小西葫蘆黃花葉病毒甜瓜分離物的基因組及其侵染性克隆

劉莉銘，彭 斌，康保珊，吳會(huì)杰，劉 茜，古勤生

（1.河南省果樹瓜類生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所 鄭州 450009；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院中原研究中心 河南新鄉(xiāng) 453500）

小西葫蘆黃花葉病毒（zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）屬于馬鈴薯Y 病毒屬（Potyvirus），通過蚜蟲、機(jī)械接觸和種子進(jìn)行傳播，主要侵染甜瓜、黃瓜、西瓜、西葫蘆等瓜類作物，引起植株生長(zhǎng)緩慢、矮化、花葉、蕨葉、新葉變小、果實(shí)畸形等，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約瓜果產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。該病毒于1981 年在意大利首次發(fā)現(xiàn)[1]，1991 年在我國(guó)新疆首次報(bào)道[2]，目前在世界范圍內(nèi)廣泛分布[3-4]。

獲得ZYMV 不同分離物的序列信息，分析其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，可以了解它們的發(fā)生、起源及變異規(guī)律，為防控病害發(fā)生提供重要理論依據(jù)[5-15]。病毒侵染性克隆的獲得使RNA 病毒能夠在DNA 水平上應(yīng)用基因工程手段研究病毒各基因功能及致病機(jī)制。前期筆者團(tuán)隊(duì)（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所西瓜甜瓜病蟲害防控課題組）從河南臨穎的甜瓜發(fā)病植株中分離獲得ZYMV 分離物CH99/87（CH-87），并對(duì)其外殼蛋白基因進(jìn)行了克隆和序列分析[16]。筆者在此基礎(chǔ)上擬通過擴(kuò)增獲得該分離物的全基因組序列，以分析與其他ZYMV 分離物之間的序列一致性和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，為深入開展該病毒的遺傳多樣性分析和進(jìn)化機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。同時(shí)通過構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA 克隆，分析該克隆在不同瓜類作物上的侵染性，為在瓜類作物上開展該病毒的分子致病性和寄主抗病性等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2021 年4—9 月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所進(jìn)行，ZYMV 分離物CH-87 分離自甜瓜發(fā)病植株，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所西瓜甜瓜病蟲害防控課題組鑒定和保存。

1.2 載體構(gòu)建

取約0.1 g 甜瓜發(fā)病葉片，提取葉片總RNA并合成cDNA，具體操作參照RNAsimple 總RNA 提取試劑盒和PrimeScript ?RT reagent Kit with gDNA Eraser 說明書。根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中已知ZYMV 分離物的全基因組序列信息，設(shè)計(jì)4 對(duì)引物HF-Z-1F/Z-1R、Z-2F/Z-2R、Z-3F/Z-3R、Z-4F/HF-Z-4R（表1），以cDNA 為模板，對(duì)分離物CH99/87 的全基因組進(jìn)行分段擴(kuò)增。利用NEBuilder 高保真DNA 組裝預(yù)混液將獲得的4 個(gè)PCR 產(chǎn)物與經(jīng)StuI 和SmaI 雙酶切處理的植物表達(dá)載體pXT1（由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)陶小榮教授饋贈(zèng)）進(jìn)行同源重組、轉(zhuǎn)化、菌液PCR 篩選、測(cè)序驗(yàn)證，最終獲得含有 CH- 87 全基因組的 cDNA 克隆pXT1-ZYMV。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the study

1.3 序列分析

對(duì)pXT1-ZYMV 進(jìn)行測(cè)序、拼接，獲得CH-87分離物的全基因組序列。利用Mega X 中的Clustal W 對(duì)CH-87 分離物與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中已知ZYMV 分離物的序列進(jìn)行比對(duì)，再用BioEdit軟件進(jìn)行序列一致性分析[17]。以西瓜花葉病毒（watermelon mosaic virus，WMV，AY437609）為外組，分別基于CP 蛋白和多聚蛋白的氨基酸序列，利用Mega X 軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）對(duì)ZYMV 分離物進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析[18]。

1.4 侵染性分析

試驗(yàn)于2021 年6—8 月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所西瓜甜瓜病蟲害防控課題組溫室進(jìn)行。其中，甜瓜品種為白玫，由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心提供；黃瓜品種為津研4 號(hào)，種子購(gòu)自天津科潤(rùn)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司；西瓜品種為鄭抗2 號(hào)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所提供；西葫蘆品種為歐諾，種子購(gòu)自太谷區(qū)雨潤(rùn)谷禾種業(yè)有限公司。當(dāng)以上瓜類作物植株培養(yǎng)至子葉完全展開時(shí)用于試驗(yàn)。將pXT1-ZYMV 利用液氮凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101 菌株中，利用菌液PCR 篩選獲得陽(yáng)性克隆，隨后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和接種檢測(cè)，并將發(fā)病葉片進(jìn)一步進(jìn)行摩擦接種分析，每次接種甜瓜、黃瓜、西瓜、西葫蘆各8 株，3 次重復(fù)，以接種誘導(dǎo)緩沖液的植株為對(duì)照，具體農(nóng)桿菌培養(yǎng)、誘導(dǎo)和接種方法參照劉莉銘等[19]。待接種28 d 后，利用引物Z-8284F/Z-T7-9337R 對(duì)發(fā)病葉片進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，分析pXT1-ZYMV 在不同瓜類作物中的侵染性，以Z-8927F/Z-T7-9337R 為引物，對(duì)CH-87 分離物基因組的8927～9337 nt 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄獲得地高辛標(biāo)記的RNA 探針，利用dot blot方法進(jìn)一步檢測(cè)植株葉片中ZYMV 的侵染情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZYMV分離物CH-87的基因組

CH-87 基因組全長(zhǎng)為9592 nt，它的5’UTR 和3’UTR 分別對(duì)應(yīng)基因組的1～138 nt 和9382～9592 nt，全基因組編碼1 個(gè)由3080 個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白（139～9381nt，9243nt），經(jīng)蛋白酶切割，形成10個(gè)成熟的蛋 白 質(zhì)，包 括P1（139～1068 nt，930 nt，310 aa）、HC-Pro（1069～2436 nt，1368 nt，456 aa）、P3（2437～3474 nt，1038 nt，346 aa）、6K1（3475～3630 nt，156 nt，52 aa）、CI（3631～5532 nt，1902nt，634 aa）、6K2（5533～5691 nt，159 nt，53 aa）、NIa-VPg（5692～6261 nt，570 nt，190 aa）、NIa-Pro（6262～6990 nt，729 nt，243 aa）、NIb（6991～8541 nt，1551 nt，517 aa）和CP（8542～9378 nt，837 nt，279 aa），P3 編碼區(qū)內(nèi)部通過+2 移碼產(chǎn)生PIPO（2889～3122 nt，234 nt）。其具體基因組結(jié)構(gòu)如圖1 所示，GenBank 登錄號(hào)為MN296124。

圖1 ZYMV 分離物CH-87 的基因組結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic representation of ZYMV isolate CH-87 genome organization

2.2 分離物CH-87序列分析

序列一致性分析表明，分離物CH-87 與其他分離物的全基因組核苷酸序列一致性平均值為91.42%，與美國(guó)BL-67 分離物一致性最高，為97.60%，與韓國(guó)分離物KR-PE 和KR-PS 一致性次之，與澳大利亞分離物Gld-1 和Knx-22 一致性最低（表2）。分離物CH-87 與其他分離物的多聚蛋白氨基酸序列一致性平均值為96.45%，與美國(guó)BL-67分離物一致性最高，為99.30%，與韓國(guó)分離物BR1一致性次之，與新加坡分離物Singapore 一致性最低（表2）。

表2 ZYMV 分離物CH-87 與其他分離物全基因組核苷酸和氨基酸的序列一致性Table 2 The identity of nucleotide sequences and amino acid sequences of complete genome between ZYMV isolate CH-87 and other isolates

基于ZYMV CP 蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，供試45 個(gè)ZYMV 分離物可以分為A、B 兩組，A 組由來自17 個(gè)國(guó)家的40 個(gè)分離物組成，B 組由來自新加坡和澳大利亞的西瓜和西葫蘆分離物組成（圖2）。其中，A 組進(jìn)一步聚類為5個(gè)亞組I～V。亞組I由來自斯洛伐克、印度、捷克、西班牙、埃及、阿根廷、伊朗、土耳其、伊拉克、以色列、澳大利亞和中國(guó)臺(tái)灣的西葫蘆、大豆、西印度黃瓜、筍瓜、南瓜、黃瓜和甜瓜分離物組成，亞組Ⅱ由來自澳大利亞和日本的西瓜、黃瓜、西葫蘆、帽兒瓜分離物組成，亞組Ⅲ由來自意大利、澳大利亞和特立尼達(dá)和多巴哥的西葫蘆、甜瓜和南瓜分離物組成，亞組Ⅳ由來自土耳其、韓國(guó)和中國(guó)的西葫蘆和南瓜分離物組成，亞組V由來自韓國(guó)、中國(guó)和美國(guó)的甜瓜、南瓜、絲瓜和芝麻分離物組成。而筆者獲得的CH-87 分離物與美國(guó)南瓜分離物（BL-67）親緣關(guān)系最近，與中國(guó)絲瓜分離物（CN∶Lc∶17）、芝麻分離物（zz）和韓國(guó)的3 個(gè)南瓜分離物（BR1、KR-PE、KR-PS）親緣關(guān)系次之，它們均聚于亞組V中（圖2）。

圖2 基于CP 蛋白氨基酸序列的ZYMV 分離物系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of ZYMV isolates based on the amino acid sequences of CP

基于ZYMV 多聚蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，供試ZYMV 分離物也可以分為2 組（圖3），與圖2 系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果相比，兩者的B 組分離物成員一致，A 組亞組成員組成中有所差異，其中，CH-87 分離物與美國(guó)南瓜分離物（BL-67）親緣關(guān)系最近，與中國(guó)絲瓜分離物（CN∶Lc∶17）親緣關(guān)系次之，而與中國(guó)芝麻分離物（zz）和韓國(guó)的3 個(gè)南瓜分離物親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)。

圖3 基于多聚蛋白氨基酸序列的ZYMV 分離物系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of ZYMV isolates based on the amino acid sequences of ployprotein

2.3 分離物CH-87全長(zhǎng)cDNA克隆的侵染性

將CH-87 的全長(zhǎng)cDNA 克隆pXT1-ZYMV 經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法接種甜瓜、黃瓜、西瓜和西葫蘆植株。接種后1 周左右，甜瓜接種植株開始產(chǎn)生花葉癥狀，接種后2 周左右，甜瓜花葉明顯，黃瓜、西瓜和西葫蘆接種植株開始產(chǎn)生癥狀（圖4-A）。隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，甜瓜、西瓜和西葫蘆接種植株發(fā)病逐漸嚴(yán)重，植株矮化明顯，葉片花葉嚴(yán)重、畸形、葉緣呈鋸齒狀（圖4-B）。利用一步RT-PCR 方法對(duì)發(fā)病植株中ZYMV 的侵染情況進(jìn)行檢測(cè)，并經(jīng)dot blot 進(jìn)一步分析，確認(rèn)發(fā)病植株均被ZYMV 所侵染（圖4-C～D）。將甜瓜發(fā)病葉片通過摩擦接種方式進(jìn)一步接種甜瓜和西瓜植株，在接種后1～2 周，所有接種植株也均可發(fā)病，經(jīng)PCR 分析進(jìn)一步證實(shí)了ZYMV 的侵染。以上結(jié)果說明分離物CH-87 的侵染性克隆構(gòu)建成功，該克隆在4 種供試瓜類作物上均可系統(tǒng)侵染，并產(chǎn)生典型的花葉癥狀。

3 討論與結(jié)論

筆者基于CP 蛋白和多聚蛋白的氨基酸序列對(duì)ZYMV 進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)亞洲的日本、新加坡、韓國(guó)、以色列、伊朗、印度、中國(guó)、伊拉克、土耳其分離物分散分布于A 組中的3 個(gè)或4 個(gè)亞組和B 組中，歐洲的斯洛伐克、捷克、西班牙、意大利分離物分布于A 組中的2 個(gè)亞組中，而來自不同國(guó)家和地區(qū)的多個(gè)寄主分離物則分散分布于A 組各亞組或B 組中，即各組是有多個(gè)來自不同寄主的分離物組成，而并非由單個(gè)寄主分離物組成，說明ZYMV 在進(jìn)化上與地域差異和寄主范圍不相關(guān)，與付晶晶等[11]報(bào)道一致。另外，通過對(duì)比本研究的兩組系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)CH-87 分離物與zz、KR-PA、KR-PS、KR-PE 等這些分離物的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近有所差異。已有研究者發(fā)現(xiàn)，基于單一區(qū)域序列的分析難以準(zhǔn)確反映馬鈴薯Y 病毒屬成員的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系[13，20-21]，筆者在本研究中進(jìn)一步證實(shí)了基于單一區(qū)域序列進(jìn)行進(jìn)化分析的局限性。

針對(duì)ZYMV 序列進(jìn)行的多項(xiàng)研究表明，不同分離物之間存在不同程度的序列差異，其中尤以P1 保守性最差[12-13，22]。ZYMV 侵染性克隆的獲得使人們可以開展該病毒分子致病性相關(guān)工作，以揭示不同分離物之間的序列差異在病毒致病性中所起的作用及對(duì)寄主范圍的影響。目前已有ZYMV 侵染性克隆成功構(gòu)建的報(bào)道[23-25]，筆者在本研究中針對(duì)甜瓜分離物CH-87 進(jìn)行了侵染性克隆的構(gòu)建，并通過接種試驗(yàn)證實(shí)了該克隆在4 種瓜類作物上的適用性。另外，在此侵染性克隆的基礎(chǔ)上，筆者已成功表達(dá)了eGFP 報(bào)告基因[19]。筆者的試驗(yàn)對(duì)該分離物的基因組信息的詳細(xì)描述和系統(tǒng)分析為更好地將該分離物的侵染性克隆和eGFP 重組克隆應(yīng)用于瓜類作物相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)。