Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化蛞貝平喘膠囊提取工藝的研究*

沈 安葉晶晶金 湛程 斌

1 浙江省寧波市中醫(yī)院 浙江 寧波 315010

2 臺(tái)州恩澤醫(yī)療中心（集團(tuán)）路橋醫(yī)院 浙江 臺(tái)州 318050

3 衢州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 浙江 衢州 324000

4 浙江醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校 浙江 寧波 315100

“蛞貝平喘膠囊”是根據(jù)《黎陽(yáng)王氏秘方》中所載“玉涎丹”開(kāi)發(fā)的制劑，由蛞蝓、浙貝母、蛤蚧、黨參等組成，具有補(bǔ)肺益腎、清熱化痰、降氣平喘之功效，可用于治療支氣管性氣喘。其有效成分為貝母素甲、貝母素乙等多種異甾體類(lèi)生物堿，以及多糖類(lèi)化合物，為了保證該制劑中有效成分的提取率，筆者采用響應(yīng)面分析-綜合評(píng)分法優(yōu)化其提取工藝，為該制劑的深入研究開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器:Agilent1260型高效液相色譜儀（配蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司）；UV1902型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海奧析科學(xué)儀器有限公司）；AL204型電子天平（梅特勒-托利多儀器公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海恒一科技有限公司）；ZN-100型高速中藥粉碎機(jī)（杭州旭眾機(jī)械設(shè)備有限公司）。

1.2 材料:貝母素甲對(duì)照品（HPLC≥98%，批號(hào):110750-201110），貝母素乙對(duì)照品（HPLC≥98%，批號(hào):110751-201111)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；D-無(wú)水葡萄糖（批號(hào):20130910），購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；水為雙蒸水，乙腈、甲醇均為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品中貝母甲素、貝母乙素的含量測(cè)定：分述如下。

2.1.1 色譜條件:KromasilC18色譜柱（250.0mm×4.6mm，5μm）；柱溫:30℃；流動(dòng)相:乙腈-水-二乙胺（70∶30∶0.03）；檢測(cè)波長(zhǎng):270nm；流速:1.0ml/min；進(jìn)流速:2.0L/min[1]。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備:取貝母素甲和貝母素乙的對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1ml含貝母素甲1.820mg、貝母素乙1.850mg的混合溶液，搖勻，作為混合對(duì)照品母液。精密吸取該母液5ml，用甲醇稀釋至50ml，得每1ml含貝母素甲0.182mg、貝母素乙0.185mg的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.1.3 供試品溶液制備:取浸膏0.2g，精密稱(chēng)定，置具塞刻度試管中，精密加入10ml乙醚和0.2ml濃氨試液，密塞，稱(chēng)定重量，超聲5min，冷浸24h，加上述混合溶液補(bǔ)足減失的重量。精密量取樣品上清液1ml，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⑥D(zhuǎn)移至2ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過(guò)膜，即得[2]。

2.1.4 陰性供試品溶液制備:除浙貝母外，分別按處方稱(chēng)取其余藥味，提取制成浸膏，余同“2.1.3”項(xiàng)。

2.1.5 空白實(shí)驗(yàn):分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液10μl，進(jìn)樣測(cè)定。在確定的色譜條件下，貝母素甲和貝母素乙色譜峰的分離情況較好，其余成分未對(duì)測(cè)定產(chǎn)生干擾。

2.1.6 線性關(guān)系考察:分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液1.0ml、3.0ml、5.0ml、7.0ml、9.0ml、10.0ml至10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得6個(gè)系列濃度的混合對(duì)照品溶液。精密吸取上述混合對(duì)照品溶液各10μl，進(jìn)樣測(cè)定。以濃度C（mg/ml）的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以貝母素甲、貝母素乙的平均峰面積的對(duì)數(shù)值A(chǔ)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為，lgA甲=1.1601gm甲+2.0079（r=0.9998），lgA乙=1.1467lgm乙+2.0275（r=0.9997），貝母素甲、貝母素乙分別在0.0182mg/ml～0.182mg/ml、0.0185mg/ml～0.185mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.7 精密度實(shí)驗(yàn):精密吸取混合對(duì)照品溶液10μl，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果顯示，貝母素甲和貝母素乙峰面積的RSD分別為0.69%、0.54%，表明儀器精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):精密吸取供試液10μl，于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h內(nèi)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示貝母素甲、貝母素乙峰面積的RSD分別為0.76%、0.25%，表明供試品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn):取同一批樣品浸膏6份，每份0.2g，精密稱(chēng)定，按“2.1.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示樣品中貝母素甲、貝母素乙含量的RSD分別為1.0%、0.94%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.1.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn):取已知含量的樣品浸膏9份，每份0.2g，精密加入濃度為0.367mg/ml的混合對(duì)照液5.4ml、3.6ml、1.8ml各3份，按“2.1.3”項(xiàng)下制備方法，在“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算樣品中指標(biāo)成分貝母素甲和貝母素乙的總含量，測(cè)得平均加樣回收率為94.66%，RSD為3.09%。

2.2 樣品中多糖含量測(cè)定:分述如下。

2.2.1 對(duì)照品溶液制備:取干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置于50ml量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得每1ml含葡萄糖0.1025mg的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備:精密吸取乙醇提取液2.0ml，置于10ml干燥試管中，再加入5%苯酚水溶液1.0ml，混均，快速加入硫酸6.0ml，混均，冷卻后，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收度[3]。

2.2.3 線性關(guān)系考察:精密吸取對(duì)照品溶液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml，并以第1份為空白對(duì)照，以無(wú)水葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，以吸收度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得方程為A=0.7630m+0.1586(r=0.9943），在0.0205～0.1230mg范圍內(nèi)線性良好（r=0.9981）。

2.2.4 精密度實(shí)驗(yàn):取同一對(duì)照品溶液，連續(xù)測(cè)定吸光度6次，RSD為0.98%，表明儀器的精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):取同一供試品溶液，按照上述方法測(cè)定0、1、2、3、4、5h內(nèi)的吸光度，RSD為1.1%，表明供試品溶液在5h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn):取同一批次樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述方法分別測(cè)定其吸光度，RSD為2.56%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn):取含有量已知的供試品溶液6份，精密加入同一濃度的對(duì)照品溶液，按上述方法測(cè)定吸光度，測(cè)得平均加樣回收率為98.0%，RSD為2.03%。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn):分述如下。

2.3.1 乙醇濃度:精密稱(chēng)取處方藥材6份，加10倍量30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇，80℃條件下，提取2次，每次2h，計(jì)算出膏率，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定貝母素甲、貝母素乙的含量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定總多糖含量，因方中蛞蝓未收入藥典，浙貝母除了藥典規(guī)定的甾體類(lèi)生物堿貝母甲素和貝母乙素含量，其有效成分之一多糖也具有獨(dú)特和顯著的藥理作用。此外，黨參中含有含量豐富的多糖，蛤蚧主要以醇浸出物測(cè)定為主。故本實(shí)驗(yàn)設(shè)定貝母素甲和貝母素乙總量的權(quán)重為50%，總多糖權(quán)重為30%，出膏率權(quán)重為20%。結(jié)果表明，各乙醇濃度條件下的綜合評(píng)分分別為81.27%、83.55%、90.53%、91.37%、94.78%、93.20%，即70%乙醇時(shí)最高。因此，選擇60%、70%、80%作為乙醇濃度的3個(gè)水平。

2.3.2 提取溫度:稱(chēng)取處方藥材4份，加10倍量70%乙醇，于50℃、60℃、70℃、80℃提取2次，每次2h，計(jì)算出膏率，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定貝母素甲、貝母素乙的含量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定總多糖含量。結(jié)果表明不同溫度條件下的綜合評(píng)分分別為90.48%、91.43%、92.35%、92.78%，以80℃條件下評(píng)分最高。但是綜合評(píng)分并沒(méi)有顯著提高，考慮到溫度是影響有效成分溶出的重要因素，因此，選擇60℃、70℃、80℃作為提取溫度的3個(gè)水平。

2.3.3 料液比:稱(chēng)取處方藥材4份，分別加入6、8、10、12倍量70%乙醇，于80℃提取2次，每次2h，計(jì)算出膏率，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定貝母素甲、貝母素乙的含量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定總多糖含量。結(jié)果表明，不同料液比條件下的綜合評(píng)分分別為89.48%、91.33%、94.56%、93.77%，即10倍量乙醇條件下最高。因此，選擇8、10、12倍量70%乙醇作為料液比的3個(gè)水平。

2.3.4 提取時(shí)間:稱(chēng)取處方藥材4份，分別加入10倍量70%乙醇，于80℃提取2次，每次1、2、3、4h，計(jì)算出膏率，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定貝母素甲、貝母素乙的含量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定總多糖含量。結(jié)果表明不同提取時(shí)間條件下的綜合評(píng)分分別為88.72%、92.63%、92.88%、93.12%，即在4h條件下評(píng)分最高。從生產(chǎn)角度出發(fā)，為了節(jié)省時(shí)間與原來(lái)，選取提取2h為最佳提取時(shí)間。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化:根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別提取1、2、3、4次，提取2次時(shí)，綜合評(píng)分有著顯著的提升，之后，逐漸趨于平緩，從實(shí)際生產(chǎn)角度考慮，故我們選擇提取次數(shù)為2次。單因素實(shí)驗(yàn)表明，提取時(shí)間越長(zhǎng)綜合評(píng)分愈高，但提取時(shí)間2h后評(píng)分變化幅度不大，從實(shí)際生產(chǎn)角度考慮，故我們選擇提取時(shí)間為2h。其余選擇影響相對(duì)較大的3個(gè)因素，即乙醇濃度(X1)、提取溫度(X2)和料液比(X3)，以綜合評(píng)分Y［含出膏率（Y1、%）、貝母甲素和乙素總量（Y2、%）、總多糖提取率（Y3、%）］為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)定出膏率權(quán)重為20%，貝母素甲和貝母素乙總量為50%，總多糖為30%，計(jì)算公式為:綜合評(píng)分Y=（Y1/Y1-max）×Y1權(quán)重+（Y2/Y2-max）×Y2權(quán)重+（Y3/Y3-max）×Y3權(quán)重。分述如下。

2.4.1 模型擬合與方差分析:運(yùn)用Desing-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面分析，對(duì)表中數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及二次多項(xiàng)式回歸擬合，得方程為Y=93.626+7.80X1+5.13X2+6.16X3+5.69X1X2+0.68X1X3-0.31X2X3-8.77X12-8.17X22-8.55X32。對(duì)回歸方程進(jìn)行方法分析，結(jié)果見(jiàn)表1，由表可得各因素中對(duì)蛞貝平喘膠囊提取工藝的條件影響程度的大小依次為X1（乙醇濃度）＞X3（料液比）＞X2（提取溫度）。

表1 方差分析

圖1 提取溫度與乙醇濃度的交互作用

圖2 料液比與乙醇濃度的交互作用

圖3 料液比與提取溫度的交互作用

2.4.2 各因素之間的交互作用:運(yùn)用Desing-Expert 8.0.6軟件繪制響應(yīng)面圖以及等高線圖，見(jiàn)圖1～3。圖1顯示，當(dāng)提取溫度一定時(shí)，隨著乙醇濃度的增加，綜合評(píng)分逐漸上升后緩慢下降；當(dāng)乙醇濃度一定時(shí)，提取溫度在60～70℃，綜合評(píng)分呈上升趨勢(shì)，后逐漸下降。圖2顯示，當(dāng)料液比一定時(shí)，在一定范圍內(nèi)綜合評(píng)分隨著乙醇濃度的增加而上升，而后逐漸下降；當(dāng)乙醇濃度一定時(shí)，料液比在8～10g/ml時(shí)，綜合評(píng)分逐漸上升，而后趨于平緩。圖3顯示，當(dāng)料液比一定時(shí)，提取溫度在一定范圍內(nèi)有利于綜合評(píng)分的升高，但在75～80℃，綜合評(píng)分逐漸降低。當(dāng)提取溫度一定時(shí)，隨著料液比的增加，綜合評(píng)分逐漸上升而后緩慢下降。同時(shí)，圖1中乙醇濃度與提取溫度的交互作用最顯著（P＜0.05），響應(yīng)曲線坡度較陡，等高線呈橢圓形，而且比較密集。

2.4.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn):對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)等于0，解得X1=0.630，X2=0.527，X3=0.376，轉(zhuǎn)換后，得Z1=76.30，Z2=75.27，Z3=10.75，并根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行修正，得乙醇濃度為76%，提取溫度為75℃，料液比為10.8，綜合評(píng)分理論預(yù)測(cè)值為98.59%，實(shí)際測(cè)定與理論預(yù)測(cè)基本符合，說(shuō)明得到的二次回歸方程與實(shí)際操作擬合良好。

3 討論

蛞貝平喘膠囊方中蛞蝓祛風(fēng)定驚，清熱解毒；浙貝母清熱散結(jié)，化痰止咳；蛤蚧補(bǔ)肺益腎，納氣定喘；黨參補(bǔ)中益氣，和脾胃，除煩渴。蛞蝓含蛋白、多糖類(lèi)等多種成分，有抗腫瘤、平喘等作用。浙貝母主要成分是貝母甲素以及貝母已素，具有鎮(zhèn)咳、祛痰和松弛氣管平滑肌、抗炎和逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥等作用。蛤蚧中含有高量的鈣、鋅、膽固醇以及甘油酯，能夠解痙平喘、降低血糖、提高免疫力。黨參具有調(diào)節(jié)血糖、促進(jìn)造血機(jī)能、降壓、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)胃收縮及抗?jié)兊榷喾N作用。

蛞貝平喘膠囊在提取時(shí)，方中浙貝母和黨參粉粹，過(guò)5號(hào)篩，烘干，備用。蛤蚧除去鱗片及頭足，切成小塊，烘干，粉碎，過(guò)5號(hào)篩；蛞蝓冷阱溫度-85℃冷凍干燥，干燥后低溫粉碎，過(guò)5號(hào)篩；按照響應(yīng)面設(shè)計(jì)所優(yōu)化的工藝條件，以上四味藥材，用76%乙醇提取，每次用10.8倍量，提取溫度75℃，回流2次，每次2h，提取液濾過(guò)，濾液減壓濃縮至稠膏，按處方比例稱(chēng)量，用適量的95%乙醇潤(rùn)濕，過(guò)80目篩制粒，將制得的濕顆粒于40℃下減壓干燥，整粒，加5%滑石粉和0.3%硬脂酸鎂為潤(rùn)滑劑，混合均勻，填充，即可。