滋陰補(bǔ)脾方對(duì)人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤的抑制作用機(jī)制研究

武如通 楊思華 史清華 張 蕓 黎智燊 鄭周杭

(1 廣東省第二中醫(yī)院腫瘤科,廣州,510095; 2 廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣州,510006)

結(jié)腸癌是常見的國(guó)內(nèi)外惡性腫瘤,全球范圍內(nèi)其發(fā)病率占惡性腫瘤第3位,且臨床調(diào)查顯示其在我國(guó)發(fā)病率不斷上升,嚴(yán)重影響人們生命質(zhì)量[1-2]。目前,關(guān)于結(jié)直腸癌治療多以手術(shù)治療為主,但尤其癥狀較為隱匿,大部分患者確診時(shí)已屬晚期,錯(cuò)失最佳根治時(shí)機(jī),導(dǎo)致治療及預(yù)后不佳[3]。以化療為主的綜合治療成為結(jié)腸癌主要手段,雖可延長(zhǎng)患者生存時(shí)間,但其不良反應(yīng)明顯,且化療會(huì)導(dǎo)致患者免疫功能下降[4-5]。因此,尋找有效的治療結(jié)腸癌方法具有重要意義。隨著中醫(yī)藥深入研究,在惡性腫瘤治療方面的良好療效,且可減輕因化療引起的免疫功能下降和不良反應(yīng)[6]。本研究探討滋陰補(bǔ)脾方對(duì)人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤抑制作用及其機(jī)制,為治療結(jié)腸癌提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與細(xì)胞 4周齡BALB/c雌性裸鼠20只,體質(zhì)量(18±2)g,飼養(yǎng)環(huán)境清潔,自由進(jìn)食進(jìn)水,室溫(25±2)℃,由中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,許可證號(hào):SCHK(新)2010-0005;經(jīng)廣東省第二中醫(yī)院藥理實(shí)驗(yàn)中心批準(zhǔn)(倫理審批號(hào):048583)。細(xì)胞:人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院,貨號(hào):AW-CCH107)。

1.1.2 藥物 氟尿嘧啶(海南桌泰制藥有限公司,批號(hào):21071);滋陰補(bǔ)脾方:太子參20 g、黃芪15 g、山藥15 g、茯苓10 g、白花蛇舌草20 g,選取DHJ-D1型煎藥機(jī)煎藥30 min后取汁。

1.1.3 試劑與儀器 BCA試劑盒(上海柏絲特生物科技有限公司,貨號(hào):23227),CD113抗體、CD116抗體、P53抗體(Abcam公司,英國(guó),貨號(hào):ab17、ab19、ab26)。光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS公司,日本,型號(hào):Olympus BX50),微量高速離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司,型號(hào):TG16-W),水平式電泳儀(北京東方儀器廠,型號(hào):GDS7600),電子天平(Satorius公司,日本,型號(hào):BS210S)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備與分組 1)模型制備:分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌胰酶消化,制備細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度至5×107/mL,將0.2 mL細(xì)胞懸液接種于雌性裸鼠背部皮下。接種后的裸鼠自由飲水和進(jìn)食飼養(yǎng),記錄裸鼠背部移植瘤的生長(zhǎng)情況。2)分組:選取接種結(jié)腸癌細(xì)胞株成瘤細(xì)胞在12 d左右且移植瘤平均直徑為5 mm左右的荷瘤裸鼠20只,按照隨機(jī)數(shù)字表法分隨機(jī)為對(duì)照組、化療藥物組、中成藥組和聯(lián)合用藥組,每組5只。

1.2.2 給藥方法 對(duì)照組每只裸鼠上午及下午分別注射等量生理鹽水,連續(xù)應(yīng)用4 d,至第14天處死動(dòng)物;化療藥物組每只裸鼠上午腹腔注射氟尿嘧啶10 mg/只,下午注射生理鹽水,1次/d,連續(xù)應(yīng)用4 d,至第14天處死動(dòng)物;中成藥組每只裸鼠上午腹腔注射生理鹽水,下午灌胃煮好的中藥湯劑10 mL/只(給藥相當(dāng)于臨床用藥30倍,2.5 g/L劑量給藥),1次/d,連續(xù)應(yīng)用4 d,至第14天處死動(dòng)物;聯(lián)合用藥組:每只裸鼠腹腔注射氟尿嘧啶10 mg/只,下午灌食煎煮好的中藥10 mL/只,1次/d,連續(xù)應(yīng)用4 d,至第14天處死動(dòng)物收集標(biāo)本。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1)腫瘤重量和腫瘤體積測(cè)定:給藥期間動(dòng)態(tài)觀察裸鼠背部腫瘤生長(zhǎng)情況,隔日用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤最大徑(a)及最小徑(b),實(shí)驗(yàn)第14天頸椎脫位處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,解剖出裸鼠移植瘤,電子天平沉重,測(cè)量腫瘤重量和腫瘤體積,腫瘤體積=ab2/2,抑瘤率=對(duì)照組平均體積-處理組平均體積/對(duì)照組平均體積×100%。2)蛋白印跡法測(cè)定CD113、CD116和P53蛋白表達(dá):取瘤體組織,加入蛋白裂解液充分裂解,提取總蛋白,蛋白總量采用BCA法測(cè)定。取蛋白80 μg加入上樣緩沖液,煮沸變性5 min,將其迅速低溫冷卻后加樣,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。切取含目的蛋白條帶的膠塊轉(zhuǎn)膜處理及采用含0.5%(v/v)吐溫20的Tris緩沖液(Tris Buffered Saline Containing 0.5%(v/v) Tween 20,TBST沖洗后,加入封閉液,放置于4 ℃孵育過夜;采用TBST沖洗,加入二抗,放置于室溫條件下孵育1 h;再采用TBST沖洗,凝膠成像儀曝光并顯色,測(cè)定條帶光密度值。

2 結(jié)果

2.1 各組腫瘤重量比較 與對(duì)照組比較,化療藥物組、中成藥組和聯(lián)合用藥組腫瘤重量明顯降低(P<0.05);化療藥物組和聯(lián)合用藥組腫瘤重量低于中成藥組(P<0.05);聯(lián)合用藥組腫瘤重量低于化療藥物組(P<0.05)。見表1。

表1 各組腫瘤重量比較

2.2 各組腫瘤體積比較 與對(duì)照組比較,化療藥物組、中成藥組和聯(lián)合用藥組腫瘤體積明顯降低(P<0.05);化療藥物組和聯(lián)合用藥組腫瘤體積低于中成藥組(P<0.05);聯(lián)合用藥組腫瘤體積低于化療藥物組(P<0.05)。見表2和圖1。

圖1 各組腫瘤大小比較

表2 各組腫瘤體積比較

2.3 各組腫瘤體積抑瘤率比較 與對(duì)照組比較,化療藥物組、中成藥組和聯(lián)合用藥組腫瘤體積抑瘤率明顯升高(P<0.05);化療藥物組和聯(lián)合用藥組腫瘤體積抑瘤率高于中成藥組(P<0.05);聯(lián)合用藥組腫瘤體積抑瘤率高于化療藥物組(P<0.05)。見表3。

表3 各組腫瘤體積抑瘤率比較

2.4 各組CD113、CD116和P53表達(dá)比較 與對(duì)照組比較,化療藥物組、中成藥組和聯(lián)合藥物組CD113和CD116表達(dá)與前面不同下降,而P53表達(dá)升高(P<0.05);化療藥物組和聯(lián)合用藥組CD113和CD116表達(dá)低于中成藥組,而P53表達(dá)高于中成藥組(P<0.05);聯(lián)合用藥組CD113和CD116表達(dá)低于化療藥物組,而P53表達(dá)高于化療藥物組(P<0.05)。見表4和圖2。

圖2 各組CD113、CD116和P53表達(dá)

表4 各組CD113、CD116和P53表達(dá)比較

3 討論

目前,結(jié)腸癌仍以手術(shù)為主要治療方法,但其術(shù)后轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率均較高,尤其是針對(duì)中晚期結(jié)腸癌患者,采用手術(shù)治療效果不理想,故而多依賴于化學(xué)治療[7-9]。但化學(xué)治療雖可延長(zhǎng)結(jié)腸癌患者生存時(shí)間,但其不良反應(yīng)明顯[10-13]。

中醫(yī)認(rèn)為結(jié)腸癌屬“腸覃”“腸風(fēng)”“腸毒”“滯下”“積聚”等范疇,隋·巢元方《諸病源候論》提出積聚病機(jī)在于“陰陽不和,臟腑虛弱,受于風(fēng)邪,搏于臟腑之氣所為也”。巢元方更詳細(xì)描述:“癥者,由寒溫失節(jié),致臟腑之氣虛弱,而食飲不消,聚結(jié)在內(nèi),染漸生長(zhǎng),塊段盤牢而不移動(dòng)者,是癥也,言其形狀,可征驗(yàn)也?！薄夺t(yī)宗金鑒》亦對(duì)其病因相關(guān)論述“積聚、癥瘕、腸覃之疾,皆得之于喜怒不節(jié)而傷臟,飲食過飽而傷腑,腸胃填滿,汁液外溢,為外寒所襲,與內(nèi)氣血食物凝結(jié)相成也”。中醫(yī)認(rèn)為結(jié)腸癌發(fā)病多因先天不足、外邪侵襲、情志內(nèi)傷、飲食不節(jié)、正氣虛弱等因素,正氣虧虛,脾胃運(yùn)化失司,濕毒內(nèi)生,氣化無力,郁久化熱,腸腑不同,濕熱毒邪蘊(yùn)結(jié)腸腑[14-16];或因恣食生冷,寒濕滯腸,均可導(dǎo)致濕熱蘊(yùn)毒、脾失健運(yùn)下迫結(jié)腸,毒聚成癰,腑氣不通而致結(jié)腸癌[17-18]。滋陰健脾方中,太子參具有益氣生津、健脾養(yǎng)胃、氣陰雙補(bǔ)功效;黃芪具有健脾益氣固表功效;山藥具有益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)脾肺腎功效;茯苓具有利水消腫、滲濕健脾功效;白花蛇舌草具有清熱解毒、利濕通淋功效?？v觀全方可奏滋陰健脾功效?，F(xiàn)代藥理研究表明,滋陰補(bǔ)脾法可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能,改善物質(zhì)代謝,增強(qiáng)造血功能,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞增殖,具有明顯抗腫瘤作用。本研究表明,與對(duì)照組比較,化療藥物組、中成藥組和聯(lián)合用藥組腫瘤重量和腫瘤體積明顯降低、腫瘤體積抑瘤率明顯升高,且聯(lián)合用藥組腫瘤重量和腫瘤體積低于化療藥物組和中成藥組而腫瘤體積抑瘤率高于化療藥物組和中成藥組,由此可見滋陰補(bǔ)脾法可明顯降低腫瘤重量和腫瘤體積,提高抑瘤率。

P53是一種腫瘤抑制蛋白,可通過介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)將應(yīng)激信號(hào)傳入細(xì)胞,同時(shí)還可作為轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)下游目的基因的轉(zhuǎn)錄,實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期或短暫阻滯細(xì)胞周期分化、DNA復(fù)制與修復(fù),從而達(dá)到阻止癌細(xì)胞早期增殖的目的,發(fā)揮促細(xì)胞凋亡作用[19-21]。腫瘤主要是由異質(zhì)性細(xì)胞構(gòu)成,而其中腫瘤細(xì)胞克隆分化與干細(xì)胞尤為相似。研究報(bào)道顯示,由于腫瘤干細(xì)胞為腫瘤起始細(xì)胞,可維持腫瘤的分化,具有異質(zhì)、增殖及浸潤(rùn)特性。故腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及發(fā)生發(fā)展的根源,對(duì)其高度表達(dá)的標(biāo)志物研究尤為重要。而CD類因子作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物,評(píng)價(jià)CD類因子表達(dá)與惡性腫瘤相關(guān)性具有重要意義。而目前,尚無有關(guān)CD113和CD116與腫瘤方面報(bào)道,缺乏可靠參考依據(jù)。本研究表明,與對(duì)照組比較,化療藥物組、中成藥組和聯(lián)合藥物組CD113和CD116表達(dá)下降而P53表達(dá)升高,且聯(lián)合用藥組CD113和CD116表達(dá)低于化療藥物組和中成藥組,而P53表達(dá)高于化療藥物組和中成藥組,由此可見滋陰補(bǔ)脾法可通過下調(diào)CD113和CD116表達(dá)及上調(diào)P53表達(dá),抑制腫瘤生長(zhǎng),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

綜上所述,滋陰補(bǔ)脾法可抑制人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng),認(rèn)為其作用機(jī)制可能與下調(diào)CD113和CD116表達(dá)及上調(diào)P53表達(dá)有關(guān)。

利益沖突聲明:無。