基于EST-SSR標記的金線蓮葉色突變體分子身份分析

樊榮輝 陳藝荃 鐘淮欽 葉秀仙

摘要要：【目的】為金線蓮（Anoectochilus roxburghii）從DNA分子水平上探索葉色突變體的遺傳差異?！痉椒ā坎捎肊ST-SSR分子標記技術對金線蓮及其2個葉色突變體進行分子鑒定?！窘Y果】20對SSR引物共擴增出78條譜帶，其中3對引物（JXL-6、JXL-14和JXL-16）能穩(wěn)定擴增出差異條帶，多態(tài)性條帶9條，多態(tài)性比率11.54％。【結論】獲得的2個葉色突變體為金線蓮突變體，葉色突變體與親本在DNA分子水平差異較小。

關鍵詞：金線蓮；自然突變；分子標記鑒定；SSR

中圖分類號：S567.239 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號：2095-5774（2023）04-0281-05

Identification of Molecular ID of Leaf Color Mutants in Anoectochilus roxburghii

by EST-SSR Molecular Markers

Fan Ronghui1，Chen Yiquan2，Zhong Huaiqin1*，Ye Xiuxian1*

（1Institute of Crop Sciences，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Science/Fujian Engineering Research Center for Characteristic Floriculture，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350013，China；

2 Institute of Agricultural Engineering Technology ，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Science，F(xiàn)uzhou ，F(xiàn)ujian 350003，China）

Abstract：【Objective】 This study aimed to explore genetic differences of leaf color mutants of Anoectochilus roxburghii at the DNA level. 【Method】 Molecular identification of Anoectochilus roxburghii and its two leaf color mutants was conducted by EST-SSR molecular markers. 【Result】 The results showed that 20 pairs of SSR primers produced 78 bands，3 pairs of primers （JXL-6，JXL-14 and JXL-16） could stably amplify differential bands. Nine bands were polymorphic produced in 20 pairs of SSR primers and polymorphism ratio was 11.54%. 【Conclusion】 Two leaf color mutants were identified as mutants of Anoectochilus roxburghii. However，there were small differences between mutants and parents at DNA molecular level.

Key word： Anoectochilus roxburghii；Natural mutation；Molecular marker identification；SSR

突變體，與傳統(tǒng)雜交后代相比，具有變異性狀多樣化、能穩(wěn)定遺傳品種現(xiàn)有優(yōu)良性狀、選育簡便快捷等優(yōu)勢，在育種中占有非常重要的地位。因此，突變是豐富種質庫的重要途徑，也是新品種選育的有效途徑。

因環(huán)境因素引起的飾變產生的表觀遺傳同樣會影響本種的表型，為明晰所獲得的突變材料是否為DNA遺傳變異引起，除了進行表型穩(wěn)定性觀測外，還有必要進行遺傳鑒定。DNA分子標記技術是以基因組核苷酸的多態(tài)性為基礎，在分子水平上直接反映遺傳變異的標記，具有準確度高、不受環(huán)境影響且能早期快速鑒定等優(yōu)點，廣泛用于作物分子輔助育種、遺傳多樣性分析和品種鑒定等方面［1-4］。目前常用的DNA標記技術有SRAP、RAPD、ISSR、RFLP、AFLP和SSR等［5-8］。SSR是一類由幾個核苷酸（一般為1～6個）為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯(lián)重復序列。根據(jù)來源不同，SSR分為基因組SSR和植物表達序列標簽SSR（ expressed sequence tags SSR，EST-SSR）。EST- SSR標記是基于表達序列標簽開發(fā)微衛(wèi)星的一種新型分子標記，因此除了具有基因組SSR的共顯性遺傳、多態(tài)性強、分布隨機等優(yōu)點外，還具有通用性和保守性更強的優(yōu)點［9］。EST- SSR已廣泛用于南瓜（Cucurbita moschata）［10］、鐵皮石斛（Dendrobium officinale）［11］等多種作物的品種鑒定和遺傳多樣性分析。

金線蓮（Anoectochilus roxburghii），又名金線蘭、金線草等，為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，主要分布在福建、浙江、云南和臺灣等地區(qū)［12］。具清熱解毒、消炎止痛等功效，是中國傳統(tǒng)的珍貴藥材［13］。金線蓮以組培快繁作為主要繁殖方式，在組培快繁過程中較易產生自然突變，本團隊在組培過程中獲得2個金線蓮葉色突變體，具有一定的觀賞價值。本研究采用SSR技術對2個葉色突變體進行鑒定，以確定遺傳變異的影響因素，并從分子水平上對金線蓮新品種選育提供科學依據(jù)和參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

金線蓮母株（J-1）在組培快繁過程中自然突變一株中間金黃色葉色突變體（J-2），中間金黃色葉色突變體（J-2）在組培快繁過程中又自然突變出全金黃色葉色突變體（J-3）（圖1）。3個樣品在組培瓶中培養(yǎng)3個月，取葉片，液氮速凍，-80℃保存。

1.2基因組DNA提取

金線蓮DNA的提取采用CTAB法，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度，分光光度計檢測DNA濃度，樣品濃度調至50 ng/μL，備用。

1.3 SSR 鑒定

使用20對SSR引物對金線蓮3個樣品進行擴增，引物名稱分別為JXL-1至JXL-20。所用引物為轉錄組測序結果中篩選的SSR引物，轉錄組原始數(shù)據(jù)已上傳NCBI（NCBI SRA accession PRJNA594793）。PCR反應體系（25 μL）： 10 × PCR buffer 2.5 μL，2.5 M dNTP 2 μL，Taq DNA 聚合酶0.15 μL，10 mM上游引物1 μL，10mM下游引物1 μL，50 ng/μL DNA 1 μL，ddH2O

17.35 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s、51 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產物用2.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，適合的擴增產物進一步在全自動核酸蛋白分析儀（ LabChip GX Touch 24，美國 PerkinElmer 公司） 上檢測。

2結果與分析

采用20對SSR引物對金線蓮母株及2個葉色突變體基因組進行PCR擴增，共擴增出78條譜帶，有3對引物（JXL-6、JXL-14和JXL-16）擴增出明亮、清晰、穩(wěn)定且有差異的條帶，用于葉色突變體的鑒定分析，其多態(tài)性條帶數(shù)9條，多態(tài)性比率11.54％（表1，圖2）。

結果顯示，中間金黃色葉色突變體（J-2）與金線蓮母株（J-1）的擴增條帶相似度很高，只有引物JXL-6和JXL-14能穩(wěn)定擴增出差異條帶，并且多態(tài)性條帶數(shù)少，表明兩者在 DNA 分子水平存在較小程度的差異，遺傳背景高度相似，也進一步表明中間金黃色葉色突變體（J-2）可能為金線蓮母株（J-1）的自然突變體。全金黃色葉色突變體（J-3）是從中間金黃色葉色突變體（J-2）中再次突變而來，分子標記擴增條帶表明，二者相似度較高，全金黃色葉色突變體（J-3）與金線蓮母株（J-2）相似度稍降低，引物JXL-6、JXL-14和JXL-16均能穩(wěn)定擴增出差異條帶，且多態(tài)性條帶數(shù)目稍多，在 DNA 分子水平上也存在較大差異。聚類分析表明，中間金黃色葉色突變體（J-2）和金線蓮母株（J-1）親緣關系最近，聚為一類，全金黃色葉色突變體（J-3）遺傳距離稍遠。

3討論

目前，DNA分子標記技術已成為鑒定作物親本與后代遺傳差異的一種快速、有效和準確的方法。SSR分子標記具有重復性、通用性和穩(wěn)定性好等優(yōu)點，在后代鑒定中具有很大優(yōu)勢，已在多種植物中廣泛應用［14，15］。

李小孟等（2016）利用SSR引物SS15和TAA27將芽變的真龍柚從沙田柚中鑒別出來，初步確定真龍柚是由沙田柚遺傳物質改變產生的［16］。馮濤等（2017）應用SSR分子標記對小白桃及其早熟芽變品種津柳早紅基因組DNA進行特異性擴增，找到了UDP96-008、CPPCT 022、BPPCT 028、 UDP98-411、UDP96-99 等5個多態(tài)性標記［17］。胡冬梅等（2021）利用SSR技術成功鑒定了溫州蜜柑的芽變材料及其親本［18］。本研究采用SSR標記技術對金線蓮母株及2個葉色突變體進行分析，結果表明，中間金黃色葉色突變體與金線蓮母株在DNA分子水平上差異很小，遺傳背景和親緣關系更近，可能為金線蓮母株的突變體。全金黃色葉色突變體與中間金黃色葉色突變體遺傳距離更近，而與金線蓮母株相比，遺傳距離較遠，可能由于全金黃色葉色突變體是從黃綠相間的中間金黃色突變體中再次突變而來，這與其性狀表現(xiàn)高度一致。本研究利用全自動核酸蛋白分析儀進行分析，與傳統(tǒng)的聚丙烯酰氨凝膠電泳法相比，具有譜帶大小準確，靈敏度高和用量小等優(yōu)點，能更加準確顯示遺傳差異性。

余周源對小麥39個突變體進行聚類分析，性狀相近突變體聚在同一簇下，性狀不相近突變體遺傳距離稍遠［19］。本研究對金線蓮母株及2個葉色突變體進行聚類分析，中間金黃色葉色突變體和金線蓮母株親緣關系最近，全金黃色葉色突變體（J-3）遺傳距離稍遠。此外，本研究為后續(xù)相關基因的挖掘，揭示葉色突變機制提供了科學依據(jù)。

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（責任編輯：馮新）