組、P.gingivalis和RSL3聯(lián)合處理組、P.gingivalis和RSL3及LW6聯(lián)合處理組,每組6只。RSL3處理組及LW6處理組按同等劑量采取腹腔注射(50 mg/kg,溶劑為40% PEG300),一周2次,每次100 μL;聯(lián)合處理組相應(yīng)藥物給藥方式同上所述,28 d實驗終止。實驗過程中測量腫瘤大小(最大長徑a和最小短徑b),實驗終止時剝離瘤體稱重并計算瘤體體積(a×b2/2)。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 26.0和Graphpad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,Western blot與PCR結(jié)果的差異分析采用t檢驗,P.gingivalis豐度和HIF-1α蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析采用卡方檢驗,實驗終點的腫瘤生長曲線采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 P.gingivalis抑制食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡

為研究P.gingivalis感染對ESCC細(xì)胞鐵死亡過程的影響,本研究首先對KYSE30和KYSE70細(xì)胞進(jìn)行P.gingivalis感染,然后加入鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3處理,通過CCK-8檢測不同處理組的細(xì)胞活力。結(jié)果顯示,P.gingivalis感染顯著促進(jìn)KYSE30和KYSE70細(xì)胞增殖;RSL3處理顯著抑制KYSE30和KYSE70細(xì)胞增殖,加入鐵死亡抑制劑Ferrostain-1后,RSL3對ESCC細(xì)胞的增殖抑制作用減弱;P.gingivalis感染也可顯著降低RSL3對ESCC細(xì)胞的增殖抑制作用(均P<0.05,圖1A、1B)。

1:Uninfected;2:P.gingivalis;3:RSL3;4:RSL3+P.gingivalis;5:RSL3+Ferrostain-1;6:positive control;A:CCK-8檢測細(xì)胞活力;B:平板克隆實驗檢測細(xì)胞增殖;C:化學(xué)法檢測細(xì)胞中MDA含量;D:流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞ROS含量;E:Western blot檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)水平;F:免疫組化實驗檢測ESCC組織中GPX4的表達(dá)(×200);*P<0.05,**P<0.01

檢測ESCC細(xì)胞經(jīng)P.gingivalis和(或)RSL3處理后鐵死亡的標(biāo)志性代謝產(chǎn)物MDA(圖1C)和ROS(圖1D)含量的變化。結(jié)果表明,RSL3處理KYSE30和KYSE70細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)MDA和ROS含量顯著升高;P.gingivalis感染后,接受RSL3處理的KYSE30和KYSE70細(xì)胞中MDA和ROS含量降低(均P<0.05,圖1C、1D)。Western blot結(jié)果表明,與RSL3單獨處理組相比,P.gingivalis感染可顯著升高KYSE30和KYSE70細(xì)胞中鐵死亡核心調(diào)控蛋白GPX4的蛋白表達(dá)水平(圖1E),提示P.gingivalis對ESCC細(xì)胞鐵死亡起抑制作用。免疫組化檢測ESCC組織中GPX4蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)P.gingivalis感染的ESCC組織中GPX4蛋白表達(dá)也增高(P<0.05,圖1F)。

2.2 P.gingivalis感染上調(diào)食管鱗癌中HIF-1α的表達(dá)水平

免疫組化結(jié)果顯示,P.gingivalis感染陽性(40.4%,38/94)的ESCC組織樣本中HIF-1α表達(dá)陽性率顯著升高(78.9%,30/38),且P.gingivalis感染陽性與ESCC組織中HIF-1α高表達(dá)陽性率顯著相關(guān)(χ2=13.2,P<0.01)(圖2A)。接下來,分別從基因和蛋白水平檢測了P.gingivalis感染KYSE30和KYSE70細(xì)胞后HIF-1α的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,P.gingivalis感染顯著提高KYSE30和KYSE70細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)水平(圖2B、2C)。此外,免疫熒光結(jié)果顯示P.gingivalis感染可顯著促進(jìn)ESCC細(xì)胞核周HIF-1α的聚集(圖2D)。進(jìn)一步通過qRT-PCR檢測P.gingivalis感染對KYSE30和KYSE70細(xì)胞HIF-1α下游靶基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,P.gingivalis感染可顯著提高HIF-1α下游靶基因FABP3和FABP7的mRNA表達(dá)水平(圖2E)。

A:免疫組化檢測P.gingivalis高、低豐度ESCC組織中HIF-1α表達(dá)情況(×200);B:qRT-PCR檢測ESCC細(xì)胞感染P.gingivalis后HIF-1α mRNA表達(dá)量變化;C:Western blot檢測ESCC細(xì)胞感染P.gingivalis后HIF-1α蛋白表達(dá)量變化;D:免疫熒光檢測ESCC細(xì)胞感染P.gingivalis后細(xì)胞中HIF-1α分布變化;E:qRT-PCR檢測ESCC細(xì)胞感染P.gingivalis后HIF-1α靶基因FABP3和FABP7的表達(dá)情況;*P<0.05,**P<0.01

2.3 HIF-1α介導(dǎo)P.gingivalis誘導(dǎo)的ESCC細(xì)胞鐵死亡抗性

為明確HIF-1α在P.gingivalis感染的KYSE30和KYSE70細(xì)胞發(fā)生鐵死亡過程中的作用,本研究首先用HIF-1α抑制劑LW6單獨處理ESCC細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)LW6能夠明顯抑制HIF-1α蛋白表達(dá);而與LW6單獨處理組相比,P.gingivalis感染聯(lián)用LW6組的HIF-1α蛋白表達(dá)未見明顯上調(diào)(圖3A)。進(jìn)一步,與P.gingivalis+RSL3處理組相比,同時應(yīng)用HIF-1α抑制劑LW6聯(lián)合處理后,ESCC細(xì)胞活力降低,MDA水平升高,說明LW6能夠抑制P.gingivalis感染所誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖,同時降低鐵死亡抗性(圖3B～3D)。

1:Uninfected;2:P.gingivalis;3:RSL3;4:RSL3+P.gingivalis;5:RSL3+LW6;6:RSL3+LW6+P.gingivalis;7:Cisplatin;8:Cisplatin+P.gingivalis;9:Cisplatin+LW6;10:Cisplatin+LW6+P.gingivalis;A:Western blot檢測HIF-1α的蛋白表達(dá)水平;B:CCK-8檢測細(xì)胞活力;C:平板克隆實驗檢測細(xì)胞增殖;D:化學(xué)法檢測細(xì)胞MDA含量;E:Western blot檢測GPX4蛋白表達(dá);F:P.gingivalis感染對順鉑作用的影響;*P<0.05,**P<0.01

Western blot結(jié)果顯示,在P.gingivalis感染基礎(chǔ)上,LW6和RSL3聯(lián)合使用較RSL3單獨處理組GPX4蛋白的表達(dá)量降低,提示LW6處理可逆轉(zhuǎn)P.gingivalis感染誘導(dǎo)的ESCC細(xì)胞鐵死亡抗性(圖3E)。與文獻(xiàn)報道一致[12],P.gingivalis感染可以降低順鉑對ESCC細(xì)胞的敏感性,而同時使用LW6可靶向抑制HIF-1α進(jìn)而改善P.gingivalis誘導(dǎo)的鐵死亡抗性,從而增強(qiáng)順鉑對ESCC細(xì)胞的殺傷作用(圖3F)。

2.4 P.gingivalis感染影響HIF-1α表達(dá)抑制RSL3抗腫瘤療效的體內(nèi)實驗

為了進(jìn)一步在體內(nèi)驗證P.gingivalis感染上調(diào)HIF-1α從而抑制ESCC細(xì)胞鐵死亡的作用,本研究采用經(jīng)P.gingivalis感染的KYSE70細(xì)胞建立裸鼠皮下荷瘤模型,再分別給予RSL3單獨或聯(lián)合LW6處理。

結(jié)果表明,與對照組相比,P.gingivalis感染可顯著促進(jìn)荷瘤小鼠腫瘤體積的增長[(582.0±16.1)mm3vs.(881.0±14.7)mm3,P<0.05];與RSL3單獨處理[(456.0 ±8.3)mm3]相比,P.gingivalis感染能夠降低RSL3的抑瘤作用[(508.0±14.8)mm3],上述作用可被LW6聯(lián)合作用[(315.0±12.4)mm3]顯著抑制(圖4)。

3 討論

P.gingivalis是ESCC發(fā)生、發(fā)展過程中的重要危險因素之一[7]。研究提示,ESCC組織中P.gingivalis豐度與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、TNM分期和總生存期縮短呈顯著正相關(guān)[7-8]。新輔助放化療聯(lián)合食管切除是可手術(shù)切除ESCC患者首選的治療方式,患者生存獲益優(yōu)于單純手術(shù)治療[20-21]。多烯紫杉醇、順鉑和5-氟尿嘧啶(5-Fu)是目前臨床常用的ESCC化療藥物,大部分初治的ESCC患者對這些化療藥物敏感,但化療過程中發(fā)生的化療耐藥導(dǎo)致超過70%的ESCC患者治療失敗,5年生存率低于30%[22-23]。P.gingivalis感染KYSE30細(xì)胞后,通過STAT3激活Caspase 3,降低了紫杉醇、5-Fu和順鉑誘導(dǎo)的KYSE30凋亡發(fā)生率,表明P.gingivalis感染降低了ESCC細(xì)胞對化療藥物的敏感性,進(jìn)而誘導(dǎo)化療耐藥。P.gingivalis陰性ESCC患者總生存期>60個月,而P.gingivalis陽性患者僅為26個月[8]。此外,P.gingivalis還可通過調(diào)控溶質(zhì)運載蛋白7家族成員11來促進(jìn)P.gingivalis在胞內(nèi)的定植,從而促進(jìn)ESCC細(xì)胞的增殖[24]。因此,P.gingivalis刺激的ESCC細(xì)胞增殖和抗凋亡能力增強(qiáng)是ESCC患者預(yù)后不良的重要危險因素。

鐵死亡具有特征性的形態(tài)學(xué)、生化特征和分子學(xué)基礎(chǔ),是與凋亡、壞死和自噬不同的細(xì)胞死亡方式,且凋亡、壞死和自噬的小分子抑制劑不能阻斷鐵死亡的發(fā)生,鐵死亡為腫瘤的治療提供了新的選擇[9]。多數(shù)的化療藥物是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡清除腫瘤細(xì)胞,而順鉑不僅能夠誘導(dǎo)A549和HCT116細(xì)胞凋亡,還能降低胞內(nèi)谷胱甘肽含量和滅活谷胱甘肽過氧化物酶(GPXs),誘導(dǎo)這兩種癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[11]。一些小分子化合物如Erastin和RSL3通過抑制胱氨酸-谷氨酸交換系統(tǒng)Xc-或GPX4誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[9-11,25]。本研究表明,P.gingivalis感染ESCC細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA降低,GPX4表達(dá)升高,進(jìn)而降低RSL3誘導(dǎo)的KYSE30和KYSE70細(xì)胞鐵死亡,提示P.gingivalis可能通過多種機(jī)制與感染的宿主細(xì)胞共存,促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

低氧廣泛存在于細(xì)胞和組織中,尤其是腫瘤組織中,缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)是細(xì)胞感受和適應(yīng)組織低氧的重要機(jī)制之一。HIF包括HIF-1α、HIF-2α及HIF-3α,其中HIF-1α的表達(dá)受氧含量調(diào)節(jié)[26]。由于惡性腫瘤生長迅速,惡性腫瘤組織長期處于低氧狀態(tài),為了適應(yīng)低氧環(huán)境,HIF-1α在多種不同類型的惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增加[27]。HIF-1α能夠誘導(dǎo)多種血管生長因子的表達(dá),如血管內(nèi)皮生長因子和血管生成素1/2[28],促進(jìn)腫瘤血管形成。缺氧狀態(tài)下,ESCC細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)增加,繼而促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1及己糖激酶-Ⅱ等糖酵解相關(guān)酶表達(dá),表明HIF-1α能夠通過促進(jìn)糖酵解來增加腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[29]。有研究證實,HIF-1α表達(dá)下調(diào)可以促進(jìn)RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡過程[18]。且在缺氧條件下HIF-1α誘導(dǎo)的FABP3和FABP7表達(dá)對脂質(zhì)儲存至關(guān)重要[30],與細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化有關(guān)。另有研究表明,P.gingivalis感染能夠干擾牙膜周細(xì)胞中糖酵解和三羧酸循環(huán)通路相關(guān)基因的表達(dá),并降低脯氨酸羥化酶2(prolyl hydroxylase 2,PHD2)和核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)表達(dá),抑制PHD2依賴的HIF-1α降解。本研究結(jié)果證實,P.gingivalis誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)上調(diào),介導(dǎo)鐵死亡抗性產(chǎn)生,HIF-1α抑制劑LW6能夠逆轉(zhuǎn)P.gingivalis誘導(dǎo)的ESCC細(xì)胞鐵死亡抗性,提示HIF-1α是克服ESCC耐藥的潛在靶點分子。

綜上所述,本實驗證實P.gingivalis可通過上調(diào)ESCC中HIF-1α的表達(dá),介導(dǎo)ESCC細(xì)胞鐵死亡抗性發(fā)生,抑制HIF-1α能夠恢復(fù)P.gingivalis感染的ESCC細(xì)胞對鐵死亡誘導(dǎo)劑的敏感性,是克服ESCC多重耐藥的潛在靶點分子。