昆布多糖通過ERK通路對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠異位病灶及血管新生的抑制作用*

趙哲君,閆 霜,年衛(wèi)紅,陳雁南

(1.河南省榮軍醫(yī)院婦產(chǎn)科,河南 新鄉(xiāng) 453003; 2.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科,河南 鄭州 450052)

子宮內(nèi)膜異位癥是臨床常見的婦科疾病,多見于育齡期女性,臨床表現(xiàn)為下腹墜痛、痛經(jīng)、經(jīng)期紊亂、不孕等[1]。目前臨床對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥尚無標(biāo)準(zhǔn)治療方式,多采用抗炎、止痛藥物配合抗雌激素藥物,通過降低炎癥反應(yīng)、抑制血管生成來緩解疼痛,但長(zhǎng)期服用會(huì)導(dǎo)致子宮萎縮且存在停藥復(fù)發(fā)現(xiàn)象[2]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為子宮內(nèi)膜異位癥的病機(jī)以瘀血內(nèi)停、腎虛血瘀為主,治療宜以活血化瘀、補(bǔ)腎利水為主。昆布取自海帶科植物海帶或翅藻科植物昆布的干燥葉片,可消痰軟堅(jiān)散結(jié),利水消腫,常被用于生殖系統(tǒng)疾病的治療。昆布多糖(laminarin,LA)提取自昆布,是一種天然海洋生物多糖,具有抗炎、抗病毒、降血壓、降血脂、保護(hù)血管等多種生物醫(yī)學(xué)功能[3]。研究[4]表明,LA可通過抑制一氧化氮生成、抑制炎癥刺激下的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖治療大鼠化膿性腦膜炎,推測(cè)其可對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生影響。本研究通過建立子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型,探究LA對(duì)其異位病灶及血管新生的抑制作用,并探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

無特定病原體級(jí)SD大鼠45只,雌性,7周齡,體質(zhì)量(200±10)g,購(gòu)自北京安凱毅博生物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)為SCXK(京)2017-0006,動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為2019A035。實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所的使用許可證編號(hào)為SYXK(豫)2021-0013。

1.2 藥品、試劑與儀器

LA,純度99%,上海谷研實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品,批號(hào)9008-22-4;細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路激動(dòng)劑表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF),美國(guó)默克公司產(chǎn)品,批號(hào)62229-50-9;免疫組織化學(xué)染色試劑盒,上海一基實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品,批號(hào)YJ1012608;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒,武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司產(chǎn)品,批號(hào)PKSM041180;兔抗大鼠CD31、p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、磷酸化p38 MAPK(phospho-p38 MAPK, p-p38 MAPK)、ERK1/2、磷酸化ERK1/2(phospho-ERK1/2,p-ERK1/2)一抗,均為美國(guó)艾博抗公司產(chǎn)品,批號(hào)依次為ab9498、ab221012、ab284564、ab176640。BX53M顯微鏡,日本奧林巴斯株式會(huì)社產(chǎn)品;680酶標(biāo)儀、GelDoc go凝膠成像分析系統(tǒng),均為美國(guó)伯樂公司產(chǎn)品;DYY-16D電泳儀,北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 模型的建立與分組

參照參考文獻(xiàn)[5],采用自體移植法建立子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型。取45只SD大鼠,術(shù)前2 d灌胃戊酸雌二醇0.5 μg/g使其統(tǒng)一處于發(fā)情期。腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,固定大鼠于手術(shù)臺(tái);下腹正中切口,分離左側(cè)子宮;結(jié)扎子宮兩端并切取中間一段子宮,置于無菌磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution,PBS)中,分離出子宮內(nèi)膜,迅速貼于右側(cè)內(nèi)腹壁,用可吸收線固定兩端;逐層縫合切口并關(guān)腹。術(shù)后將大鼠置于干凈鼠籠保溫至蘇醒,肌肉注射青霉素3萬(wàn)U/只預(yù)防感染,1次/d,持續(xù)3 d。隨機(jī)選擇10只大鼠設(shè)為假手術(shù)組,不切取子宮,不進(jìn)行子宮內(nèi)膜移植,其余操作同前。術(shù)后6周開腹,異位內(nèi)膜生長(zhǎng)為扁球體囊狀物,內(nèi)部充滿液體,表面可見清晰血管,即為造模成功。32只大鼠造模成功,隨機(jī)分為模型組11只、昆布多糖組11只、激動(dòng)劑組10只。采用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組大鼠異位病灶的長(zhǎng)、寬、高,計(jì)算異位病灶的體積,記為V前。體積測(cè)量完成后用青霉素粉撒于切口處預(yù)防感染,常規(guī)關(guān)腹。

1.4 干預(yù)方法

造模成功24 h后,參照參考文獻(xiàn)[6]對(duì)各組大鼠進(jìn)行干預(yù)。激動(dòng)劑組灌胃500 μg/g LA混懸液(生理鹽水配制),灌胃體積10 μL/g,2 h后尾靜脈注射10 ng/g EGF溶液;昆布多糖組灌胃500 μg/g LA混懸液,灌胃體積10 μL/g,1次/d;假手術(shù)組、模型組給予生理鹽水10 μL/g體質(zhì)量,1次/d。各組均連續(xù)干預(yù)7 d。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

末次干預(yù)后次日,腹腔注射戊巴比妥鈉,開腹,觀察異位內(nèi)膜生長(zhǎng)情況,測(cè)量體積并記為V后。測(cè)量后脫頸處死大鼠,腹腔注射生理鹽水3 mL,灌洗腹腔;收集灌洗液,以離心半徑8 cm、轉(zhuǎn)速2 000 r/min冰上離心10 min;收集上清液置于4 ℃保存用于ELISA實(shí)驗(yàn)。切取部分異位子宮內(nèi)膜組織(假手術(shù)組取在位子宮),分成2份。1份經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)40 g/L 聚甲醛固定24 h,梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片,進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色及蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色;1份在液氮中保存,用于蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)。

1.5.1 子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)抑制率

按以下公式計(jì)算子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)抑制率。子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)抑制率=(V前-V后)/V前×100%

1.5.2 異位子宮內(nèi)膜微血管密度

采用免疫組織化學(xué)染色法觀察。取異位子宮內(nèi)膜組織切片,常規(guī)脫蠟,PBS清洗,加入體積分?jǐn)?shù)30 mL/L過氧化氫溶液處理10 min,滴加抗原修復(fù)液微波修復(fù)抗原,待冷卻至40 ℃,加入體積分?jǐn)?shù)50 mL/L 胎牛血清封閉30 min,加入兔抗大鼠CD31一抗(1︰500),4 ℃孵育過夜,PBS清洗,加入二抗(1︰2 000),37 ℃孵育15 min,PBS清洗,加入DAB顯色液,蒸餾水沖洗,蘇木精復(fù)染,酒精脫水,二甲苯透明,滴入中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察。以單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞群為一個(gè)血管,高倍鏡下選擇5個(gè)不相鄰的血管密集區(qū)視野,記錄棕黃色CD31陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),以陽(yáng)性細(xì)胞占比(棕黃色細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%)代表微血管密度。

1.5.3 腹腔灌洗液VEGF水平

采用ELISA法檢測(cè)。取灌洗液上清液,用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm位置處吸光度(A)值。操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.4 異位子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)形態(tài)

取各組異位子宮內(nèi)膜組織,切片,常規(guī)脫蠟,HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)形態(tài)。

1.5.5 異位子宮內(nèi)膜組織p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)

采用蛋白印跡法檢測(cè)。取液氮保存的子宮內(nèi)膜組織,用眼科剪剪碎后研磨,加入PBS勻漿,注入RIPA裂解液,置于離心管內(nèi),以離心半徑10 cm、轉(zhuǎn)速9 000 r/min冰上離心12 min,采用二喹啉甲酸(BCA)法檢測(cè)蛋白質(zhì)水平。取50 μg待測(cè)蛋白,與3倍比例上樣緩沖液混合,100 ℃水浴變性,行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜,常溫下加入50 g/L脫脂牛奶封閉1 h,TBST洗膜,加入兔抗大鼠p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2一抗(1︰500),4 ℃搖床孵育過夜,TBST洗膜,加入二抗(1︰2 000),常溫孵育2 h,ECL顯色,暗室曝光,經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)掃描并分析,計(jì)算p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)抑制率對(duì)比

與模型組對(duì)比,昆布多糖組子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)抑制率升高,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與昆布多糖組對(duì)比,激動(dòng)劑組子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)抑制率降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)抑制率對(duì)比

2.2 各組子宮內(nèi)膜組織微血管密度對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比,模型組CD31陽(yáng)性細(xì)胞占比升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組對(duì)比,昆布多糖組陽(yáng)性細(xì)胞占比降低(P<0.05)。與昆布多糖組對(duì)比,激動(dòng)劑組陽(yáng)性細(xì)胞占比升高(P<0.05)。見表2、圖1。

注:箭頭所示為CD31陽(yáng)性細(xì)胞。

表2 各組子宮內(nèi)膜組織微血管密度對(duì)比

2.3 各組腹腔灌洗液VEGF水平對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比,模型組腹腔灌洗液VEGF水平升高(P<0.05)。與模型組對(duì)比,昆布多糖組腹腔灌洗液VEGF水平降低(P<0.05)。與昆布多糖組對(duì)比,激動(dòng)劑組腹腔灌洗液VEGF水平升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組腹腔灌洗液VEGF水平對(duì)比

2.4 各組子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)形態(tài)對(duì)比

假手術(shù)組子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、排列整齊,腺腔完整,腺體較多。模型組子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞細(xì)胞核體積增大、排列不規(guī)則,腺體細(xì)胞數(shù)量增加,大多上皮細(xì)胞出現(xiàn)核下空泡,部分可觀察到內(nèi)膜囊腔。與模型組對(duì)比,昆布多糖組、激動(dòng)劑組子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞排列較為整齊,腺體細(xì)胞數(shù)量減少,腺腔縮小。其中昆布多糖組子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)形態(tài)改善情況優(yōu)于激動(dòng)劑組。見圖2。

圖2 各組子宮內(nèi)膜組織病理變化(HE染色,×200)

2.5 子宮內(nèi)膜組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比,模型組子宮內(nèi)膜組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2升高(P<0.05)。與模型組對(duì)比,昆布多糖組子宮內(nèi)膜組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2降低(P<0.05)。與昆布多糖組對(duì)比,激動(dòng)劑組子宮內(nèi)膜組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2升高(P<0.05)。見表4、圖3。

圖3 子宮內(nèi)膜組織p38 MAPK、p-p38 MAPK/、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)

表4 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2對(duì)比

3 討 論

子宮內(nèi)膜異位癥是子宮內(nèi)膜組織轉(zhuǎn)移至非正常位置形成的慢性炎癥疾病,表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)侵襲至宮腔之外的部位及其他器官,形成異位結(jié)節(jié)并浸潤(rùn)生長(zhǎng)[7]。目前子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,通常認(rèn)為經(jīng)血逆流導(dǎo)致內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞種植于非正常位置而發(fā)展為異位病灶;并在雌激素的作用下,血管內(nèi)皮組織增殖能力提升,血管通透性增強(qiáng),引發(fā)血管異常增生,促進(jìn)異位病灶組織生長(zhǎng)[8]。鑒于雌激素對(duì)維持女性生理健康具有重要作用,尋找高效、低副作用抑制血管新生且不影響雌激素分泌的藥物對(duì)于抑制異位病灶發(fā)展、恢復(fù)患者生育能力意義重大。子宮內(nèi)膜異位癥屬于中醫(yī)學(xué)“痛經(jīng)”“癥瘕”“不孕”等范疇,病機(jī)主要為瘀血阻滯沖任胞宮,氣阻為癥,血結(jié)為瘕,氣血失和,腎虛血瘀,沖任不調(diào),胞宮受阻,進(jìn)而發(fā)病。治療宜以活血化瘀、補(bǔ)腎利水為主[9]。

CD31是一種血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子,參與血管壁構(gòu)成,可證明血管內(nèi)皮組織存在,反映微血管密度,因此常被作為標(biāo)記物評(píng)估微血管生成[10]。VEGF是直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)鍵刺激因子,其腹腔液含量與異位子宮內(nèi)膜組織血管新生能力呈正相關(guān)[11]。中藥昆布性寒,味咸,歸肝、胃、腎經(jīng),可消痰,利水[12]。LA是從昆布中分離出的天然活性物質(zhì),主要包括褐藻膠、褐藻淀粉及褐藻糖,可抗凝血,抗輻射,抗氧化,降低尿酸[13]。本研究結(jié)果顯示,與模型組對(duì)比,昆布多糖組子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)抑制率升高,CD31陽(yáng)性細(xì)胞占比、腹腔灌洗液VEGF水平降低,提示LA可抑制異位子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)及內(nèi)膜組織血管新生。

MAPK/ERK通路是將胞外刺激信號(hào)傳遞至細(xì)胞及其核內(nèi)的重要信號(hào)通路,廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi),在細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[14]。p38 MAPK、ERK是該通路重要調(diào)控蛋白,均屬于絲裂原活化蛋白激酶家族。p38 MAPK被上游激酶激活后,其殘基發(fā)生磷酸化,由胞漿轉(zhuǎn)移至胞核,促使相關(guān)炎癥因子基因轉(zhuǎn)錄,依次激活下游環(huán)節(jié),活化ERK1/2使之磷酸化,逐級(jí)磷酸活化下游酶蛋白,產(chǎn)生瀑布樣級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào),增強(qiáng)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移[15]。研究[16]認(rèn)為,激活ERK信號(hào)通路可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及血管新生,增加其微血管密度,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)展,提示ERK信號(hào)通路在血管新生中具有一定作用。本研究結(jié)果顯示,與假手術(shù)組對(duì)比,模型組子宮內(nèi)膜組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2升高,經(jīng)LA干預(yù)后均降低,且在LA基礎(chǔ)上增用ERK通路激動(dòng)劑EGF可減弱LA對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的治療作用,提示:MAPK/ERK信號(hào)通路在子宮內(nèi)膜異位癥中被異常激活,LZ可能通過抑制該通路對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥產(chǎn)生治療作用。

綜上所述,LA可抑制異位子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)及內(nèi)膜組織血管新生,從而治療大鼠子宮內(nèi)膜異位癥,抑制MAPK/ERK通路可能是其機(jī)制之一。