IL-6對小鼠胚胎心肌細(xì)胞增殖能力的影響及發(fā)育依賴性變化*

顧浩南, 王 淇, 孫惠美, 周 易, 梁華敏△

1華中科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系,湖北省藥物靶點和藥效學(xué)評價重點實驗室,武漢 430030 2華中科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心,武漢 430030

近年來,諸多研究發(fā)現(xiàn)成年動物心臟仍然具有一定的心肌更新即分裂增殖[1-4],心肌再生科學(xué)研究的最重大突破是基本確立成年動物新生心肌細(xì)胞的確切來源。利用cre轉(zhuǎn)基因老鼠準(zhǔn)確追蹤新生心肌細(xì)胞的來源,發(fā)現(xiàn)已經(jīng)存在的心肌細(xì)胞是哺乳動物發(fā)育過程中或急性心梗后心肌再生的確切來源[2,4-6]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn),哺乳動物發(fā)育過程中心肌細(xì)胞增殖能力逐漸下降,并伴隨著心肌細(xì)胞核倍型的變化[7]:在哺乳動物出生后,具有增殖能力的單核二倍體心肌細(xì)胞伴隨著血壓或電生理學(xué)特點的變化逐漸發(fā)生多核/多倍體化,同時逐漸失去增殖能力。

心梗后心肌細(xì)胞增殖能力增強[8-9],而IL-6是心臟微環(huán)境中重要的細(xì)胞因子之一。已有研究發(fā)現(xiàn),IL-6可上調(diào)新生鼠心肌細(xì)胞的增殖能力而促進(jìn)新生鼠急性心梗后的心功能修復(fù)[10]。IL-6主要作用模式是和靶細(xì)胞膜受體或血液/組織液中可溶性受體結(jié)合后,進(jìn)一步通過靶細(xì)胞膜表面的gp130蛋白激活JAK-STAT3、SHP2-RAS-ERK和PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),從而發(fā)揮生物學(xué)作用[11-13]。研究發(fā)現(xiàn)gp130蛋白激活不僅影響青春期和成年小鼠的心肌增殖,也影響急性心梗后的心肌細(xì)胞再生[14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),小鼠個體發(fā)育過程中心臟內(nèi)IL-6的濃度發(fā)生變化[15],并且哺乳動物心肌細(xì)胞類型以及增殖能力也在發(fā)生動態(tài)變化[7-8]。這些變化是否會影響IL-6對內(nèi)源性心肌再生的作用仍需要進(jìn)一步研究。

本課題旨在探討IL-6對小鼠胚胎發(fā)育過程中心肌細(xì)胞增殖能力的影響,分析可能的發(fā)育依賴性變化及濃度性依賴性變化。這些研究結(jié)果不僅為心肌細(xì)胞的發(fā)育研究增加新的內(nèi)容,也為探索成年動物急性心梗后內(nèi)環(huán)境對內(nèi)源性心肌再生影響提供線索,為有效激活內(nèi)源性心肌細(xì)胞再生治療心臟疾病提供新思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 胚胎心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

6～8周齡的C57BL/6雌性小鼠(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)以2∶1比例和雄性小鼠合籠一夜,第2天早上若受孕,則胚胎被記為0.5 d(embryonic day 0.5,E0.5)。胚胎發(fā)育早期(EDS,E10.5～E12.5)和發(fā)育晚期(LDS,E16.5～E18.5)的胚胎小鼠的心臟組織剪碎后于37℃恒溫條件下在膠原酶Collagenase B solution(1 mg/mL,Roche,德國)中孵育20～25 min以獲得單個細(xì)胞。心肌細(xì)胞在20%DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后分別在培養(yǎng)液中加入10 ng/mL和50 ng/mL IL-6(Peprotech,美國)處理24 h。20% DMEM(100 mL)含有20 mL胎牛血清(Gibco,美國)和80 mL DMEM(Gibco,美國)。

1.2 免疫熒光技術(shù)檢測心肌細(xì)胞增殖能力

在IL-6處理心肌細(xì)胞的同時,在培養(yǎng)液中添加BrdU(3 ng/mL)(Boster,中國)處理24 h;棄上清后預(yù)處理(4%多聚甲醛20 min,0.3%Triton X-100 15 min,3%BSA室溫1 h),后將心肌細(xì)胞在兔抗小鼠α-actinin抗體溶液(1∶100,Proteintech,美國)和抗小鼠BrdU單克隆抗體溶液(1∶100,Proteintech,美國)中4℃孵育過夜。然后細(xì)胞在山羊抗兔IgG-FITC溶液(1∶50,Proteintech,美國)和山羊抗小鼠IgG-TRITC溶液(1∶50,Proteintech,美國)在室溫下孵育1 h。最后用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,Beyotime,中國)對細(xì)胞核染色10 min,之后使用ImmunoFloure(Olumpus,日本)進(jìn)行拍照,計數(shù)BrdU+α-actinin+細(xì)胞核比例和BrdU+α-actinin+單核心肌細(xì)胞比例。

1.3 Western blot檢測

利用Western blot技術(shù)檢測信號通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平。具體流程如下:收集IL-6處理后的心肌細(xì)胞,或不同發(fā)育時間點的心臟組織,使用RIPA裂解液[50 mmol/L Tris(pH=7.4),150 mmol/L NaCl,1%Triton X-100,1%脫氧膽酸鈉,0.1%SDS和1 mmol/L苯甲基磺酰氟]制備可溶性標(biāo)志蛋白的樣品,繼而使用BCA蛋白分析試劑盒(Pierce,美國)測定標(biāo)志蛋白的濃度。制備SDS-PAGE凝膠,在每條泳道上添加30 μg蛋白質(zhì)樣品電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,最后加入抗體溶液進(jìn)行孵育并使用Kodak BioMax ML膠片檢測免疫反應(yīng)條帶。實驗應(yīng)用的抗體分別為:兔抗鼠ERK1/2單抗(1∶1000,杭州華安生物技術(shù)有限公司,中國)和兔抗鼠p-ERK1/2單抗(1∶2000,Cell Signaling Technology,美國),USA兔抗鼠Akt單抗(1∶1000,杭州華安生物技術(shù)有限公司,中國)和兔抗鼠p-Akt多克隆抗體(1∶1000,杭州華安生物技術(shù)有限公司,中國),兔抗STAT3鼠多克隆抗體(1∶200,杭州華安生物技術(shù)有限公司,中國)和鼠抗鼠p-STAT3單抗(1∶200,Santa Cruz Biotechnology,美國)以及鼠抗鼠GAPDH單抗(1∶5000,湖北百奧斯生物科技有限公司,中國)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 IL-6影響胚胎心肌細(xì)胞的增殖能力并具有發(fā)育依賴性變化

隨著心臟的發(fā)育成熟,小鼠心肌細(xì)胞逐漸從單核二倍體轉(zhuǎn)變成雙核四倍體[7-9]。而單核二倍體心肌細(xì)胞被認(rèn)為是成年哺乳動物心肌再生能力的關(guān)鍵細(xì)胞來源[16-17]。因此,我們同時統(tǒng)計了IL-6對所有心肌細(xì)胞核以及對單核心肌細(xì)胞增殖能力的影響。我們發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎心肌細(xì)胞增殖能力隨著發(fā)育成熟逐漸下降(圖1A、1B),主要體現(xiàn)為LDS的BrdU+α-actinin+細(xì)胞核比例和BrdU+α-actinin+單核心肌細(xì)胞比例均顯著低于EDS。其中,LDS的BrdU+α-actinin+單核心肌細(xì)胞比例為0(圖1B)。

A:免疫熒光技術(shù)檢測BrdU+α-actinin+心肌細(xì)胞;B:胚胎心肌細(xì)胞增殖能力發(fā)育依賴性下降,n=5;C:IL-6對EDS心肌細(xì)胞增殖能力的影響,n=6;D:IL-6對LDS心肌細(xì)胞增殖能力的影響,n=5;EDS:胚胎發(fā)育早期;LDS:胚胎發(fā)育晚期;與對照組比較,**P< 0.01;##P< 0.01

IL-6對胚胎心肌細(xì)胞增殖能力的影響具有發(fā)育依賴性。10 ng/mL IL-6不改變EDS的BrdU+α-actinin+細(xì)胞核比例和BrdU+α-actinin+單核心肌細(xì)胞比例(圖1C),但顯著增加LDS的BrdU+α-actinin+細(xì)胞核比例和BrdU+α-actinin+單核心肌細(xì)胞比例(圖1D)。

IL-6的作用具有濃度依賴性[18]。我們增加IL-6濃度至50 ng/mL,發(fā)現(xiàn)50 ng/mL IL-6減少EDS的BrdU+α-actinin+單核心肌細(xì)胞比例(圖1C);但對LDS BrdU+α-actinin+單核心肌細(xì)胞促增殖作用顯著強于10 ng/mL IL-6(圖1D)。50 ng/mL IL-6對EDS和LDS的BrdU+α-actinin+單核心肌細(xì)胞比例的反向作用,再次提示IL-6對胚胎心肌細(xì)胞增殖能力的影響具有細(xì)胞發(fā)育程度依賴性。

2.2 IL-6對胚胎心肌細(xì)胞3種信號通路關(guān)鍵蛋白磷酸化水平的影響

IL-6的生物學(xué)作用主要通過靶細(xì)胞膜表面的gp130蛋白激活JAK-STAT3、SHP2-RAS-ERK和PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來實現(xiàn)[10-13],因此我們進(jìn)一步利用Western blot技術(shù)檢測IL-6作用下gp130蛋白介導(dǎo)的3條不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵蛋白質(zhì)磷酸化水平。在EDS,10 ng/mL和50 ng/mL IL-6增加Akt、ERK和STAT3的蛋白總量,也增加3種蛋白的磷酸化水平(圖2A);但只抑制pAkt/Akt比值,對心肌細(xì)胞的pERK/ERK比值和pSTAT3/STAT3比值并無顯著影響(圖2B)。在LDS,10 ng/mL和50 ng/mL IL-6對Akt、ERK和STAT3的蛋白總量,以及3種蛋白的磷酸化水平的影響與其對EDS的作用相似(圖3A),但顯著增加pSTAT3/STAT3比值(圖3B)。這些結(jié)果提示IL-6并不同步影響JAK-STAT3、SHP2-RAS-ERK和PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,并且該作用與IL-6對胚胎心肌細(xì)胞的增殖能力的影響相似,同樣具有發(fā)育依賴性。

A:IL-6對心肌細(xì)胞ERK、Akt和STAT3的磷酸化水平的影響;B:半定量分析IL-6處理后ERK、Akt和STAT3的磷酸化水平的變化;n=3;與對照組比較,*P< 0.05

A:IL-6對心肌細(xì)胞ERK、Akt和STAT3的磷酸化水平的影響;B:半定量分析IL-6處理后ERK、Akt和STAT3的磷酸化水平的變化;n=3;與對照組比較,*P< 0.05

2.3 不同發(fā)育階段gp130蛋白介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基礎(chǔ)狀態(tài)不同

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)對胚胎心肌細(xì)胞增殖能力的影響同樣具有發(fā)育依賴性,并且和信號通路基礎(chǔ)狀態(tài)有關(guān),即由于EDS心肌的基礎(chǔ)STAT3磷酸化水平高于LDS,DMSO促進(jìn)STAT3磷酸化的程度在LDS比EDS更顯著,所以DMSO在增加LDS心肌細(xì)胞增殖能力的作用也顯著高于EDS[19]。因此我們繼續(xù)采用Western blot檢測上述幾個關(guān)鍵蛋白質(zhì)在發(fā)育過程中的基礎(chǔ)水平,發(fā)現(xiàn)隨著胚胎發(fā)育成熟,ERK、Akt和STAT3的總蛋白和3種蛋白質(zhì)磷酸化水平均呈發(fā)育依賴性下降(圖4A)。通過半定量分析,pERK/ERK和pSTAT3/STAT3的比值也隨著發(fā)育成熟逐漸下降,尤其是pSTAT3/STAT3比值在胚胎期已經(jīng)出現(xiàn)明顯下降;而pAkt/Akt比值隨發(fā)育逐漸增加(圖4B)。

EDS:胚胎發(fā)育早期,LDS:胚胎發(fā)育晚期,P7:出生后7 d;P14:出生后14 d;Adult:成年小鼠;n=3

3 討論

我們的既往研究發(fā)現(xiàn)心臟成纖維細(xì)胞分泌IL-6的能力呈發(fā)育依賴性上升[15],在小鼠胚胎干細(xì)胞離體心肌分化過程中IL-6作用具有發(fā)育依賴性變化[18]。而自然情況下,隨著個體發(fā)育成熟心肌細(xì)胞的分裂增殖能力逐漸下降[7]。本研究發(fā)現(xiàn)EDS心肌細(xì)胞的增殖能力顯著高于LDS心肌細(xì)胞。尤為重要的是,我們發(fā)現(xiàn)IL-6對心肌細(xì)胞增殖的影響具有發(fā)育依賴性變化:10 ng/mL IL-6對EDS心肌細(xì)胞增殖能力并無明顯影響,而50 ng/mL IL-6減少BrdU+單核心肌細(xì)胞數(shù)目;而10 ng/mL和50 ng/mL IL-6均增加LDS BrdU+α-actinin+細(xì)胞核比例和BrdU+α-actinin+單核心肌細(xì)胞比例。特別值得注意的是,50 ng/mL IL-6抑制EDS單核心肌細(xì)胞的增殖卻促進(jìn)LDS單核心肌細(xì)胞的增殖。單核二倍體心肌細(xì)胞被認(rèn)為是不同物種,或者是同一物種不同背景動物之間心肌細(xì)胞再生能力差異的關(guān)鍵細(xì)胞基礎(chǔ)[16-17]。這提示IL-6對單核心肌細(xì)胞增殖的作用是IL-6的重要生物學(xué)效應(yīng)之一,會在生理狀態(tài)和疾病發(fā)展過程中產(chǎn)生一定的積極作用。

上述IL-6作用的變化是因為IL-6對gp130蛋白介導(dǎo)的信號通路的影響不同,可能與JAK-STAT3通路有關(guān)。多項研究證實,心肌細(xì)胞增殖能力與下游ERK、Akt和STAT3的磷酸化水平有關(guān)[20-22]。我們發(fā)現(xiàn)10 ng/mL和50 ng/mL IL-6對EDS心肌細(xì)胞的ERK和STAT3磷酸化均無顯著影響,但顯著減少Akt的磷酸化水平。在LDS,10 ng/mL和50 ng/mL IL-6均抑制Akt的磷酸化,促進(jìn)STAT3的磷酸化水平。這說明這三個信號通路不同程度地介導(dǎo)了IL-6對胚胎心肌細(xì)胞增殖能力的調(diào)節(jié):在EDS,IL-6不能激活gp130蛋白介導(dǎo)的信號通路,所以未展現(xiàn)出促增殖作用,甚至出現(xiàn)抑制作用;在LDS,IL-6促進(jìn)STAT3的磷酸化,進(jìn)而促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖。這與已報道的IL-6上調(diào)STAT3磷酸化而促進(jìn)新生鼠心肌細(xì)胞的增殖能力一致[10]。然而我們的數(shù)據(jù)并不能很好地解釋IL-6對Akt磷酸化的抑制作用,以及這種抑制作用和IL-6對細(xì)胞增殖能力影響的相關(guān)性。

IL-6對EDS和LDS三個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響不同,特別是STAT3磷酸化程度的不同,可能與不同發(fā)育階段關(guān)鍵蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)狀態(tài)密切相關(guān)[19]:通過Western blot發(fā)現(xiàn)EDS、LDS、P7、P14和成年小鼠ERK、Akt、STAT3的總蛋白含量和磷酸化水平均隨發(fā)育逐漸成熟而下降。此外,EDS和LDS心肌細(xì)胞表面的IL-6受體表達(dá)量、gp130蛋白表達(dá)量以及其他gp130蛋白介導(dǎo)的信號通路如Hippo、Notch和mTOR等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)[14]差異也可能導(dǎo)致了IL-6對EDS和LDS心肌細(xì)胞增殖能力影響的差異性。這些因素可能是50 ng/mL IL-6抑制EDS單核心肌細(xì)胞增殖和(或)促進(jìn)LDS單核心肌細(xì)胞增殖的機制。

IL-6作為心臟細(xì)胞微環(huán)境中的一種重要細(xì)胞因子,已經(jīng)被證實在慢性心力衰竭和心肌梗死等心肌細(xì)胞損傷時分泌大量增加,有利于促進(jìn)心肌細(xì)胞的修復(fù)能力[23-25]。我們發(fā)現(xiàn)IL-6以發(fā)育依賴的方式影響心肌細(xì)胞增殖能力,這可能與IL-6在不同階段的不同靶向通路有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為心臟發(fā)育提供了新知識,也為細(xì)胞替代療法的研究提供了新線索。