槐角中染料木苷和槐角苷的勻漿-超聲協(xié)同提取工藝的研究

范昌文 ,李欣 ,徐明 ,楊磊* ,付卓銳 ,莫開林*

1.東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040；

2.涼山州林業(yè)調(diào)查規(guī)劃設(shè)計院,四川 西昌 615000；

3.四川省林業(yè)科學(xué)研究院,四川 成都 610081

槐角是豆科喬木植物槐（Styphnolobium japonicum）的莢果，成熟后經(jīng)過炮制可入藥，具有清熱涼血之功效，常用于腸熱便血，眩暈?zāi)砍嗟劝Y狀，因此被收錄于2020 年版本的《中國藥典》[1]?；瘜W(xué)成分研究表明槐角中含有豐富的異黃酮類物質(zhì)，如染料木苷和槐角苷等[2]，異黃酮被人們認(rèn)為是植物雌激素，具有預(yù)防骨質(zhì)疏松和心腦血管病變，抗癌等功效[3]。在已有的研究報道中，異黃酮類物質(zhì)提取的方法有回流提取法、亞臨界水提取法、加壓溶劑提取等方法[4,5]，但都存在提取效率低、反應(yīng)時間長、操作成本高等缺點。因此，尋找高效的具有工業(yè)化前景的提取槐角中的染料木苷與槐角苷的工藝研究勢在必行。

勻漿是通過高速運轉(zhuǎn)的刀片和流體切割的作用，在勻漿裝置中將物料與提取溶劑混合，將物料粉碎。勻漿還有助于將樣品與萃取溶劑徹底混合，因此萃取溶劑可以更好地滲透到樣品中，讓物料的破碎與提取同步進行，強化提取效率。該方法以往經(jīng)常用于在動物組織中提取蛋白質(zhì)[6]、氨基酸[7]等成分，由于它操作簡單，還省去了粉碎的步驟，同時還能避免粉塵的出現(xiàn)，因此對于植物材料的提取也有很大的適用價值[8]。作為一種常用的提取方法，超聲輔助提取的優(yōu)點是提取效率高，而且易于工業(yè)放大。超聲波產(chǎn)生的振動效應(yīng)和空化效應(yīng)，使異黃酮等胞內(nèi)物質(zhì)釋放、溶解和擴散速度加快，從而使提取效率明顯提高[9-12]。嘗試采用勻漿-超聲協(xié)同提取法從槐角中同時提取染料木苷與槐角苷，為槐角進一步的開發(fā)利用提供一定的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

槐角購于大西北藥業(yè)有限責(zé)任公司，室溫下避光儲存在密閉玻璃干燥器內(nèi)，所有用到的槐角原料均來自同一批次。對照品染料木苷（純度≥98%）、槐角苷（純度≥98%）從阿拉丁（中國上海）生化科技股份有限公司購入，色譜級甲醇和磷酸從塞莫非世爾科技（中國）有限公司購入，乙醇從天力（中國天津）化學(xué)試劑有限公司購入。1260 高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；JY92-IID 超聲波細胞破碎儀，上海熙揚儀器有限公司；多功能破壁機，中山市今彩電器廠。

2 實驗方法

2.1 高效液相色譜定量測定的條件

染料木苷和槐角苷分別采用高效液相色譜法測定，儀器為安捷倫Agilent1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），安捷倫色譜柱，型號為Agilent 5 TCC18，填料粒徑5 μm，柱長度250 mm，直徑4.6 mm，色譜條件：流動相比例為甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液，洗脫梯度為：0—2 min，10%A；2—13 min，10%A—60%A；13—15 min，60%A—85%A；15—20 min，85%A；20—21 min，85%A—10%A；21—25 min，10%A。洗脫流速是1.0 mL·min-1，進樣量為10 μL，檢測波長是262 nm，柱溫是30 ℃，檢測總運行時間是25 min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

分別配置0.1，0.2，0.4，0.5，0.75，0.85 和1 mg·mL-1染料木苷對照品溶液與0.067，0.133，0.200，0.267，0.333，0.400 和0.667 mg·mL-1的槐角苷對照品溶液。對上述對照品按順序分別取10μL 的溶液分別進樣，將每個濃度重復(fù)3 次，得回歸方程?；貧w方程經(jīng)線性擬合后得到為：

式中：X 為對照品濃度(mg·mL-1)，YA、YB分別為染料木苷和槐角苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液對應(yīng)的峰面積。

2.3 樣品中染料木苷和槐角苷的含量測定

稱取槐角原料5 g，加入乙醇溶液后一同放入勻漿機里勻漿處理一段時間，之后再將溶液超聲處理。超聲結(jié)束后，對提取液進行減壓抽濾，取上清液1 ml，加甲醇稀釋10 倍，再取稀釋溶液2 ml，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，HPLC 檢測得到稀釋溶液樣品中染料木苷與槐角苷的峰面積，將其帶入回歸方程，得到染料木苷和槐角苷的濃度。兩種目標(biāo)成分得率計算公式：

式中：Y 為提取產(chǎn)物染料木苷或槐角苷的得率(mg·g-1)，c 為稀釋溶液濃度(mg·mL-1)，v 為稀釋溶液的體積(mL)，m 為加入的槐角的質(zhì)量(mg)。

2.4 勻漿-超聲協(xié)同提取染料木苷和槐角苷

精密稱取槐角原料5 g，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液后放入勻漿機中在特定的勻漿速率下勻漿處理一段時間后，將溶液轉(zhuǎn)移到燒杯中，之后放入超聲提取儀中進行超聲處理，反應(yīng)結(jié)束后，再將提取液減壓抽濾，之后從上清液中吸取1 mL,用甲醇稀釋10 倍，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后，進行HPLC 檢測。在其他條件不變的前提下，分別改變乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、勻漿時間、勻漿速率、超聲時間、超聲功率、超聲空化時間、超聲緩沖時間這些因素，確定最佳提取方案。

3 結(jié)果與討論

3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

以乙醇為提取溶劑，在液料比20 mL·g-1，勻漿時間3 min，勻漿速率22 000 r·min-1，超聲時間30 min，超聲功率250 W，超聲空化時間2 s，超聲間隔時間2 s 的條件下，選取乙醇溶液濃度0%，10%，30%，50%，70%和90%進行勻漿-超聲協(xié)同提取單因素試驗，實驗結(jié)果見圖1。由圖1 可以看出，染料木苷、槐角苷的得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，逐漸變大，推測是因為隨著有機溶劑濃度升高，溶劑的極性逐漸降低，染料木苷和槐角苷根據(jù)相似相溶原理，溶解量增加所致。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時，二者得率達到最大，之后略有下降，可能是因為溶劑濃度過高，脂溶性變大，導(dǎo)致物料中油脂成分析出，使目標(biāo)產(chǎn)物的溶解量相對減少。因此選擇50%的乙醇作為最佳溶液濃度。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響Fig.1 Effects of ethanol volume fraction on the yield of genistin and sophoricoside

3.2 液料比的影響

在其他提取條件不變的情況下，選擇液料比10，15，20，25 和30 mL·g-1進行實驗。實驗結(jié)果如圖2 所示，染料木苷、槐角苷的得率隨著液料比增大而逐漸變大，當(dāng)液料比超過20 mL·g-1時，得率不再有顯著增長，因此為了節(jié)約原料，降低成本，選擇20 mL·g-1作為最佳液料比。

圖2 液料比的影響Fig.2 Effects of liquid-solid ratio on the yield of genistin and sophoricoside

3.3 勻漿時間的影響

其他條件不變，選擇勻漿時間分別為1，2，3，4 和5 min 進行提取實驗，實驗結(jié)果見圖3。由圖3可知，兩個目標(biāo)產(chǎn)物的得率隨著勻漿時間的增加而變大，這是因為勻漿時間越長，物料粉碎效果越好，促進了槐角異黃酮苷的釋放和溶解。當(dāng)勻漿時間增加到3 min 時，得率增加趨勢趨于平緩，說明粉碎程度已經(jīng)接近最好，因此選擇3 min 作為最佳勻漿時間。

圖3 勻漿時間的影響Fig.3 Effects of homogenate time on the yield of genistin and sophoricoside

3.4 勻漿速率的影響

在其他條件不變下，選擇勻漿速率分別為19 000，21 000，22 000，22 600 和23 400 r·min-1進行提取實驗。實驗結(jié)果如圖4 所示，隨著勻漿速率的增大，兩個目標(biāo)產(chǎn)物的得率逐漸增大，因為勻漿速率越大，物料的粉碎越快，粉碎程度越好。當(dāng)速率超過22 000 r·min-1，得率幾乎不再有明顯變化，因此選擇22 000 r·min-1作為最佳勻漿速率。

圖4 勻漿速率的影響Fig.4 Effects of homogenate speed on the yield of genistin and sophoricoside

3.5 超聲時間的影響

為考察超聲時間對提取效率的影響，選擇超聲時間分別為20，25，30，35 和40 min，其他提取參數(shù)不變，進行勻漿-超聲協(xié)同提取單因素試驗，實驗結(jié)果見圖5。從圖五能夠看出，在20—35 min 時，染料木苷與槐角苷得率迅速升高，當(dāng)超聲時間超過35 min 時，得率基本持平，說明超聲波促進了目標(biāo)產(chǎn)物在溶劑中的釋放和溶解，但當(dāng)釋放達到一定的峰值時，超聲時間再延長也不會對提取效率產(chǎn)生明顯影響。因此選擇35 min 作為最佳超聲時間。

圖5 超聲時間的影響Fig.5 Effects of ultrasonic time on the yield of genistin and sophoricoside

3.6 超聲功率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，液料比20 mL·g-1，勻漿時間3 min，勻漿速率22 000 r·min-1，超聲時間35 min，超聲空化時間2 s，超聲間隔時間2 s 的條件下，選擇超聲功率分別為200，250，300，350 和400 W 進行提取實驗，實驗結(jié)果見圖6。從圖六能夠看出，兩個目標(biāo)產(chǎn)物的得率隨著超聲功率的增大而逐漸增加，當(dāng)功率達到350 w 后，得率達到最大，之后功率繼續(xù)增大，得率則趨于穩(wěn)定，所以選擇350 W作為最佳超聲功率。

圖6 超聲功率的影響Fig.6 Effects of ultrasonic power on the yield of genistin and sophoricoside

3.7 空化時間和緩沖時間的影響

在其他條件如3.6 中一樣時，控制不同的超聲空化時間(1.0—3.0 s)和超聲緩沖時間(0.5—2.5 s)，不同超聲空化時間的產(chǎn)物得率的影響如圖7 所示，兩個目標(biāo)產(chǎn)物隨著超聲空化時間的增加，其得率逐漸增加，推測是因為空化時間越長，有效超聲的時間則越長，目標(biāo)產(chǎn)物的溶解和擴散越快。當(dāng)超聲空化時間超過2.5 s 時，得率不再有明顯變化，考慮到能耗的因素，因此選擇2.5 s 作為最佳超聲空化時間。

圖7 空化時間的影響Fig.7 Effects of cavitation time on the yield of genistin and sophoricoside

圖8 顯示了不同緩沖時間的染料木苷和槐角苷得率的影響，從圖8 能夠看出，緩沖時間從0.5 s 增長到1.5 s 時，兩種槐角異黃酮苷的得率相似，之后緩沖時間再增長，得率開始下降，由于不間斷長時間工作容易形成空載，使儀器壽命縮短。所以從保護儀器，減少能耗的角度考慮，選擇1.5 s 為最佳超聲緩沖時間。

圖8 超聲間隔時間的影響Fig.8 Effects of buffer time on the yield of genistin and sophoricoside

4 結(jié)論

實驗選用乙醇作為提取溶劑，通過單因素實驗得到勻漿-超聲協(xié)同提取染料木苷與槐角苷的最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，液料比20 mL·g-1，勻漿時間3 min，勻漿速率22 000 r·min-1，超聲時間35 min，超聲功率350 W，超聲空化時間2.5 s，超聲緩沖時間1.5 s。此工藝下染料木苷和槐角苷的得率分別為33.70 mg·g-1和95.02 mg·g-1。勻漿-超聲協(xié)同提取法具有環(huán)保、穩(wěn)定和高效的優(yōu)勢，具有較好的應(yīng)用前景。