河車壯兒膏改善實(shí)驗(yàn)小鼠免疫功能的藥效學(xué)研究*

李正宇 喻雄華# 諶章和

1 湖北省仙桃市中醫(yī)醫(yī)院 湖北 仙桃 433000

2 湖北中醫(yī)藥大學(xué) 湖北 武漢 430065

氣陰兩虛體質(zhì)的小兒在日常診療中是比較常見(jiàn)的，小兒常因體虛或病后調(diào)養(yǎng)不當(dāng)而造成反復(fù)呼吸道感染，影響其健康成長(zhǎng)。河車壯兒膏是我院針對(duì)氣陰兩虛患兒進(jìn)行調(diào)養(yǎng)的驗(yàn)方，由紫河車、當(dāng)歸、黃芪等28味中藥組成。為弄清該藥的治病機(jī)理，實(shí)驗(yàn)小組針對(duì)氣陰兩虛小兒抵抗力差、易患呼吸道反復(fù)感染特點(diǎn)，進(jìn)行了以下河車壯兒膏的藥效學(xué)系列實(shí)驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物:河車壯兒膏，300ml/瓶，鄂藥制字Z20180598，仙桃市中醫(yī)醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，批號(hào):20180303；黃芪顆粒，8g/袋，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20153620，湖北諾得勝制藥有限公司，批號(hào):20180712。

1.2 試劑:環(huán)磷酰胺(CTX)200mg/支，江西九州制藥廠，批號(hào):2010102；肝素鈉1250萬(wàn)U/支，武漢生化制藥有限公司，批號(hào)20170309；0.9%NaCl，科倫藥業(yè)有限公司，批號(hào):20170102；姬姆薩染液，Sigma，自配；CRBC懸液，按文獻(xiàn)方法配制[1]；豚鼠血清，0.3克/支:中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)20171024；2，4-二硝基氯苯，Aldrich Chemical Co．Ltd；脫毛劑，廣東寶潔公司，失效期2019年4月；甲醇、丙醇均為分析純。

1.3 動(dòng)物:雄性小鼠（Balb/c），8周齡，共120只。由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào):SYXK（鄂）2014-0013，層流架內(nèi)飼養(yǎng)。

1.4 儀器設(shè)備:Olympus顯微鏡；臺(tái)式離心機(jī)，Tcl-16G；紫外分光光度計(jì) LNG721；37°恒溫箱 NAPCO5410；METTLER TOLEDO電子分析天平AL204型；Sartorius；打孔器，KW-trio97AO。

2 河車壯兒膏對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用

2.1 分組:雄性小鼠（Balb/c），8周齡，40只，隨機(jī)分為正常組、CTX組、黃芪顆粒組、河車壯兒膏組4組，每組10只。

2.2 給藥:小鼠給藥劑量以人與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之間藥物劑量公式換算其中D為藥物劑量，W為體重，K為常數(shù)。取人用量的20倍作為實(shí)驗(yàn)小鼠的用藥劑量。正常組和CTX組以純凈水灌胃，劑量0.5ml/次；黃芪顆粒組以黃芪顆粒水溶物灌胃，劑量20mg/g·d；河車壯兒膏以樣品灌胃，劑量0.32ml/g·d，每日2次，共14天。

2.3 制造模型:從第10天起，CTX組、黃芪顆粒組和河車壯兒膏組皮下注射CTX 40mg/kg·d，每日1次，共3天。

2.4 實(shí)驗(yàn)方法:給藥第14天后，分別按0.4ml/只劑量腹腔注射5%雞紅細(xì)胞懸液（CRBC）溶液，8h后處死小鼠，剪開(kāi)腹部，用0.9%生理鹽水沖洗后吸出，離心5min。將細(xì)胞懸液混勻后，將滴到玻片上，3min后以1∶1丙酮甲醇液固定5min，姬姆薩染液染色，晾干后置顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞，每片計(jì)200，計(jì)算吞噬指標(biāo)。

2.5 結(jié)果:河車壯兒膏組和黃芪顆粒組小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)CRBC的吞噬指標(biāo)均高于CTX組（P＜0.01），說(shuō)明實(shí)驗(yàn)樣品和對(duì)照品黃芪顆粒均有促進(jìn)CTX組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的效果；河車壯兒膏與黃芪顆粒比較未見(jiàn)顯著性差異（P＞0.05），結(jié)果見(jiàn)表1。巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1 壯兒膏對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（±s）

表1 壯兒膏對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（±s）

注:與CTX組比較，*P＜0.05 ，**P＜0.01。

0.199±0.039*0.136±0.045 0.226±0.066**0.220±0.080**37.4±5.93*25.2±11.85 46.3±7.65**43.4±16.92**CTX組黃芪顆粒組10 10

圖1 巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)

3 河車壯兒膏對(duì)2，4-二硝基氯苯（DNCB）引起的小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)的影響

3.1 方法:分組、給藥、制造模型同上。在首次給藥后第4天，各組小鼠用脫毛劑脫毛后，滴丙溶液致敏（5.0%，DNCB 20μl/只）。給藥第14天后，在小鼠左耳涂抹2.5%DNCB丙酮溶液，涂藥劑量為20μl/只，致小鼠遲發(fā)性過(guò)敏。24h后處死，用打孔器在左右對(duì)稱部位打出耳片，直徑約8mm，稱重，以左右耳片重量差表示過(guò)敏反應(yīng)的強(qiáng)度。

3.2 結(jié)果:河車壯兒膏組和黃芪顆粒組小鼠的取片重量與CTX組比較有顯著性差異（P＜0.01），提示河車壯兒膏和黃芪顆粒對(duì)CTX引起免疫功能降低小鼠對(duì)DNCB所致遲發(fā)性超敏反應(yīng)有增強(qiáng)作用；河車壯兒膏與黃芪顆粒比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 河車壯兒膏對(duì)DNCB丙酮溶液所致小鼠的遲發(fā)性超敏反應(yīng)的作用（±s，mg）

表2 河車壯兒膏對(duì)DNCB丙酮溶液所致小鼠的遲發(fā)性超敏反應(yīng)的作用（±s，mg）

注:與CTX組比較，**P＜0.01。

10 CTX黃芪顆粒組17.28±1.**12.79±3.92 17.24±3.43**18.48±3.20**

4 河車壯兒膏對(duì)雞紅細(xì)胞致敏小鼠溶血素抗體生成的作用

4.1 方法:分組、給藥、制造模型同上。從給藥后的第4天起，各組小鼠按0.4ml/只劑量腹腔注射5%雞紅細(xì)胞懸液。所有實(shí)驗(yàn)組給藥后第14天，從眼球取血，置于管中，室溫下放置1h后離心（2000r/min），10min后取血清，用0.9Nacl稀釋100倍后取lml，與5%雞紅細(xì)胞懸液0.5ml、豚鼠血清0.5ml混合，37℃置保溫30min后，再置于0℃冰箱30min，取出離心后取上清液，用分光光度計(jì)比色，選擇波長(zhǎng)540nm。另用0.9%NaCl做空白對(duì)照，取上清液作為比色基準(zhǔn)。以光密度值為指標(biāo)計(jì)量血清溶血素。

4.2 結(jié)果:壯兒膏組和黃芪顆粒組小鼠的血清溶血素含量高于CTX組（P＜0.01），表明河車壯兒膏和黃芪顆粒對(duì)CTX引起免疫功能下降小鼠溶血素抗體產(chǎn)生有較明顯促進(jìn)作用；河車壯兒膏與黃芪顆粒間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 壯兒膏對(duì)雞紅細(xì)胞致敏小鼠血清溶血素抗體產(chǎn)生的作用（±s）

表3 壯兒膏對(duì)雞紅細(xì)胞致敏小鼠血清溶血素抗體產(chǎn)生的作用（±s）

注:與CTX組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

A 0.25±0.06*0.20±0.03 0.28±0.05**0.30±0.07**CTX組黃芪顆粒組10 10

5 結(jié)語(yǔ)

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究表明，兒童反復(fù)呼吸道感染與其免疫功能的降低有非常顯著的相關(guān)性。河車壯兒膏從培育小兒正氣的角度出發(fā)來(lái)增強(qiáng)小兒對(duì)疾病的抵抗力，這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所闡明的呼吸道反復(fù)感染與小兒免疫功能的關(guān)系是一致的。本研究結(jié)果顯示，河車壯兒膏能促進(jìn)CTX引起免疫功能降低小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用；能增強(qiáng)CTX引起免疫功能降低小鼠的遲發(fā)性超敏反應(yīng)；能促進(jìn)CTX引起免疫功能下降的小鼠溶血素抗體生成。以上實(shí)驗(yàn)從藥效學(xué)的角度證實(shí)了河車壯兒膏具有益氣養(yǎng)陰的功效，可用于調(diào)理氣血兩虛證小兒呼吸道反復(fù)感染病癥。