林木組織培養(yǎng)的褐化現(xiàn)象及控制途徑

王梓默, 林士杰, 朱紅波, 何懷江, 張大偉, 楊 帆

(1. 吉林省林業(yè)科學研究院, 吉林 長春 130033; 2. 吉林省林業(yè)調查規(guī)劃院, 吉林 長春 130022)

作為以細胞全能性理論為基礎的無性繁殖技術,植物組織培養(yǎng)具有能夠保持母本優(yōu)良性狀、繁殖速度快等優(yōu)勢,對于有性繁殖難度大、扦插不易成活的林木繁殖具有重要的應用價值,目前已被廣泛應用于離體快繁[1]、種質資源保存、脫毒苗木培育、遺傳育種及物種保護等方面[2]。但在林木組織培養(yǎng)的過程中經常發(fā)生褐化現(xiàn)象,不僅影響外植體的生長,甚至可能直接導致培養(yǎng)物死亡,有效控制褐化已經成為林木組織培養(yǎng)成功率提高的關鍵[3-5]。本文概述了近年來林木組織培養(yǎng)褐化研究進展,總結了褐化的影響因素與控制途徑,以期為木本植物高效組培技術體系的建立提供參考。

1 林木組織培養(yǎng)褐化的影響因素

關于林木組織培養(yǎng)褐化的原因主要集中于2類觀點:第一種觀點認為褐化主要是由過氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶等與底物酚類物質發(fā)生反應形成醌類物質,醌類物質經脫水、聚合產生黑褐色物質,使外植體及培養(yǎng)基褐化,導致樹木生長受阻甚至死亡,即酶促褐化[6, 7];第二種觀點認為組培過程中受不利外界條件的影響,造成了植物細胞程序性死亡,即脅迫褐化[8]。2種褐化問題發(fā)生機制的本質區(qū)別在于是否有酚類物質參與反應。林木組織培養(yǎng)褐化的發(fā)生,一方面與外植體的選擇有關,主要指所取外植體本身的遺傳特性、生理狀態(tài)等;另一方面受開展組織培養(yǎng)的條件影響,既包括溫度、光照等培養(yǎng)條件,也包括培養(yǎng)基的成分[9]。

1.1 外植體的遺傳特性及生理狀態(tài)

1.1.1 外植體的遺傳特性

組織培養(yǎng)過程中褐化發(fā)生與樹種類型和基因型有關,不同物種間褐化發(fā)生的情況不同。已有研究證明,酚酸、黃酮、單寧、木質素、色素等的含量與木本植物的褐化程度密切相關[10],這些物質含量較高的樹種更容易發(fā)生褐化,如梨[11]、桃[12]、蘋果[13]、銀杏[14]、核桃[15]等木本植物更容易在組織培養(yǎng)過程中遇到褐變問題。不同品種間褐化也存在差異,與植物中所含酚類物質的數(shù)量、種類及酶活性不同有關。崔雪梅以同科不同屬的暴馬丁香、水曲柳作為試驗樹種,發(fā)現(xiàn)組織培養(yǎng)過程中水曲柳外植體發(fā)生褐變的概率明顯高于暴馬丁香,可能是由于水曲柳中多酚物質含量高于暴馬丁香,同時暴馬丁香中多酚氧化酶(PPO)的活性較低,降低了對酚類物質的氧化能力[16]。涂俊凡等對沙梨帶芽莖段無菌培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)褐化差異與外植體的基因型相關,6個試驗品種中“金水2號”較容易褐變,“圓黃”非常容易褐變,其余4個品種褐變程度明顯較輕[17]。丁植磊等對12種油茶品種進行花藥愈傷組織的誘導,發(fā)現(xiàn)雖然每個油茶品種均有褐化現(xiàn)象,但不同油茶物種間差別較大,其中紅花油茶的褐化現(xiàn)象明顯比白花油茶嚴重[18]。李新鳳等的研究表明,牡丹組織培養(yǎng)時應注意基因型的選擇,不同品種牡丹間組培褐化率差異顯著,褐化程度較輕的“金陽”“金閣”和“賽雪塔”更適合做外植體[19]。

1.1.2 外植體的生長部位與生理狀態(tài)

外植體的生長部位與生理狀態(tài)也是影響組織培養(yǎng)褐化的主要因素。以同一樹種不同部位器官作為外植體或以不同生理狀態(tài)下的相同器官作為外植體時,樹木的褐化情況也有所不同,常見外植體包括根莖的萌芽、根、腋芽和頂芽等。在臺灣榿木[20]、隴東海棠[21]的組織培養(yǎng)過程中均發(fā)現(xiàn)以莖尖為外植體時褐變發(fā)生早,且褐化率及因褐化死亡率明顯高于帶芽莖段,帶芽莖段是更好的外植體材料。楊蘭芳以茶條槭當年生萌條的頂芽和帶芽莖段為外植體進行初代試驗,研究結果表明,帶芽莖段與頂芽相比褐化嚴重,褐化率達20.35 %[22]。張繼偉通過對10年生琵琶樹幼嫩葉的葉柄及葉脈離體培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)隨葉柄、中葉脈、上葉脈褐化率的增加,存活率及愈傷組織發(fā)生率依次降低,篩選出中葉葉柄為理想的培養(yǎng)材料[23]。喻娜的研究結果表明,銀杏莖尖的幼嫩程度對其接種后褐化程度產生直接影響,以當年生相對幼嫩的嫩芽作為外植體褐化率明顯高于枝條上的幼莖尖[24]。黃燕芬等對茶樹組織培養(yǎng)外植體褐化的研究結果表明,保留帶腋芽葉片2/5時能夠緩解腋芽褐化現(xiàn)象,但需注意葉片消耗培養(yǎng)基養(yǎng)分的問題[25]。

外植體的大小也對褐化程度有一定影響。李圓圓通過對刺楸頂芽離體培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),較大頂芽作為外植體進行離體培養(yǎng)時褐化現(xiàn)象嚴重,褐化圈較大,相對較小的頂芽其褐化圈相對較小[26]。宋春暉等對柱狀蘋果進行離體培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)外植體莖段過長會增加污染率,同時導致萌芽率降低,選擇帶有2個腋芽的莖段作為外植體時生長效果最佳[27]。以不同材料為外植體時,其大小對褐化程度的影響也不同。張繼偉等對琵琶樹幼嫩葉進行離體培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn),葉片的大小對組培褐化率影響十分明顯,其中大葉片的褐化率反而最低[23]。

取材季節(jié)和消毒時間也與外植體的褐變率關系密切。對茶樹離體增殖與再生體系研究表明,秋季取材的污染率較高,一方面可能是由于春季腋芽剛萌生,自身攜帶的細菌相對較少,而秋季取材時腋芽已經經歷較長時間的生長,攜帶的細菌增加,因此消毒相對更難;另一方面可能與春季茶樹新梢中的多酚物質含量比秋季更低有關。因此,選擇春季取材外植體的褐化率更低[28]。陳麗等對血皮槭快繁外植體褐化問題的研究發(fā)現(xiàn),不同時間采摘的外植體褐化程度不同,在4—5月采摘的外植體褐化和分化均較少,而7—8月采摘的外植體褐化率較高,只有在6月采摘的外植體褐化少且分化高[29]。對刺楸莖椴進行離體培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn),接近夏季時取材,外植體的褐化現(xiàn)象較5月更加嚴重,誘導分化困難且污染率更高[26]。在對楸樹、板栗、鄧恩桉等愈傷組織誘導研究中發(fā)現(xiàn),通過酒精、升貢等對外植體消毒處理時間過長時褐變率上升,萌芽率降低[30]。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

1.2.1 培養(yǎng)基的組分與形態(tài)

培養(yǎng)基是外植體的生長環(huán)境,其組分與形態(tài)都影響著外植體的褐化率。對桑樹[31]、柿樹[32]、蘋果梨[33]、茶樹[25]等進行組織培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn),木本植物在1/2 DKW或者1/2 MS培養(yǎng)基上褐化程度減輕。對華蓋木的組織培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基硬度較高時褐化較輕,褐化死亡率降低[34]。當培養(yǎng)基中無機鹽、蔗糖與大量元素濃度過高時會促進植物體細胞中酚類物質的合成,加劇外植體的褐化[8]。pH決定培養(yǎng)基的滲透壓、影響酚類物質與多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)等的結合位點[35],當培養(yǎng)基pH過高時外植體更容易發(fā)生褐化[36]。植物生長調節(jié)劑的添加也對褐化產生影響,已有研究表明,在高濃度的外源激素作用下鄧恩桉、巨桉帶芽莖段誘導褐化率較高,降低激素濃度后褐化現(xiàn)象得到緩解[37]。同種激素對不同樹種組培褐化影響不同,在紫杉芽誘導過程中添加6-BA后加劇了褐化,而在南方紅豆杉組培過程中添加6-BA對外植體的褐化卻起到了抑制作用[38]。此外,抗氧化劑與吸附劑也能夠有效阻止褐化發(fā)生,其抑制褐化的作用在核桃[15]、桑樹[31]、紅豆杉[39]、華蓋木[34]的組織培養(yǎng)過程中均得到了證實。

1.2.2 培養(yǎng)條件

溫度影響多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)等的活性[40],與組織培養(yǎng)褐化現(xiàn)象緊密相關,在中華紅葉楊組織培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn),高溫時酶活性增強,褐化現(xiàn)象加劇[41]。雷樊登將接種后的茶樹腋芽置于25 ℃和8 ℃條件下避光培養(yǎng)16 h后,再置于25 ℃條件下培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)溫度升高明顯促進了褐變,褐化率比低溫培養(yǎng)褐化率高18.1 %[28]。但不同植物對溫度的反應不同,已有研究表明,低溫預處理能夠顯著影響水曲柳外植體發(fā)生數(shù),但對于外植體褐變率的影響并不顯著[42]。此外,光照也是影響褐化發(fā)生的主要培養(yǎng)條件之一,王曉麗等以直干桉超級苗莖段為外植體開展組培快繁技術研究,發(fā)現(xiàn)暗培養(yǎng)條件下外植體褐化率顯著降低[43]。

2 林木組織培養(yǎng)褐化的控制途徑

2.1 合適取材與優(yōu)化處理

為了避免林木組織培養(yǎng)過程中褐化問題發(fā)生,首先應優(yōu)化外植體的選擇和處理。多項試驗研究證明,多年生、木質化程度高的木本植物枝條與高度分化的組織更容易發(fā)生褐化,因此,外植體應盡量選擇幼嫩植株上分生能力強的部位。取材時間應盡量避免夏季,在冬季或春季休眠期取材,枝條中酚類物質含量較低。不同品種、不同取材部位的外植體對消毒劑的耐受程度不同,應根據(jù)組培對象的生理特性與組織結構特點選擇消毒劑類型、濃度與消毒時間,避免消毒時間過久加劇褐變[13]。Bonga等在巨桉組織培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn),取材切割產生的創(chuàng)面與體積之比越大時褐化現(xiàn)象越嚴重[38]。因此,在獲取外植體時切口盡量平整,避免產生大面積創(chuàng)面。此外,在接種之前對外植體進行遮光、低溫保存以及用無菌水沖洗也能降低褐變率[44]。

2.2 調整適宜的培養(yǎng)條件

創(chuàng)建適宜的培養(yǎng)條件能促進細胞脫分化和再分化,抑制褐化發(fā)生。通過調整培養(yǎng)基中無機離子、蔗糖以及生長調節(jié)劑適宜配比能減少褐化發(fā)生。在桑樹和核桃組織培養(yǎng)過程中降低無機鹽濃度后外植體的褐變率也隨之下降[35, 45]。此外,在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑與吸附劑也能減少褐化。常用的抗氧化劑包括檸檬酸、植酸、血清白蛋白、維生素C、維生素E、聚乙烯吡咯烷酮等,吸附劑包括活性炭、PVP等,通常吸附劑的使用濃度為0.1 %～0.5 %,根據(jù)不同的培養(yǎng)材料設計試驗,篩選抑制褐變效果更好的抗氧化劑與吸附劑種類及濃度[46]。在不影響試材生長和分化的前提下,接種后可以通過降低溫度、遮光培養(yǎng)、黑暗培養(yǎng)等方法抑制褐化。在木本植物組織培養(yǎng)過程中,可以根據(jù)培養(yǎng)材料的生理特性及褐化程度采用多種方法綜合防控褐化現(xiàn)象的發(fā)生。張俊琦等在牡丹組織培養(yǎng)防止褐化的研究中發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)基中添加吸附劑并結合暗培養(yǎng),能夠有效緩解褐化[47]。李婷婷等對不同基因型刺梨葉片愈傷組織的誘導結果表明,春季取材后在100 mg·L-1VC溶液中浸泡12 h,在培養(yǎng)基中添加2.0 g·L-1的檸檬酸或0.4 g·L-1的AgNO3可以有效控制葉片褐化的發(fā)生[48]。張俊林等對核桃莖段抗褐化研究發(fā)現(xiàn),首先通過24 h的1～2 ℃低溫處理,再用20 %的Na2S2O3溶液浸泡20～30 min后進行8～10 h的流水沖洗,在培養(yǎng)基中添加2.0 g·L-1PVP時外植體的褐化率達到最低[49]。

3 展望

褐化問題作為植物組織培養(yǎng)中的難題之一,不僅延長了組織培養(yǎng)的時間并提高了經濟成本,同時制約著組織培養(yǎng)快繁技術在科研工作與實際生產中的應用。本文對林木組織培養(yǎng)過程中的影響因素進行總結與分析,針對性地提出了組織培養(yǎng)褐化的控制途徑,不僅適用于預防褐變,同時適用于緩解已有褐化現(xiàn)象,為進一步開展高效林木組培技術研究提供參考。目前,無糖培養(yǎng)、開放式組培與開放式光自養(yǎng)微繁等新技術的研發(fā)為林木組織培養(yǎng)快繁技術的應用與發(fā)展提供了機遇,但組織培養(yǎng)技術自動化程度與國外相比仍有待提高。隨著組織培養(yǎng)新技術的不斷發(fā)展與完善,組織培養(yǎng)條件高度自動化調節(jié)將成為未來的主要研究方向,實現(xiàn)培養(yǎng)環(huán)境中光、溫、氣、水的自動化調控,能夠有效控制褐化問題的產生,提高林木組織培養(yǎng)成功率,降低組培苗生產成本,對林木組織培養(yǎng)產業(yè)化發(fā)展具有重要意義。