夏天無調控成纖維細胞活性改善坐骨神經(jīng)痛的研究

黃善敏 鄭雪花 鄭士瑞 錢長暉（1.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院 福州 3501；.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院 福州 3501）

夏天無為罌粟科植物伏生紫堇的干燥塊莖，具有活血通絡、消炎鎮(zhèn)痛的功效［1］，在臨床上治療坐骨神經(jīng)痛［2-4］，但其具體作用機制并未明確。

前期研究發(fā)現(xiàn)夏天無能減輕坐骨神經(jīng)痛模型SD 大鼠疼痛，減少神經(jīng)腫脹程度，改善受損神經(jīng)區(qū)域微環(huán)境，減少巨噬細胞的應答和膠原纖維數(shù)量［5-6］，但夏天無對成纖維細胞的應答調控作用卻未加以研究。由于成纖維細胞是周圍神經(jīng)微環(huán)境中重要的結締組織性質細胞，激活的成纖維細胞能夠轉化成肌成纖維細胞，增強合成和分泌膠原纖維功能［7-8］。同時，成纖維細胞能夠分泌促炎或抗炎因子。這些綜合因素促使成纖維細胞成為受損神經(jīng)微環(huán)境重構的重要參與者，其在神經(jīng)損傷和修復的進程中起到重要作用［9-10］。因此，本研究通過體內外實驗，研究夏天無對成纖維細胞活性的調控作用，以進一步探討夏天無改善坐骨神經(jīng)痛的機制。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物及細胞株

清潔級的SD雌性大鼠40只，體質量200～220 g，由福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號為SCXK（閩）2012-0001，所有操作以盡可能減少對動物的損害為標準。NIH-3T3 小鼠胚胎成纖維細胞株，購自武漢普諾賽生命科技有限公司，批號為CL-0171，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2 主要試劑

夏天無注射液（江西天施康中藥股份有限公司，批號Z36020694）；脂多糖（Solarbio，批號L8880-10mg）；胰酶（上海李記生物科技有限公司，批號AC15L811）；兔抗α-SMA 單克隆抗體（美國CST，批號19245T）；兔抗collagen l 單克隆抗體（英國Abcam，批號ab138492）；兔抗vimentin 單克隆抗體（英國Abcam，批號ab92547）；兔抗β-Actin多克隆抗體（英國Abcam，批號ab8227）；鼠抗TNF-α 單克隆抗體（美國Santa cruz，批號sc-52746）；鼠抗IL-10 單克隆抗體（美國Santa cruz，批號sc-365858）；Alexa 488 熒光標記二抗（英國Abcam，批號ab150117）；Alexa 568 熒光標記二抗（英國Abcam，批號ab175701）；防熒光淬滅劑（美國Vector labs，批號H-1200-10）。

1.3 主要儀器

Leica CM 1950 恒溫箱冰凍切片機（德國Leica公司）；熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）；紫外凝膠成像儀（美國Bio-rad 公司）；酶標儀（瑞士Tecan公司）；臺式高速冷凍離心機（美國Thermo 公司）；Von Frey 測痛纖絲（美國 North coast 公司）；熱刺痛儀（中國正華公司）。

2 方法

2.1 動物實驗

2.1.1 造模、分組以及給藥 實驗動物經(jīng)腹腔注射烏拉坦5 mL/kg 進行麻醉，暴露左側后肢皮膚，在左側后肢股骨近中段做斜向切口，鈍性分離肌肉后暴露坐骨神經(jīng)，建立坐骨神經(jīng)痛模型［5］。術后大鼠分籠單獨飼養(yǎng)。造模成功后，大鼠隨機分為模型7 d 組、模型28 d 組、夏天無7 d 組和夏天無28 d 組，每組8 只；另取8 只大鼠作為假手術組，僅暴露坐骨神經(jīng)，不做其它處理。夏天無7 d 組和夏天無28 d 組術后腹腔注射夏天無注射液，分別于術后7 d 和28 d 取材。模型7 d 組、模型28 d組和假手術組，術后均以0.9%生理鹽水進行注射。假手術組、模型7 d 組于術后7 d 時取材，模型28 d組于術后28 d 時取材。給藥劑量、次數(shù)為每組每只動物注射0.2 mL，1 次/2 d。

2.1.2 Von Frey 針刺實驗 采用 Von Frey 纖維絲測定大鼠雙側后爪縮爪閾值變化。將大鼠放置于底部為細鋼絲網(wǎng)格的籠中30 min，待其適應環(huán)境后，采用不同規(guī)格的 Von Frey 絲垂直刺激大鼠的后足掌部，使 Von Frey 絲彎曲，并保持6～8 s，觀察并記錄大鼠的反應。

2.1.3 熱敏實驗 采用局部熱刺痛測定大鼠足底的熱敏痛閾值變化。采用大鼠熱刺痛儀，溫度設定為55 ℃，將熱刺痛源放置于大鼠的后肢腳掌部，當大鼠出現(xiàn)縮足或舔足反應時開始記錄。每只大鼠每只腳掌照射3 次，取3 次測定值的平均數(shù)為測定結果，為防止大鼠燙傷，上限時間設置為40 s。

2.1.4 切片制備 每組動物在各時間結束點時，均以腹腔注射烏拉坦5 mL/kg 劑量進行麻醉，用4%多聚甲醛灌注固定24 h 后，截取大鼠的左側坐骨神經(jīng)損傷段（長度約為1 cm）。神經(jīng)組織經(jīng)蔗糖溶液梯度脫水后，利用冰凍切片機進行冰凍切片，坐骨神經(jīng)行縱切，厚度為12 μm。

2.1.5 免疫熒光染色 為了觀察坐骨神經(jīng)損傷區(qū)域微環(huán)境的成纖維細胞應答情況，取坐骨神經(jīng)切片進行免疫熒光染色。切片經(jīng)PBST 清洗，1% Triton破膜1 h，5%牛血清蛋白（BSA）封閉 30 min，然后分別用 1% BSA 稀釋的抗vimentin、α-SMA、collagen 1 的一抗4℃孵育過夜，繼而加入相應熒光二抗室溫孵育2 h，使用含DAPI 的防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照分析。

2.2 細胞實驗

2.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 細胞使用含有10%小牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞，分為對照組、LPS 組、夏天無+LPS 組、夏天無組。LPS 組及夏天無+LPS 組分別加以1 μg/mL 的LPS 誘導24 h建立損傷模型。夏天無注射液安瓿瓶在超凈臺內經(jīng)紫外照射后，用注射針吸出放置于5 mL 離心管中備用，實驗時用無菌的完全培養(yǎng)基進行相應稀釋后用于后續(xù)細胞學實驗。

2.2.2 CCK-8 法測細胞活力 將各組細胞接種入96孔板中，每孔細胞數(shù)量為5×103個。待細胞貼壁后，LPS 組和夏天無+LPS 組分別加入LPS（1 μg/mL），在37 ℃下孵育24 h。隨后將夏天無（0.5 μL/mL）分別加入到夏天無+LPS 組、夏天無組中，孵育4 h。再向每個孔中添加10 μL 的CCK-8 溶液，并在37 ℃下避光孵育1 h。使用酶標儀檢測其在450 nm 處的OD值，并進行相關計算。

2.2.3 免疫熒光染色 24 孔板的每孔底部鋪設細胞爬片，隨后將細胞接種于板中，每孔細胞數(shù)量為2×104個，待細胞貼壁后用LPS（1 μg/mL）分別刺激LPS 組和夏天無+LPS 組24 h，隨后分別加入夏天無（0.5 μL/mL）干預夏天無+LPS 組和夏天無組4 h，用PBS 潤洗，4%多聚甲醛固定30 min，1%Triton X-100 中破膜30 min，5% BSA 封閉1 h。然后用相關一抗在4℃下孵育過夜，繼而用相應熒光二抗室溫孵育2 h。最后用含DAPI 的防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察及拍照。

2.2.4 Western Blot 采用免疫印跡法檢測細胞中vimentin、α-SMA 的蛋白表達情況。收集干預完成后的每組細胞，分別加入配有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液冰上裂解30 min，高速離心20 min后，提取細胞裂解物，定量后加入蛋白上樣緩沖液。SDS-PAGE 電泳后，PVDF 轉膜，再用5% BSA 封閉1 h，加以相關的一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，最后用化學發(fā)光法顯色。

2.2.5 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 采用ELISA 法檢測成纖維細胞培養(yǎng)上清液的炎癥因子TNF-α 和IL-10，以及膠原蛋白collagen 1 的分泌情況。成纖維細胞經(jīng)LPS 和夏天無干預后，收集細胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)試劑盒說明書操作，分別檢測各成分的分泌情況。在反應結束時，用酶標儀檢測其在450 nm波長的吸光度OD 值。

2.3 統(tǒng)計學方法

采用Image-Pro Plus 6.0 進行熒光平均光密度值分析和免疫印跡條帶分析，SPSS 23.0 統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以平均值±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 夏天無減輕坐骨神經(jīng)痛模型大鼠機械痛和熱痛敏感程度，改善坐骨神經(jīng)痛

神經(jīng)損傷導致動物疼痛閾值降低，模型組疼痛閾值降低較明顯。夏天無上調疼痛閾值，減輕機械痛和熱痛敏感程度，在一定程度上改善坐骨神經(jīng)痛。2 組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 夏天無對坐骨神經(jīng)痛模型大鼠疼痛閾值的影響

3.2 夏天無減少神經(jīng)受損區(qū)域的成纖維細胞標志物vimentin 蛋白表達

免疫熒光染色結果發(fā)現(xiàn)在受損神經(jīng)纖維內部或神經(jīng)外膜區(qū)域，假手術組的成纖維細胞分布較少。模型組的成纖維細胞數(shù)量明顯增加，成纖維細胞標志物vimentin 波形蛋白表達增強。與同時間點的模型組比較，夏天無組的成纖維細胞數(shù)量明顯減少（P＜0.05）。Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)與同時間點的模型組比較，夏天無組的vimentin 蛋白表達減少（P＜0.05）。以上結果說明夏天無減少成纖維細胞在受損神經(jīng)損傷區(qū)域的浸潤。見圖2。

圖2 夏天無對坐骨神經(jīng)受損區(qū)域的成纖維細胞標志物vimentin蛋白表達的影響

3.3 夏天無減少神經(jīng)受損區(qū)域的成纖維細胞collagen 1 和α-SMA 蛋白表達

周圍神經(jīng)損傷后，成纖維細胞激活，分泌膠原蛋白collagen 1 等成分，參與組織損傷修復過程。研究發(fā)現(xiàn)假手術組的collagen 1 蛋白表達較少，模型組在損傷區(qū)的collagen 1 蛋白表達增加。與同時間點的模型組比較，夏天無組的collagen 1 蛋白表達明顯減少（P＜0.05），見圖3A、3B。肌成纖維細胞通常被認為是成纖維細胞激活狀態(tài)，它能夠產生更多的纖維成分，引起膠原瘢痕等從而阻礙微環(huán)境改善［11］。實驗檢測發(fā)現(xiàn)假手術組的肌成纖維細胞標志物α-SMA 蛋白表達較少，模型組在損傷區(qū)的α-SMA 蛋白表達增加。與同時間點的模型組比較，夏天無組α-SMA 蛋白表達明顯減少（P＜0.05），見圖3C、3D。以上結果說明夏天無減少成纖維細胞在損傷區(qū)的激活，減少膠原纖維在受損區(qū)域的蓄積，可能有利于受損神經(jīng)微環(huán)境的恢復。

圖3 夏天無對坐骨神經(jīng)受損區(qū)域的collagen 1或α-SMA蛋白表達的影響

3.4 夏天無上調LPS 誘導損傷后的NIH-3T3 小鼠胚胎成纖維細胞的活力

體外實驗中培養(yǎng)的成纖維細胞活力分析用CCK-8 檢測。分別觀察不同夏天無濃度在有無LPS刺激下對NIH-3T3 小鼠胚胎成纖維細胞的作用（0.25，0.5，1 μL/mL），并分析細胞孵育后的相對活力（以24 h 未處理的細胞活力設為100%）。結果顯示在沒有LPS 刺激時，不同濃度的夏天無處理后的成纖維細胞活力變化不明顯，說明夏天無對NIH-3T3 成纖維細胞無細胞毒性作用。當LPS 刺激后，成纖維細胞活力明顯降低。添加夏天無干預后，細胞活力增強，特別是0.5 μL/mL 濃度組表現(xiàn)相對明顯（P＜0.05）。因此，在實驗期間以0.5 μL/mL 夏天無濃度作為檢測所需濃度。見圖4。

圖4 CCK-8法顯示夏天無對LPS誘導后成纖維細胞活力的影響

3.5 夏天無抑制LPS 誘導損傷后的成纖維細胞激活和膠原蛋白分泌

通過檢測成纖維細胞標記物（vimentin）和肌成纖維細胞標記物（α-SMA）的表達，以及collagen 1 蛋白分泌情況，分析夏天無干預對LPS誘導的成纖維細胞活性的影響。免疫熒光染色顯示在LPS 組的vimentin 和α-SMA 蛋白表達增加明顯，但在夏天無+LPS 組中有所減少（P＜0.05），見圖5A-D。Western Blot 檢測結果與免疫熒光趨勢相符，與LPS 組相比，夏天無+LPS 組的vimentin和α-SMA 蛋白表達減少（P＜0.05），見圖5E。ELISA 檢測結果發(fā)現(xiàn)雖然膠原蛋白collagen 1 在LPS 組和夏天無+LPS 組的差異無統(tǒng)計學意義，但其表現(xiàn)出下降趨勢，見圖5F。以上結果說明夏天無可能減少LPS 誘導損傷后的成纖維細胞的激活和膠原蛋白分泌。

圖5 夏天無對LPS誘導損傷后的成纖維細胞激活狀態(tài)的影響

3.6 夏天無減少成纖維細胞促炎因子表達，增強抗炎因子表達

實驗研究發(fā)現(xiàn)LPS 刺激成纖維細胞損傷后，促炎因子TNF-α 的蛋白表達增加。但在夏天無+LPS 組TNF-α 的蛋白表達有所減少（P＜0.05），見圖6A、6B。同時，LPS 刺激細胞損傷后，抗炎因子IL-10 的蛋白表達減少。但在夏天無+LPS 組IL-10 的表達有所增加（P＜0.05），見圖6C、6D。ELISA 結果顯示相對于LPS 組，夏天無+LPS 組的細胞培養(yǎng)上清液中的促炎因子TNF-α 分泌量下調，抗炎因子IL-10 分泌量上調（P＜0.05），見圖6E、6F。以上結果說明夏天無減少LPS 誘導損傷細胞的促炎因子分泌、增加抗炎因子的分泌量，參與炎癥應答。

圖6 夏天無對LPS誘導損傷后的成纖維細胞炎癥因子分泌的影響

4 討論

坐骨神經(jīng)痛在中醫(yī)學上屬“痹證”“腰腿痛”范疇，通常由于經(jīng)絡不通、氣血瘀滯所引起，臨床上通常采用消炎鎮(zhèn)痛、活血化瘀治療坐骨神經(jīng)痛［12-13］。中藥夏天無具有活血通絡、行氣止痛的功效，前期研究已證實夏天無干預改善坐骨神經(jīng)痛大鼠的受損區(qū)域微環(huán)境，減輕坐骨神經(jīng)痛，減少受損神經(jīng)腫脹程度，減少受損區(qū)域的巨噬細胞浸潤［5-6］，但夏天無對成纖維細胞的影響仍未明確。

成纖維細胞是一類間充質細胞，參與組織穩(wěn)態(tài)和疾病，其被異常激活時，會導致纖維化疾?。?4-15］。有文獻表明神經(jīng)損傷和修復部位的疤痕是阻滯神經(jīng)愈合進程的主要因素，過度纖維化可影響神經(jīng)功能，引起神經(jīng)栓塞或壓迫，改變神經(jīng)周圍微血管，阻礙軸突遷移，損害神經(jīng)再生?？刂粕窠?jīng)周圍纖維化對神經(jīng)修復有重要意義［16-17］。在本實驗中，研究發(fā)現(xiàn)夏天無能夠減弱坐骨神經(jīng)痛模型大鼠成纖維細胞標志物vimentin 蛋白表達，減少成纖維細胞的激活狀態(tài)下的肌成纖維細胞標志物α-SMA 蛋白表達，減少受損區(qū)域collagen 1 蛋白的表達，初步說明夏天無干預后抑制神經(jīng)受損區(qū)域的成纖維細胞浸潤、激活，減少膠原纖維蓄積。但是體內環(huán)境相對復雜，周圍神經(jīng)微環(huán)境不僅存在著成纖維細胞，還有其他細胞，如巨噬細胞、施萬細胞等。因此本實驗檢測夏天無調控成纖維細胞的作用，進一步開展細胞體外培養(yǎng)實驗，通過LPS 誘導的成纖維細胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)夏天無干預后成纖維細胞的vimentin、α-SMA表達降低，膠原蛋白分泌減少，表明夏天無能抑制成纖維細胞活性。

炎癥反應通常能夠加重神經(jīng)損傷和疼痛［18］。前期研究發(fā)現(xiàn)夏天無能夠抑制巨噬細胞的炎性應答，但并未考慮成纖維細胞的炎性應答情況。由于成纖維細胞也是神經(jīng)微環(huán)境的炎癥細胞因子和趨化因子的關鍵細胞來源，其參與炎癥的發(fā)生發(fā)展［19-20］。因此在本實驗中檢測了成纖維細胞的炎性因子的表達情況，發(fā)現(xiàn)夏天無減少LPS 誘導損傷后的成纖維細胞促炎因子TNF-α 表達，增加抗炎因子IL-10 表達，初步表明夏天無減輕成纖維細胞所誘導的炎癥反應。

結合前期研究，推測夏天無具備消腫、消炎、化瘀等功效，能夠減少成纖維細胞的激活和膠原蛋白的分泌、抑制纖維化和減少促炎因子的釋放，從而使坐骨神經(jīng)微環(huán)境得到一定改善，避免傷害性信息的過度輸出，從而起到改善坐骨神經(jīng)痛的作用。