中介體復(fù)合物亞基8在胃癌中的表達(dá)及其對臨床預(yù)后和細(xì)胞周期的影響

王秋生，張 震，楊 子，張小鳳，葛思堂，左蘆根，

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1胃腸外科 2中心實(shí)驗(yàn)室 3炎癥相關(guān)性疾病基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽蚌埠 233000

胃癌是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一[1]。據(jù)SEER數(shù)據(jù)庫顯示，2007至2021年胃癌患者的5年生存率依次為38.3%、40.6%和42.9%，呈緩慢上升趨勢，且晚期胃癌患者的5年生存率僅為10%，胃癌患者的遠(yuǎn)期預(yù)后不容樂觀[2]。近年來，越來越多的學(xué)者嘗試從分子病理學(xué)層面尋找與胃癌預(yù)后有關(guān)的分子標(biāo)志物，探究其在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的生物學(xué)作用[3-4]，旨在為胃癌臨床診療提供新思路。細(xì)胞周期是多種生物學(xué)分子共同調(diào)控的結(jié)果，而細(xì)胞周期調(diào)控失衡是引起胃癌細(xì)胞惡性增殖的重要原因[5-6]，可顯著影響胃癌的發(fā)生發(fā)展及遠(yuǎn)期預(yù)后[7-8]。中介體復(fù)合物亞基8(mediator complex subunit 8，MED8)是一種RNA聚合酶調(diào)節(jié)因子，在mRNA轉(zhuǎn)錄過程中充當(dāng)RNA聚合酶Ⅱ和調(diào)節(jié)蛋白之間的橋梁[9]。有研究表明，MED8在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)且與預(yù)后不良相關(guān)[10]，被證實(shí)是腎細(xì)胞癌的致癌基因[11]。但MED8在胃癌中的表達(dá)及對患者預(yù)后的影響相關(guān)報(bào)道較少。本研究基于公共數(shù)據(jù)庫及病理組織學(xué)分析MED8在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)，探討MED8與胃癌患者臨床病理參數(shù)及遠(yuǎn)期預(yù)后的關(guān)系，利用生物信息學(xué)預(yù)測MED8在胃癌中的生物學(xué)作用，并采用細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，旨在明確MED8作為胃癌預(yù)后評估標(biāo)志物和治療新靶點(diǎn)的潛在應(yīng)用價(jià)值。

資料和方法

基線資料采集回顧性分析蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2012年6月至2017年7月行胃癌根治術(shù)的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)病理學(xué)檢查，明確診斷為原發(fā)性胃癌；成功施行胃癌根治術(shù)并達(dá)到肉眼及顯微鏡下均無腫瘤殘留。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他組織來源的惡性腫瘤；臨床資料缺失。依據(jù)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)入選并采集患者相關(guān)資料：(1)基線資料：性別、年齡、術(shù)前外周血癌胚抗原、糖類抗原199、腫瘤大小、組織學(xué)分型、分化程度、TNM分期、手術(shù)病理診斷等信息；(2)生存資料：通過電話隨訪患者術(shù)后5年生存情況；(3)手術(shù)病理：調(diào)取癌組織及癌旁組織蠟塊，并進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。本研究獲得蚌埠醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審查編號：2019KY038)。

生物信息學(xué)分析TIMER2.0平臺(http：//timer.cistrome.org)分析MED8在人類常見腫瘤及胃癌中的表達(dá)情況。UALCAN平臺(ualcan.path.uab.edu)分析MED8在胃癌中的表達(dá)情況。Kaplan-Meier平臺(https：//kmplot.com/analysis/)分析MED8(探針：213127_s_at)與胃癌患者總生存期的相關(guān)性。UCSC Xena平臺(https：//xena.ucsc.edu)獲取GDC TCGA胃癌數(shù)據(jù)集基因表達(dá)豐度值表，共包含60 489個(gè)基因、407例組織，基迪奧生物平臺(https：//www.genedenovo.com)進(jìn)行差異基因分析及基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)，通過DAVID Bioinformatics Resources平臺(htpps：//david.ncifcrf.gov)獲取基因本體論(gene ontology，GO)及京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)基因富集列表，并采用Bioinformatics(www.bioinformatics.com.cn)在線作圖工具進(jìn)行富集結(jié)果可視化。

細(xì)胞培養(yǎng)、慢病毒轉(zhuǎn)染及分組胃癌細(xì)胞系(MGC-803)購自國家生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源庫，采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，使用過表達(dá)MED8載體(吉凱基因)和對照空載體(質(zhì)粒GV358)、MED8干擾(小干擾RNA：TTCAAACCTTCTGGAGAAAATCA)和對照空載體(質(zhì)粒GV248)對MGC-803細(xì)胞進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，步驟簡述為：調(diào)整細(xì)胞懸液密度為2×105個(gè)/ml，接種于6孔板，待細(xì)胞生長至70%，加入含有慢病毒(1×107TU/ml)和感染增強(qiáng)液的完全培養(yǎng)基進(jìn)行感染，7 h后更換完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h后用含1 μg/ml嘌呤霉素完全培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，利用免疫印跡法驗(yàn)證調(diào)控效果。實(shí)驗(yàn)分組為：正常對照組、過表達(dá)空載組、MED8過表達(dá)組、敲減空載組和MED8敲減組。

免疫組織化學(xué)染色及積分光密度值分析組織切片經(jīng)脫蠟水化、抗原修復(fù)、一抗MED8(1∶200，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)及二抗孵育、二氨基聯(lián)苯胺顯色、脫水及封片等處理，Image Pro Plus軟件對組織進(jìn)行積分光密度值(integrated optical density，IOD)定量分析。

免疫印跡實(shí)驗(yàn)采用放射免疫沉淀實(shí)驗(yàn)裂解液與蛋白酶抑制劑提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、凝膠成像，Image J軟件對圖像進(jìn)行分析處理。一抗信息如下：MED8、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4，Cdk4)和G1/S-特異性周期蛋白-D1(G1/S-specific cyclin-D1，CyclinD1)稀釋比均為1∶1000，購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)并收集MGC-803細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞沉淀，預(yù)冷磷酸緩沖鹽溶液洗滌后用70%冰冷乙醇4 ℃過夜固定。按照細(xì)胞周期檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)說明書進(jìn)行細(xì)胞周期檢測，并用Flowjo10.0軟件分析細(xì)胞周期不同時(shí)相的細(xì)胞比例。

結(jié) 果

MED8在胃癌組織的表達(dá)TIMER2.0平臺分析顯示，與正常組織相比，MED8在包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中高表達(dá)(P均<0.05)(圖1)，UALCAN平臺進(jìn)一步分析顯示，MED8在胃癌組織的表達(dá)顯著高于癌旁組織，且MED8在臨床1～4期、G2～3級、N0～3期的表達(dá)明顯高于正常組織(P均<0.05)(圖2)。免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)一步顯示，胃癌組織中MED8表達(dá)高于癌旁組織，且定位于癌細(xì)胞核中(t=34.670，P<0.001)(圖3)。

與正常組織比較，aP<0.05，bP<0.01

圖3 免疫組織化學(xué)檢測MED8蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)

胃癌組織中MED8表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系以胃癌組織中MED8表達(dá)相對IOD值的中位數(shù)(3.085)為界，將患者分為MED8高表達(dá)組(n=52)和MED8低表達(dá)組(n=52)，并分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示MED8表達(dá)水平與分化程度(P=0.029)、T分期(P=0.001)、N分期(P=0.006)及外周血癌胚抗原(P=0.048)、糖類抗原199(P=0.003)水平相關(guān)(表1)。

表1 胃癌組織中MED8的表達(dá)與臨床及病理參數(shù)的關(guān)系

MED8表達(dá)對胃癌患者術(shù)后5年生存率的影響及危險(xiǎn)因素分析Kaplan-Meier Plotter平臺分析MED8表達(dá)對胃癌患者生存率的影響，結(jié)果顯示MED8高表達(dá)組患者術(shù)后總生存期顯著低于MED8低表達(dá)組(P=0.002)(圖4A)。Kaplan-Meier生存分析顯示，MED8高表達(dá)組患者術(shù)后5年生存率顯著低于MED8低表達(dá)組[23.1%(12/52)比67.3%(35/52)，χ2=21.476，P<0.001)(圖4B)。單因素分析顯示，性別、年齡、腫瘤大小、組織學(xué)類型與胃癌患者術(shù)后5年生存期差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，而MED8高表達(dá)(P<0.001)、分化程度(P=0.020)、T分期(P<0.001)、N分期(P=0.003)、癌胚抗原(P<0.001)、糖類抗原199(P<0.001)可能是影響胃癌患者術(shù)后5年生存率的危險(xiǎn)因素(圖4C～4G)。Cox回歸進(jìn)一步分析顯示，MED8高表達(dá)(P=0.037)、腫瘤低分化(P=0.034)、T3～T4期(P=0.017)、N2～N3期(P=0.031)、癌胚抗原≥5 ng/ml(P<0.001)和糖類抗原199≥37 U/ml(P=0.012)是影響胃癌患者術(shù)后5年生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(圖4H)。

CEA：癌胚抗原；CA199：糖類抗原199

MED8表達(dá)對胃癌患者遠(yuǎn)期預(yù)后的預(yù)測價(jià)值繪制時(shí)間依賴性ROC工作曲線評估MED8表達(dá)對胃癌患者術(shù)后5年生存情況的預(yù)判價(jià)值，結(jié)果顯示以MED8相對表達(dá)量3.075為截?cái)嘀?，預(yù)判胃癌根治術(shù)后5年死亡的敏感度為71.9%，特異度為74.5%，曲線下面積為0.733(圖5)。

圖5 MED8表達(dá)對胃癌患者術(shù)后5年生存期的預(yù)測價(jià)值

MED8基因功能富集分析結(jié)果根據(jù)在線獲取的胃癌數(shù)據(jù)集基因表達(dá)豐度表，以MED8表達(dá)豐度值的中位數(shù)為界進(jìn)行分組，對60 489個(gè)基因進(jìn)行差異分析，共篩選出6006個(gè)差異表達(dá)基因，其中包括4856個(gè)表達(dá)上調(diào)基因和1150個(gè)表達(dá)下調(diào)基因(圖6A、6B)。對包括MED8在內(nèi)的6006個(gè)差異基因進(jìn)行基因富集及基因集富集分析，結(jié)果顯示GO富集的生物學(xué)過程包括細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂、凋亡等生物學(xué)過程(圖6C)；KEGG富集的通路包括細(xì)胞周期、p53信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路等(圖6D)；基因集富集分析結(jié)果顯示，6006個(gè)差異基因在胃癌、細(xì)胞周期、DNA復(fù)制等基因集中呈現(xiàn)正向調(diào)控(圖6E)。

GO：基因本體論；KEGG：京都基因與基因組百科全書

過表達(dá)MED8對MGC-803細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)化及細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響慢病毒轉(zhuǎn)染MGC-803細(xì)胞過表達(dá)MED8，Western blot檢測MED8蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后成功過表達(dá)MGC-803細(xì)胞MED8蛋白表達(dá)水平(P<0.001)(圖7A、7B)。細(xì)胞周期流式實(shí)驗(yàn)分析過表達(dá)MED8對MGC-803細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換的影響，結(jié)果顯示與過表達(dá)空載組相比，MED8過表達(dá)組MGC-803細(xì)胞G1期細(xì)胞比例顯著減少(P<0.001)，S期細(xì)胞比例顯著增加(P<0.001)(圖7C～7F)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測Cdk4和CyclinD1蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示與過表達(dá)空載組相比，MED8過表達(dá)組MGC-803細(xì)胞中的Cdk4和CyclinD1蛋白水平均顯著升高(P均<0.001)(圖7G、7H)。

Mr：相對分子質(zhì)量；Cdk4：細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4；CyclinD1：G1/S-特異性周期蛋白-D1

敲減MED8對MGC-803細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)化及細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響慢病毒轉(zhuǎn)染MGC-803細(xì)胞敲減MED8，Western blot檢測MED8蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后成功敲減MGC-803細(xì)胞MED8蛋白表達(dá)(P<0.001)(圖8A、8B)。細(xì)胞周期流式實(shí)驗(yàn)分析敲減MED8對MGC-803細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換的影響，結(jié)果顯示與敲減空載組相比，MED8敲減組MGC-803細(xì)胞G1期細(xì)胞比例顯著增加(P<0.001)，S期細(xì)胞比例顯著減少(P<0.001)(圖8C～8F)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測Cdk4和CyclinD1蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示與敲減空載組相比，MED8敲減組MGC-803細(xì)胞中的Cdk4和CyclinD1蛋白水平均顯著降低(P均<0.001)(圖8G、8H)。

A、B.Western blot檢測慢病毒轉(zhuǎn)染后基因調(diào)控效果；C～F.流式細(xì)胞學(xué)分析敲減MED8對MGC-803細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換的影響；G、H.Western blot檢測敲減MED8對MGC-803細(xì)胞中Cdk4和CyclinD1蛋白表達(dá)的影響

討 論

胃癌是一個(gè)全球性健康問題[12]，近50年來，針對胃癌的手術(shù)治療、全身化療和放療以及靶向和免疫治療等均取得了長足進(jìn)步[13]，然而，胃癌仍然是全球癌癥相關(guān)死亡的第3大原因[14]。尋找判斷胃癌遠(yuǎn)期預(yù)后的敏感特異性標(biāo)志物并探索其在胃癌中的作用，有望改善患者預(yù)后并為胃癌的治療提供更多參考[15-16]。本研究基于公共數(shù)據(jù)庫及本機(jī)構(gòu)臨床病例發(fā)現(xiàn)MED8在胃癌中高表達(dá)且對胃癌患者的遠(yuǎn)期預(yù)后具有較高的的預(yù)測價(jià)值，同時(shí)，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明MED8蛋白表達(dá)水平顯著影響細(xì)胞周期進(jìn)程，有望成為評估胃癌患者遠(yuǎn)期預(yù)后和胃癌治療新靶點(diǎn)的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

本研究通過在線數(shù)據(jù)庫挖掘發(fā)現(xiàn)MED8在胃癌組織中高表達(dá)，免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)表明MED8在胃癌組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織。為進(jìn)一步探索MED8在評估胃癌患者遠(yuǎn)期預(yù)后的臨床價(jià)值，本研究通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫挖掘發(fā)現(xiàn)MED8高表達(dá)組患者術(shù)后總生存期顯著低于MED8低表達(dá)組；結(jié)合本機(jī)構(gòu)臨床病例隨訪資料繪制Kaplan-Meier生存曲線，結(jié)果提示MED8高表達(dá)組患者有更低的5年生存率。既往研究表明，MED8在肝癌組織中高表達(dá)且與患者預(yù)后不良密切相關(guān)[9-10]；MED8與透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌的惡性進(jìn)展相關(guān)并被證實(shí)是腎細(xì)胞癌的致癌基因[11]，與本研究結(jié)果相似。此外，Cox回歸模型分析表明，MED8高表達(dá)是影響胃癌患者術(shù)后5年生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可作為影響胃癌發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立影響因子，同時(shí)，ROC曲線進(jìn)一步提示MED8蛋白表達(dá)水平對評估胃癌患者術(shù)后5年生存率具有較高的預(yù)測價(jià)值。但MED8影響胃癌患者術(shù)后5年生存期的具體途徑或機(jī)制尚不明確。

MED8位于中介體的頭部[17]，是mRNA轉(zhuǎn)錄過程所必需的一種RNA聚合酶調(diào)節(jié)因子，在mRNA轉(zhuǎn)錄過程中充當(dāng)RNA聚合酶Ⅱ和調(diào)節(jié)蛋白之間的橋梁[9-18]。為進(jìn)一步挖掘MED8影響胃癌進(jìn)展及遠(yuǎn)期預(yù)后的可能途徑，本研究通過TCGA公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO、KEGG及GSEA富集分析，結(jié)果提示MED8可能參與細(xì)胞周期、DNA復(fù)制等生物學(xué)過程。同時(shí)，流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)及免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，過表達(dá)MED8可顯著促進(jìn)MGC-803處于G1期細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)化，且過表達(dá)組細(xì)胞Cdk4和CyclinD1蛋白水平顯著升高，敲減組則相反。提示MED8可能通過調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程進(jìn)而影響胃癌疾病進(jìn)展及遠(yuǎn)期預(yù)后。

Zeng等[19]研究指出，胃癌作為一組異質(zhì)性疾病具有獨(dú)特的發(fā)病機(jī)制和分子致病途徑，一定程度上造成了胃癌的治療效果欠佳及預(yù)后不良。Hume等[5]指出，G1期細(xì)胞過度活躍或加速進(jìn)入S期會導(dǎo)致復(fù)制應(yīng)激和DNA損傷，可引發(fā)并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。近年，基于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的分子治療有望改善胃癌患者的不良預(yù)后[20]，F(xiàn)ukami等[21]進(jìn)一步指出，特定生物學(xué)分子高表達(dá)引起的細(xì)胞周期改變可對胃癌的遠(yuǎn)期預(yù)后產(chǎn)生重要影響。本研究顯示MED8在胃癌組織中高表達(dá)且與患者不良預(yù)后相關(guān)，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)MED8可促進(jìn)MGC-803處于G1期的細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)化，加快細(xì)胞周期進(jìn)程，敲減MED8則相反，提示靶向MED8基因進(jìn)行腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控并進(jìn)一步抑制腫瘤細(xì)胞惡性增殖，有望成為胃癌治療的新策略。

本研究的不足：(1)本研究是回顧性研究，存在病例選擇偏倚及資料收集的局限性；(2)本研究納入病例數(shù)有限，所得結(jié)果需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證；(3)在線數(shù)據(jù)庫的分析顯示不同病理分級、分期不影響MED8的表達(dá)，但本研究納入的臨床樣本分析顯示MED8表達(dá)水平與分化程度、T分期、N分期均有關(guān)，該問題仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量以驗(yàn)證；(4)MED8對胃癌細(xì)胞其他生物學(xué)功能的影響及可能參與的分子信號通路仍需進(jìn)一步探索及驗(yàn)證。

綜上，MED8在胃癌中高表達(dá)且可能通過調(diào)控胃癌細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換影響疾病進(jìn)展，并對患者預(yù)后的評估具有潛在臨床價(jià)值。