血友病A 伴凝血因子Ⅺ減少癥?
——附1 例報道及文獻復(fù)習(xí)

王杰 李強 張磊 邵靜茹 王甜甜 程彥 張心聲 張雪芹 房云海△

(1.山東省血液中心山東省血友病診療中心,山東 濟南 250014,2.濟南市中心醫(yī)院,3.山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院)

血友病A 為凝血因子Ⅷ缺乏的X 染色體連鎖的隱性遺傳性出血性疾病,而凝血因子Ⅺ缺乏為常染色體隱性的遺傳出血性疾病。在遺傳性凝血因子缺乏癥中,缺乏凝血因子Ⅷ、Ⅸ的血友病A 及血友病B 相對常見,與血管性血友病(VWD)構(gòu)成了95%～97%的遺傳性出血性疾病,其他的遺傳性凝血因子缺乏占3%～5%[1],包括遺傳性纖維蛋白原缺乏癥、凝血酶原缺乏癥、FⅤ缺乏癥、FⅤ和FⅧ聯(lián)合缺乏癥、FⅦ缺乏癥、FⅩ缺乏癥、FⅪ缺乏癥、FⅧ缺乏癥以及維生素K 依賴性凝血因子缺乏[1-2]。我們報道的1 例患兒APTT 延長,經(jīng)過凝血因子檢測發(fā)現(xiàn)患兒不僅是FⅧ∶C 降低,同時還伴有FⅪ∶C 降低,診斷為血友病A 伴凝血因子Ⅺ減少癥,我們對其進行基因分析,探究其發(fā)病機制,并進行文獻復(fù)習(xí)。

1 資料與方法

1.1 病歷資料 患兒,男,1 歲2 月,因“發(fā)現(xiàn)右側(cè)陰囊空虛1年”于2022 年11 月就診于山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院,完善相關(guān)檢查,血常規(guī)示W(wǎng)BC:12.23×109/L,RBC:4.32×1012/L,血小板計數(shù):340×109/L,血凝五項示凝血酶原時間PT:12.8 s,活化部分凝血活酶時間APTT:64.2 s,凝血酶時間:18.2 s,纖維蛋白原2.66 g/L,D-二聚體0.27 mg/L,生化全項未見異常,血型為O 型陽性,既往史:患兒家屬否認(rèn)有出血史?；颊咭蛐g(shù)前發(fā)現(xiàn)凝血異常送檢至本中心進行凝血因子檢測,查體:右側(cè)陰囊扁平空虛,內(nèi)無睪丸,于該側(cè)腹股溝上段捫及一睪丸樣腫物,大小約1.0×0.6 cm,質(zhì)軟,活動度較小,不可牽拉至陰囊內(nèi),擬手術(shù)行腹腔鏡下行睪丸固定術(shù)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及處理 采集患兒及父母血樣各2 管,1 管為0.109 mol/L(3.2%)的枸櫞酸鈉1 ∶9 抗凝的全血2 mL,4℃低溫1 500 g 離心15 min 得到乏血小板血漿進行凝血指標(biāo)檢測,另1 管EDTA 抗凝的靜脈全血用于基因檢測,患兒及家屬均已簽訂知情同意書,審批號為魯血倫審字【2022】10 號。

1.2.2 凝血指標(biāo)檢測 采用CS2000i 全自動凝血分析儀檢測患者的凝血因子Ⅷ活性(FⅧ∶C)、凝血因子Ⅸ活性(FⅨ∶C)、凝血因子Ⅺ活性(FⅪ∶C)、凝血因子Ⅻ活性(FⅫ∶C)、狼瘡抗凝物,采用Bethesda 法檢測FⅧ抑制物及FⅪ抑制物,ACLTOP300 全自動凝血分析儀檢測VWF ∶Ag。

1.2.3 基因檢測 由北京智因東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心進行基因檢測,提取患兒及其父母的DNA,并對FⅧ、FⅪ基因進行篩查,發(fā)現(xiàn)其突變位點。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 使用SWISS-MODEL 網(wǎng)站(https:/ /swissmodel.expasy.org/)進行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)構(gòu)建,使用Mega軟件進行蛋白質(zhì)序列的比對,在NCBI 數(shù)據(jù)庫下載不同物種的FⅪ基因的蛋白序列(詳細信息如下:Homo sapiens XP＿005262878.1,Pan troglodytes XP＿009446984.1,Macacamulatta XP＿014995138.1,Equusquagga XP＿046504759.1),對突變蛋白的保守性進行分析。

2 結(jié)果

2.1 凝血檢測 患兒FⅧ∶C 為10.1%,FⅪ∶C 為35.6%,其他凝血因子均正常。父母凝血因子檢測均為正常,見表1。

患兒父親母親參考范圍FⅧ10.1102.3 110.250～150 FⅨ59.9123.1 105.750～150 FⅪ35.698.462.350～150 FⅫ52105.385.450～150 VWF ∶Ag86.1152.7 125.6O 型42.0～140.8 A/B/AB 型66.1～176.3 FⅧ抑制物(BU)0000～0.6 FⅪ抑制物(BU)0000～0.6狼瘡抗凝物1.10.91.1<1.2

2.2 基因檢測 經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)患者FⅧ存在c.1834(exon12)C>T 突變,根據(jù)ACMG 指南(2019)此突變?yōu)榭赡苤虏⊥蛔?母親為雜合突變,父親為野生型,同時FⅪ存在c.1817(exon15)G>A 雜合突變導(dǎo)致了FⅪ第606 位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼?Gly 606Asp)。通過NCBI 數(shù)據(jù)庫(https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/)對該位點進行查詢,發(fā)現(xiàn)在人群中并沒有該位點突變的數(shù)據(jù),排除基因多態(tài)性的可能。檢索突變數(shù)據(jù)(http:/ /www.geht.org/databaseang/fibrinogen)及查閱文獻顯示,該突變類型為國際尚未見報道的新突變。

2.3 生物信息學(xué)分析結(jié)果 SWISS-MODEL 建模中發(fā)現(xiàn),當(dāng)Gly606 突變?yōu)锳sp 后,羧基數(shù)目增加1 個(圖1)。蛋白同源性分析發(fā)現(xiàn),Gly606 在哺乳類動物、爬行類和兩棲類等多種脊椎動物中均有較高的保守性(圖2)。

圖2 FⅪGly606 同源型物種間高度保守

3 討論

血友病A 在男性中的患病率為1/5 000[3],而凝血FⅪ缺乏既往被稱為血友病C,是1 種常染色體的隱性遺傳性疾病,現(xiàn)在改稱先天性FⅪ缺乏癥,男女均可發(fā)病,患病率為1/100 萬,在罕見性遺傳性出血性疾病中患者數(shù)僅少于血友病、VWD 和先天性FⅦ缺乏癥[2]。血友病的出血表型與其因子含量呈相關(guān)性,絕大多數(shù)患者凝血因子水平越低,出血表現(xiàn)越重,重型血友病A 常見的出血部位多為自發(fā)性的關(guān)節(jié)肌肉血腫,輕型血友病多表現(xiàn)為重大外傷或手術(shù)后出血[4]。而FⅪ減少的出血表現(xiàn)與因子含量不成正相關(guān),出血表型主要與損傷位置相關(guān),相對于血友病患者輕微。

本研究中發(fā)現(xiàn)患兒PT 正常,APTT 延長,因此只對其內(nèi)源性凝血因子進行檢測同時對患兒及其父母的FⅧ、FⅪ基因測序結(jié)果進行分析,患兒母親為血友病A 的攜帶者,也攜帶了先天性FⅪ缺乏癥的突變基因,同時我們對FⅧ、FⅪ的突變位點進行了檢索(https:/ /www.disgenet.org/search),發(fā)現(xiàn)FⅧ的突變位點是已報道的致病突變,而FⅪ此位點的突變信息未被報道。

此位點的突變使患兒FⅪ基因15 號外顯子突變(c.1817G>A)導(dǎo)致甘氨酸變?yōu)樘於彼?p.G606D),提示該位點可能是患兒FⅪ減少的原因。多序列比對結(jié)果顯示,該位點涵蓋了哺乳動物類、兩棲動物類和爬行動物類在內(nèi)的所有脊椎動物的分類中均為保守位點,同時查閱了NCBI 數(shù)據(jù)庫中該位點的群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù),在世界多種人群中均無該位點多態(tài)性的報道,提示該位點在進化中為1 個高度保守的位點,其正確的結(jié)構(gòu)和功能非常重要,突變后勢必會對凝血功能造成影響,蛋白質(zhì)同源建模結(jié)果顯示,該位點突變后,由甘氨酸變?yōu)樘於彼?增加了羧基的數(shù)目。

同時,本例血友病A 伴FⅪ減少癥的患兒通過二代測序證實,此突變位點自母親遺傳而來,并且通過生物信息學(xué)分析,證實了FⅪ突變位點(c.1817(exon15)G>A)是造成FⅪ活性降低的原因。FⅪ是常染色體隱性遺傳性疾病,該患兒是突變位點的攜帶者,表現(xiàn)為凝血因子Ⅺ減少。而患兒母親同為FⅪ此突變位點的攜帶者,但FⅪ∶C 在正常范圍,可能主要與其母親目前正處于妊娠晚期高凝狀態(tài)有關(guān)。

回顧近年來國內(nèi)外關(guān)于罕見凝血因子缺乏的文獻,凝血因子缺乏是1 種罕見疾病,2 種凝血因子合并缺乏更加罕見,1 種以上凝血因子缺乏叫做家族性多重凝血因子缺乏癥(FMCFDs)[5],而血友病A 伴FⅪ缺乏癥少見。國際上曾報道過三兄弟患有FⅧ合并FⅪ缺乏,并對其家系進行分析,發(fā)現(xiàn)分別有FⅧ突變和FⅪ突變引起的凝血因子缺乏,與本報道的相似,且患者在經(jīng)歷幾次手術(shù)中均有明顯出血表現(xiàn)[6]。通過檢索文獻,既往報道過10 名男性患者[6-7]和1 名女性患者[8]FⅧ和FⅪ聯(lián)合缺乏,Sayaka 等[9]報道過1 例FⅧ聯(lián)合FⅪ減少的老年患者因心力衰竭入院進行手術(shù)治療,在術(shù)前制定的止血方案中予以輸注人凝血因子Ⅷ和新鮮冰凍血漿進行止血治療。國內(nèi)報道的聯(lián)合凝血因子缺乏的病例也有,FⅤ、FⅧ聯(lián)合缺乏的較多[10],維生素K 缺乏引起的獲得性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ減少的病例也有[11]。但血友病A 伴凝血因子Ⅺ減少的病例很少,以單個凝血因子缺乏癥居多,例如FⅪ缺乏癥,FⅪ基因位于第4 號染色體的長臂(4q35)上,長度為50 kb,包含15 個外顯子和14 個內(nèi)含子。根據(jù)FⅪ突變數(shù)據(jù)庫,目前已發(fā)現(xiàn)多達220 個突變[12]。國內(nèi)葉佳佳等[13]研究發(fā)現(xiàn)Cys482Trp 使FⅪ重要結(jié)構(gòu)域缺失及作用力改變形成不穩(wěn)定蛋白,可能導(dǎo)致FⅪ活性下降。Kankan Su等[14]的研究在國際上首次報道發(fā)現(xiàn)Tyr503Cys 突變,替換產(chǎn)生了半胱氨酸殘基,導(dǎo)致形成額外的氫鍵和二硫鍵,影響了FⅪ蛋白的結(jié)構(gòu)和功能,導(dǎo)致FⅪ活性降低。國際上,也有大量的文獻表明氨基酸的變化可引起蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象發(fā)生變化,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)中氨基酸相互作用力的改變并影響其功能。

在臨床工作中,血友病A 伴先天性FⅪ減少的患者非常罕見,因此在臨床上容易造成漏診,若遇到APTT 相關(guān)的多項因子缺乏時,需要排除干擾APTT 檢測的因素如獲得性血友病、狼瘡抗凝物陽性等。有報道[15]發(fā)現(xiàn),高滴度的血友病A 伴抑制物和獲得性血友病A,會出現(xiàn)Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ因子均降低的現(xiàn)象,但隨著稀釋倍數(shù)到1 ∶2和1 ∶4,凝血因子Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ都明顯升高,更接近患者的真實水平,但凝血因子Ⅷ的值則變化不大,考慮Ⅷ抑制物,因此對于多個因子缺乏,稀釋后,如果其余的因子都升高,只有1 個變化不大,就考慮這個因子的抑制物,同樣,狼瘡抗凝物強陽性患者,也會出現(xiàn)Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ和Ⅻ因子均降低,將標(biāo)本稀釋后檢測,降低狼瘡抗凝物的影響,凝血因子會有明顯的升高,提示這部分患者本身的凝血因子并不低,只是狼瘡抗凝物影響檢測。

本研究發(fā)現(xiàn)的血友病A 伴凝血因子Ⅺ減少癥在國內(nèi)屬于首次報道,為保證手術(shù)的安全性,在術(shù)前為患者輸注了人凝血因子Ⅷ及新鮮冰凍血漿預(yù)防術(shù)中出血,術(shù)中、術(shù)后患兒均未見出血量多于其他凝血因子正常的患者,此次手術(shù)也為后續(xù)其他病例手術(shù)開展提供了一定的參考經(jīng)驗。

隨著臨床對凝血因子缺乏癥認(rèn)知程度的不斷提高及凝血因子檢測的普及,為避免漏診和誤診,對于APTT 延長的患者,尤其是行外科手術(shù)治療前,應(yīng)對APTT 相關(guān)的全部凝血因子進行檢測,同時需要排除干擾APTT 檢測的因素如獲得性血友病、狼瘡抗凝物陽性等,不能確診的患者可以進行基因檢測幫助明確診斷。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。