荔枝中丁蟲腈、丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈4種農(nóng)藥殘留的定量檢測方法

韋齡乾，潘喜芳，蔣揚(yáng)柏，黃全書，盧希源

（欽州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心 廣西欽州 535000）

丁蟲腈[1-4]對菜青蟲、小菜蛾、螟蟲、粘蟲、褐飛虱、葉甲等害蟲具有高活性，并有較好的防治效果，在水稻、蔬菜上的應(yīng)用空間巨大，發(fā)展?jié)摿V闊，目前只發(fā)現(xiàn)有在大米和油菜中的農(nóng)殘檢測方法。

丁香菌酯對瓜果、蔬菜、果樹的霜霉病、晚疫病、黑星病、炭疽病、葉霉病有效，同時對輪紋病、棉花枯萎病、水稻瘟疫病、紋枯病及小麥根腐病、玉米小斑病亦有效，目前未發(fā)現(xiàn)有在農(nóng)作物上的農(nóng)殘檢測方法。

氯啶菌酯是一種高效、廣譜、低毒殺菌劑，具有預(yù)防及治療作用；其殺菌譜廣、活性高、對非標(biāo)生物及環(huán)境相容性好、持效期長、對作物安全等。目前未發(fā)現(xiàn)有在農(nóng)作物上的農(nóng)殘檢測方法。

乙唑螨腈[5]可有效防治螨卵、幼螨、若螨、成螨，因此發(fā)展?jié)摿V闊，目前只發(fā)現(xiàn)此種農(nóng)藥在枸杞中的農(nóng)殘檢測方法。

以上4 種農(nóng)藥均是由我國自主開發(fā)研制的農(nóng)藥，并且已獲得中國專利和PCT 專利，發(fā)展?jié)摿V闊，具有良好的商品化開發(fā)前景和競爭優(yōu)勢，但是目前缺少這4 種農(nóng)藥在蔬菜、水果上的殘留檢測方法。因此，研究丁蟲腈、丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈的農(nóng)殘檢測方法具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)樣品：荔枝（來源于欽州市一荔枝生產(chǎn)綠色防控試驗(yàn)基地），此處荔枝不噴施任何農(nóng)藥。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：丁蟲腈［來源于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所（天津）］，丁香菌酯（來源于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司），氯啶菌酯（來源于德國Dr.Ehrenstorfer公司），乙唑螨腈（來源于北京曼哈格生物科技有限公司）。

其他試劑：乙腈（HPLC，Tedia Company），甲醇（HPLC，Tedia Company），乙酸銨(LC-MS 級，CNW Technologies)，無水甲酸（LC-MS級，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司），超純水（Millipore 超純水機(jī)制備），微孔濾膜（0.22 μm，Agela Technologies）。Quechers 提取包（品牌：艾吉爾。內(nèi)含4 g 無水硫酸鎂，1 g氯化鈉，0.5 g檸檬酸氫二鈉，1 g檸檬酸鈉）；提取柱（品牌：艾吉爾）。

1.2 主要儀器設(shè)備

液相色譜儀串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜(型號：LCMS-8040，島津SHIMADZU公司)，臺式高速離心機(jī)（Sigma 3K15曦瑪離心機(jī)有限公司），臺式微量離心機(jī)(賽默飛世爾科技公司)，電子天平（型號：JJ1000，精確度0.001 g，美國雙杰兄弟有限公司常熟雙杰測試儀器廠），多管渦漩混合儀（AS-02040-00，杭州奧盛儀器有限公司），振蕩器（Ika VXR Basic，德國IKA），移液槍（賽默飛世爾科技公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

目前我國常用的檢測蔬菜、水果中的農(nóng)藥殘留方法包括國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20769—2008，NY/T 761—2008、GB/T 23200—113、GB/T 23200—121等，常用的前處理方法有勻漿萃取法、Quechers 處理法[6-9]，定量檢測儀器常用色相、液相色譜儀，氣相液相串聯(lián)質(zhì)譜儀。勻漿萃取法前處理操作繁瑣，費(fèi)時費(fèi)力，成本高，不適合大批量樣品的快速定性及定量分析，而Quechers 方法是一種快速、簡單、廉價、高效、耐用、安全的樣品前處理方法，近年來已廣泛用于食品中農(nóng)藥殘留量的檢測。因此，本文選擇應(yīng)用Quechers方法-超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜儀同時檢測蔬菜水果上丁蟲腈、丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈農(nóng)藥殘留量。

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

用丁蟲腈、丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以乙腈為溶劑，配制成濃度為10 u g/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-14 ℃避光冷藏儲存?zhèn)溆?，以便作為?biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制和添加回收用。本次實(shí)驗(yàn)曲線標(biāo)點(diǎn)配置0.02、0.04、0.08、0.12、0.24、0.48 u g/mL 等6 個濃度梯度，為檢驗(yàn)是否受基質(zhì)效應(yīng)影響，應(yīng)用2種不同溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，一是用乙腈作為溶劑配制（溶劑標(biāo)），二是用樣品前處理后得到的空白基質(zhì)溶液配制（基質(zhì)標(biāo)），最后比較2 種情況下標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍、相關(guān)系數(shù)以及2 條標(biāo)準(zhǔn)曲線定量準(zhǔn)確性。

1.3.2 樣品前處理

提?。簻?zhǔn)確稱取10.00 g荔枝（勻漿狀）樣品放入50 mL離心管，準(zhǔn)確加入10.00 mL乙腈及提取包粉末，并加入一顆陶瓷均質(zhì)子，于振蕩器劇烈振蕩（2 min以上）后，置于5 000 r/min的離心機(jī)中離心5 min。

凈化：準(zhǔn)確吸取1 mL 上清液置于內(nèi)含除水劑和凈化材料的提取柱中（每1 mL提取液使用150 mg無水硫酸鎂，25 mg 乙二胺-N-丙基硅烷），漩渦混勻1 min，5 000 r/min 離心5 min。將上清液通過0.22 μ m微孔濾膜過濾，供LC-MS/MS分析。

1.3.3 添加回收試驗(yàn)

本文以荔枝為基質(zhì)，做6個梯度濃度的添加，每個濃度梯度做2個重復(fù)，具體如下：

采集4 kg荔枝樣品，去核后用攪拌機(jī)搗碎至勻漿狀態(tài)，準(zhǔn)確稱取13 個（10±0.05 g）荔枝樣品（勻漿狀）于50 mL 離心管中，一個做空白樣CK，其余12個樣品做質(zhì)控樣品，分別制作0.02、0.04、0.08、0.12、0.24、0.48 mg/kg 6 個濃度的添加回收，編號分別為A、B、C、D、E、F，其中每個添加濃度做2個平行。質(zhì)控樣添加完成后靜置30 min，待樣品充分吸收標(biāo)液后，按照樣品前處理（1.3.2）步驟準(zhǔn)確操作。將此步驟所得的樣品移到液相色譜儀串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜上進(jìn)行檢測，每個樣品進(jìn)樣2次，最后用基質(zhì)標(biāo)液曲線和溶劑標(biāo)液曲線分別定量（外標(biāo)法）。

1.3.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：SHIMADZU C18柱子，譜柱（Φ1.9 μ m，2.1 mm×100 mm）；柱溫為常溫；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量1 μ L；流動相A 為0.5 mmol/L 醋酸銨+0.01%甲酸水溶液，流動相B為甲醇；洗脫方式，有機(jī)相初始濃度為20%，5 min有機(jī)相濃度為50%，24～26 min設(shè)置95%（詳見表1）。

表1 液相色譜中流動相洗脫梯度條件

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子化模式（ESI）；掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子源接口電壓，ESI+為+4.5 kV；ESI-為-3.5 kV；霧化氣為氮?dú)猓? L/min；干燥氣為氮?dú)?5 L/min；碰撞氣為氬氣；DL管溫度為250 ℃；加熱模塊溫度為400 ℃；

對4 種農(nóng)藥單標(biāo)溶液進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，確定特征母離子和子離子，優(yōu)化后的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)見表2。圖1 為丁蟲腈、丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈TIC離子流圖，從圖像上可看出0.02 u g/mL濃度下丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈相應(yīng)強(qiáng)度均在3萬以上，氯啶菌酯高達(dá)6萬以上，4種農(nóng)藥在在圖譜中基線平穩(wěn)，雜峰少，峰型呈正態(tài)分布，半峰寬正常。雖然丁蟲腈響應(yīng)值不到1萬，但從響應(yīng)值和重現(xiàn)性高等方面看，并不影響定量準(zhǔn)確。

圖1 丁蟲腈、氯啶菌酯、丁香菌酯、乙唑螨腈濃度為0.02 u g/mL TIC離子流圖

表2 丁蟲腈、氯啶菌酯、丁香菌酯、乙唑螨腈4種農(nóng)藥優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的選擇

在農(nóng)藥殘留分析中，常用提取溶劑有乙腈、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷等。本文以荔枝（勻漿狀）樣品為研究對象，考察了4 種提取劑對4 種農(nóng)藥的提取效果。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：丙酮提取時的分層效果不明顯，鹽析效果不如乙腈；二氯甲烷提取雜質(zhì)較多，且溶劑極易揮發(fā)；乙酸乙酯的回收率雖能滿足要求，但與乙腈相比雜質(zhì)較多，干擾更大；而乙腈的提取效率高，在去除糖分雜質(zhì)方面效果較好。綜合考慮，本文選擇乙腈作為提取溶劑最為合適。

2.2 凈化條件的選擇

農(nóng)殘檢測中常用的固體吸附劑有C18、GCB（石墨化碳黑）和PSA（N-丙基乙二胺）。C18主要用于吸附油脂等弱極性雜質(zhì)。GCB 雖適用于去除蔬菜中的色素等干擾，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)待測物損失較多。PSA 能有效去除各種有機(jī)酸、色素、脂肪等物質(zhì)的干擾，可獲得良好回收效果。從節(jié)約成本、提高凈化效果的角度綜合考慮，本文采用PSA 做吸附劑。

2.3 質(zhì)標(biāo)和溶劑標(biāo)兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

本實(shí)驗(yàn)通過準(zhǔn)確配制0.01、0.02、0.04、0.08、0.12、0.24 u g/mL 和0.48 u g/mL 的丁蟲腈、丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈混合溶劑標(biāo)夜和基質(zhì)標(biāo)液，每個濃度梯度連續(xù)重復(fù)測定6次，測試其相關(guān)系數(shù)、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，在0.01 u g/mL濃度下，4種農(nóng)藥的重現(xiàn)性不好，因此檢出限0.01 u g/mL，在0.02～0.48 u g/mL 線性范圍下，4 種農(nóng)藥的溶劑標(biāo)和基質(zhì)標(biāo)線性方程相差不大，溶劑標(biāo)相關(guān)系數(shù)R2≥0.999 41，基質(zhì)標(biāo)相關(guān)系數(shù)R2≥0.999 38（見表3）?；|(zhì)標(biāo)工作曲線如圖2—圖5。

圖2 丁蟲腈工作曲線

圖3 丁香菌酯工作曲線

圖4 氯啶菌酯工作曲線

圖5 乙唑螨腈工作曲線

表3 4種農(nóng)藥的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)（n=6）

2.4 基質(zhì)效應(yīng)探索

使用標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20769—2008、NY/T 761—2008、GB/T 23200—113、GB/T 23200—121 規(guī)定的檢測方法，甲胺磷、氧樂果等非極性農(nóng)藥會出現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)，為了探索基質(zhì)效應(yīng)影響，本文使用樣品前處理中空白樣品所得的溶液配置基質(zhì)標(biāo)液，并與溶劑（乙腈）標(biāo)的精確度、樣品添加回收率進(jìn)行對比，以此來判斷基質(zhì)效應(yīng)的影響，消除誤差。

從表4、表5可以看出，2種定量方式中，不管是哪個濃度的添加，結(jié)果平行度相當(dāng)可觀，且結(jié)果接近理論添加值，另外，在0.02 mg/kg的添加濃度上，4種農(nóng)藥的回收率均接近100%，足以證明此檢測方法精密度相當(dāng)高。

表4 13個荔枝樣品的檢測結(jié)果（溶劑標(biāo)定量）

表5 13個荔枝樣品的檢測結(jié)果（基質(zhì)標(biāo)定量）

從回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差來看，如表6顯示：2種定量方式中，不管在哪個添加濃度水平下，4種農(nóng)藥都保持著較好的回收率，回收率基本維持在86%～105%之間，完全符合農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)中回收率在70%～120%的要求。從標(biāo)準(zhǔn)偏差來看，溶劑標(biāo)定量RSD在1.4%～1.9%，而基質(zhì)標(biāo)定量RSD在2.4%～2.9%，2種方式定量精密度都相當(dāng)高。另一方面，這4種農(nóng)藥在0.02 mg/kg 的添加濃度上都具有較好的回收率，說明這4種農(nóng)藥的定量檢出下限值≤0.02 mg/kg。

表6 4種農(nóng)藥在添加濃度為0.02～0.48 mg/kg下的平均回收率（n=6）

3 結(jié)論與討論

本文采用Quechers前處理法，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，建立了荔枝中丁蟲腈、丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈農(nóng)藥殘留的檢測方法。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，線性方程、線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)偏差、添加回收率、檢出限量、平行程度、基質(zhì)效應(yīng)等都達(dá)到了較高水平，符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，且該方法前處理簡單、方便快速，具有良好的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，因此是科學(xué)有效、可以推廣的。鑒于丁蟲腈、丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈作為我國自主研發(fā)的農(nóng)藥在國內(nèi)外都已經(jīng)注冊了相關(guān)專利，從目前調(diào)查研究和實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，此4 種農(nóng)藥必將在蔬菜、水果、水稻、棉花等重要農(nóng)作物上得到大力推廣使用，因此，本文具有非常重要的意義，可為其他蔬菜、水果等農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留檢測提供依據(jù)。