腫瘤患者血小板輸注療效影響因素及HLA-Ⅰ類抗體特異性分析?

賽娟 萬珊珊 田力△

(1.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院輸血研究所,四川 成都 610052,2.中國醫(yī)學科學院輸血不良反應(yīng)研究重點實驗室,3.四川省腫瘤醫(yī)院)

血小板輸注是各種血液病及腫瘤患者放/化療所致血小板減少的有效支持療法,可減少或降低患者的嚴重并發(fā)癥及死亡率。然而反復輸注血小板患者常常出現(xiàn)臨床癥狀未明顯改善或血小板計數(shù)未明顯升高等情況,不僅導致血小板資源的浪費,而且延誤患者的病情。統(tǒng)計結(jié)果顯示惡性腫瘤及血液病患者輸注無效率達7%～34%[1]。研究發(fā)現(xiàn)血小板抗體降低血小板輸注效果,其中HLA-Ⅰ類抗體最常見[2]。我們通過分析腫瘤患者血小板抗體產(chǎn)生和輸注療效影響因素及HLA-Ⅰ類抗體特異性,以期探索更科學合理的血小板輸注策略,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集 四川省腫瘤醫(yī)院2019 年11 月至2021年7 月申請輸注血小板的住院患者142 名,輸血前常規(guī)篩查血小板抗體,收集送檢患者臨床資料(性別、年齡、身高、體重、血小板計數(shù)、血小板輸注劑量等。本研究經(jīng)輸血研究所倫理審查委員會審批通過(2021007 號)。

1.2 血小板輸注原則 根據(jù)WS/T 623—2018?全血和成分血使用?,行椎管內(nèi)麻醉者,輸注閾值為Plt≤80×109/L,中心靜脈導管置入及急性失血或有創(chuàng)操作者(擇期診斷性腰椎穿刺和非神經(jīng)軸索手術(shù)等),輸注閾值為Plt≤50×109/L,病情不穩(wěn)定(如伴有發(fā)熱或感染等)的非出血患者,輸注閾值為Plt≤20×109/L,病情穩(wěn)定的非出血患者,為預防自發(fā)性出血,輸注閾值為Plt≤10×109/L。血小板制品為輻照濾白機采血小板,均由成都市血液中心統(tǒng)一提供。

1.3 主要儀器與試劑 血小板抗體檢測試劑(長春博德),HLA-Ⅰ類抗體檢測試劑(美國One Lambda 公司),HLA-Ⅰ類抗體特異性鑒定試劑(美國One Lambda 公司),Bio-Plex 200 流式細胞儀(美國Bio-Rad 公司)。

1.4 方法

1.4.1 血小板抗體篩查 血小板抗體篩查采用固相紅細胞黏附技術(shù)(SPRCA),嚴格按照血小板抗體檢測試劑盒說明書操作和判讀結(jié)果。

1.4.2 HLA-Ⅰ類抗體檢測 采用Luminex 單抗原微珠包被法,將待測血清與包被了HLA 特異性抗原的微珠加入微孔板中孵育,若血清中存在HLA-Ⅰ類抗體則可與微珠上的抗原結(jié)合,洗滌、染色、孵育后,通過Luminex 平臺獲取特異性結(jié)合微珠的熒光信號。依據(jù)說明書判讀結(jié)果。

1.4.3 HLA-Ⅰ類抗體特異性鑒定 操作步驟同上。陽性結(jié)果強度判讀:MFI≥10 000 為強陽性,5000≤MFI<10 000 為陽性,500≤MFI<5 000 為弱陽性(MFI:mean fluorescence intensity,熒光強度均值)。

1.5 血小板輸注療效評價參數(shù)的計算 輸注療效依據(jù)校正患者血小板計數(shù)增值(corrected count increment,CCI)CCI ＝0.0061×患者身高(cm)＋0.012 8×患者體重(kg)－0.152 9],若CCI(24h)<4.5×109/L 提示輸注無效。

1.6 統(tǒng)計學處理 一般信息和臨床特征應(yīng)用描述性統(tǒng)計,計數(shù)資料以“例數(shù)(%)”表示,計量資料以“均數(shù)±標準差”表示,組間血小板抗體篩查陽性率、HLA-Ⅰ類抗體陽性率及輸注無效率的比較采用χ2檢驗,多因素回歸分析及多因素方差分析應(yīng)用SPSS26 統(tǒng)計軟件,檢驗水準α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 患者的基本情況 自2019 年11 月至2021 年7 月,進行血小板抗體篩查的腫瘤患者合計270 名(共輸注血小板383次),經(jīng)過篩選后,研究最后納入了142 名腫瘤患者(神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤1 名,神經(jīng)母細胞瘤1 名,間葉組織腫瘤4 名,頭頸部腫瘤20 名,乳腺癌1 名,呼吸系統(tǒng)腫瘤15 名,消化系統(tǒng)腫瘤32名,泌尿系統(tǒng)腫瘤7 名,生殖系統(tǒng)腫瘤39 名,造血系統(tǒng)腫瘤22名),患者一般特征如表1 所示,其中抗體篩查陽性者50 例,抗體篩查陰性者92 例。所有研究對象住院期間共輸注142 次血小板,142 名腫瘤患者輸注前血小板計數(shù)均值為(23.11±16.509)×109/L,血小板輸注數(shù)據(jù)用于評估血小板輸注療效。排除標準及數(shù)據(jù)篩選流程如圖1。

圖1 血小板抗體及輸注療效分析流程圖

2.2 血小板抗體篩查結(jié)果及影響因素分析 腫瘤患者血小板抗體陽性率為35.2%(50/142),女性高于男性(χ2 ＝13.235,P<0.001),年齡、輸血史差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。多因素Logistics 結(jié)果顯示性別為血小板抗體產(chǎn)生獨立危險因素(χ2＝12.608,P<0.001,OR＝3.800,95%CI:1.819～7.940)(表2)。

抗體陽性(n＝50)抗體陰性(n＝92)χ2 值P HLA-Ⅰ類抗體陽性(n＝46)HLA-Ⅰ類抗體陰性(n＝96)χ2 值P輸注無效(n＝24)輸注有效(n＝118)χ2 值P性別 男15(30.0) 57(62.0) 13.235 <0.001 14(30.4) 58(60.4) 11.184<0.05 12(50.0) 60(50.8) 0.006 P>0.05 35(70.0) 35(38.0)32(69.6) 38(39.6)12(50.0) 58(49.2)年齡(歲,中位數(shù))55572.365 P>0.0555574.185 P>0.0561561.193 P>0.05 0～131(2.0)2(2.2)0(0)3(3.1)0(0)3(2.5)14～170(0)0(0)0(0)0(0)0(0)0(0)18～446(12.0)7(7.6)6(13.0)7(7.3)1(4.2) 12(10.2)45～5926(52.0) 41(44.6)25(54.3) 42(43.8)11(45.8) 56(47.5)≥6017(34.0) 42(45.7)15(32.6) 44(45.8)12(50.0) 47(39.8)輸血史 無輸血史 22(44.0) 54(58.7) 2.812 P>0.05 20(43.5) 56(58.3)2.759 P>0.05 11(45.8) 65(55.1) 0.686 P>0.05女有輸血史 28(56.0) 38(41.3)26(56.5) 40(41.7)13(54.2) 53(44.9)

2.3 HLA-Ⅰ類抗體檢測及特異性鑒定結(jié)果 腫瘤患者HLA-Ⅰ類抗體陽性率為32.4%(46/142),女性高于男性(χ2＝11.184,P<0.05),年齡、輸血史差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。46 例HLA-Ⅰ類抗體陽性者平均產(chǎn)生(40±23.7)種抗體,強陽性、陽性及弱陽性HLA-Ⅰ類抗體檢出率分別為69.6%(32/46)、80.4%(37/46)及97.8%(45/46),檢出率最高的抗體為抗-B?15 ∶12、抗-B?57 ∶03、抗-B?57 ∶01、抗-B?13 ∶02、抗-B?49 ∶01、抗-B?50 ∶01、抗-A?25 ∶01、抗-B?15 ∶01、抗-B?15 ∶02、抗-B?44 ∶02(表3)。97 種HLA-Ⅰ類特異性抗體的MFI 均值及其檢出頻數(shù)如圖2,MFI 均值≥10 000的HLA-Ⅰ類抗體如圖2 圖注。

圖2 97 種HLA-Ⅰ類特異性抗體的MFI 值及檢出頻數(shù)

2.4 血小板結(jié)果輸注及影響因素分析 腫瘤患者輸注無效率為16.9%(24/142),性別、年齡及輸血史差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。血小板抗體陽性者輸注無效率為30.0%(15/50),高于血小板抗體陰性者[9.8%(9/92)](χ2＝9.428,P<0.05),多因素Logistics 結(jié)果顯示血小板抗體為輸注療效獨立危險因素(χ2＝8.648,P<0.05,OR＝3.952,95%CI: 1.581～9.878)。Wilcoxon 檢驗示HLA-Ⅰ類抗體陽性者(n＝46)CCI 值低于HLA-Ⅰ類抗體陰性者(n＝96)(P<0.05)。

抗體針對的HLA-A 位點抗體針對的HLA-B 位點抗體針對的HLA-C 位點等位基因頻數(shù)(n≥21)陽性率(%)等位基因頻數(shù)(n≥27)陽性率(%)等位基因頻數(shù)(n≥8)陽性率(%)A?25 ∶012758.7B?15 ∶123065.2C?17 ∶011532.6 A?32 ∶012656.5B?57 ∶033065.2C?02 ∶021226.1 A?24 ∶032554.3B?57 ∶012963.0C?15 ∶021021.7 A?69 ∶012452.2B?13 ∶022860.1C?12 ∶03919.6 A?68 ∶012350.0B?49 ∶012860.1C?03 ∶03817.4 A?68 ∶022350.0B?50 ∶012860.1C?06 ∶02817.4 A?80 ∶012350.0B?44 ∶022758.7C?03 ∶04817.4 A?02 ∶012145.7B?15 ∶022758.7C?18 ∶02817.4 A?02 ∶062145.7B?15 ∶012758.7 A?24 ∶022145.7

3 討論

血小板輸注因其可降低出血風險而作為接受強化化療或同種異體移植患者的標準管理[2]?，F(xiàn)已明確血小板抗原-抗體的免疫反應(yīng)與血小板清除密切相關(guān),抗體的存在可能導致血小板存活時間明顯縮短,輸注后血小板計數(shù)不能達到預期效果[3]。輸注隨機供者血小板時,若供受者抗原不相合,受者發(fā)生免疫應(yīng)答產(chǎn)生同種抗體,血小板抗體與供者血小板抗原結(jié)合,導致IgG 調(diào)理血小板的形成,由清除細胞例如巨噬細胞等清除循環(huán)中此類血小板。

本研究發(fā)現(xiàn),女性為血小板抗體產(chǎn)生獨立危險因素,與董曉鋒等[4]一致,然而針對輸血史,本研究未得出與其一致的結(jié)果,推測可能的原因如下:實際有輸血史者因各種原因未按實際情況陳述,而部分此類患者血小板抗體篩查為陽性則同時導致:1)有輸血史者陽性率偏低,2)無輸血史者陽性率偏高。國外1 項研究結(jié)果顯示女性抗體產(chǎn)生率隨懷孕次數(shù)增加而增高,多次輸血者血小板抗體產(chǎn)生率高達42%[5]。由此可見,輸血史與抗體的產(chǎn)生關(guān)系仍需擴大樣本進一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)女性相比男性更容易產(chǎn)生HLA-Ⅰ類抗體,推測與懷孕有關(guān)。女性在懷孕期間或懷孕后產(chǎn)生HLA 抗體的比例占15%～50%,比例高低取決于懷孕次數(shù)[6]。含有胎兒HLA 抗原的白細胞碎片脫落進入母體循環(huán),誘導母體產(chǎn)生針對白細胞表面HLA 抗原的抗體[7]。

存在血小板抗體為血小板輸注療效獨立危險因素,Song等[8]Meta 分析表明血小板抗體為影響輸注療效的高危因素。血小板僅表達HLA-Ⅰ類分子,主要表達HLA-A 和HLA-B,每個血小板細胞攜帶50 000～120 000 個HLA-Ⅰ類分子[7],供者來源的血小板HLA-Ⅰ類分子主要引起體液性IgG 同種免疫:受者抗原遞呈細胞(antigen presenting cells,APCs)內(nèi)化供者來源血小板并將其抗原遞呈至HLA-Ⅱ類分子,此同種肽/HLA 復合物通過同源相互作用激活受體CD4＋T 細胞,受體B 細胞識別供體抗原后內(nèi)化供體細胞并呈遞供體來源的肽,該肽使得CD4＋T 細胞輔助誘導B 細胞分化為漿細胞并介導類別轉(zhuǎn)換最終使受體產(chǎn)生IgG 抗體[9]。在隨后的血小板輸注中,IgG 抗體與外源血小板表面HLA-Ⅰ型抗原結(jié)合,形成抗原-抗體復合物,誘導脾巨噬細胞或其他清除細胞通過Fcγ 受體(FcγRs)的連接來攝取抗原并清除血小板[9-10]。

國內(nèi)分析血小板抗體及輸注療效各自影響因素研究較多,但研究結(jié)果并非全部一致,推測原因可能為:1)標本例數(shù)及研究對象不一致,各研究間不滿足同質(zhì)性,2)各標本中位年齡不同,即患者免疫系統(tǒng)產(chǎn)生血小板抗體的能力強弱不同,3)女性懷孕史的實際數(shù)據(jù)難以獲取且僅有懷孕史而無輸血史的女性患者例數(shù)較少,4)此前研究[11]證實,影響血小板輸注療效的各因素間存在復雜的交互作用,各研究間影響因素的交互作用無法量化,5)存在不同種類/程度的非免疫性因素及放/化療次數(shù)等不可控因素。本研究HLA-Ⅰ類強陽性及陽性抗體檢出率分別為69.6%及80.4%,與劉瑛等[12]結(jié)果相近,19.6%(19/97)的HLA-Ⅰ類抗體MFI 值>10 000 且均為HLA-A 抗體和HLA-B 抗體,提示腫瘤患者IgG 型HLA-A 抗體和HLA-B抗體強度高。研究證實僅高滴度抗體與血小板的清除有關(guān),高滴度抗體Fc 段結(jié)合C1q 蛋白,啟動補體激活經(jīng)典途徑,導致膜攻擊復合物(membrane attack complex,MAC)的形成、鈣內(nèi)流和血小板的溶解[13]。張兵等[14]報道的血小板輸注無效患者HLA-Ⅰ類特異性抗體與圖2 圖注中抗-B?27 ∶05、抗-B?27∶08、抗-B?38 ∶01 相同,提示本研究MFI≥10 000 的19 種HLA-Ⅰ類特異性抗體可能與腫瘤患者血小板輸注效果差有關(guān)。趙娜娜等[15]報道了血小板輸注無效(platelet transfusion refractoriness,PTR)患者頻率最高的HLA-Ⅰ類特異性抗體為抗-B?57∶01、抗-A?23 ∶01、抗-B?40 ∶01、抗-B?27 ∶08、抗-B?27 ∶03、抗-B?58 ∶01、抗-B?13 ∶02、抗-A?24 ∶02、抗-A?24 ∶03、抗-B?07 ∶02,本研究與趙娜娜等[15]檢出的相同的抗體為抗-B?57 ∶01、抗-B?13 ∶02?？贵w陽性組輸注療效明顯低于抗體陰性組(圖2),提示改善血小板輸注效果關(guān)鍵在于:1)避免新血小板抗體的產(chǎn)生,2)避免抗原-抗體的結(jié)合。HLA-Ⅰ類抗體陽性者血小板輸注策略包括:1)抗體特異性預測(antibody specificity prediction,ASP)策略:為HLA-Ⅰ類抗體陽性者選擇受者HLA-Ⅰ類抗體靶向抗原陰性血小板,2)抗原特異性配合策略:對受者HLA 進行基因分型后尋找與之配合的血小板供血者。前述兩種策略均基于建立足夠數(shù)量的HLA 基因分型血小板供者信息庫。

為了提高血小板輸注療效,提出以下建議:首先,嚴格掌握血小板輸注指征,避免不必要的輸注,減少輸注次數(shù)。其次,建議血液科、腫瘤科等需要反復輸注血小板的科室應(yīng)針對需要反復輸注血小板患者常規(guī)開展血小板抗體及HLA-Ⅰ類抗體的篩查,對HLA-Ⅰ類抗體陽性者采用抗原特異性配合策略和/或ASP 策略選擇血小板。最后,建立一定規(guī)模的血小板供者信息庫,為長期輸注血小板患者及HLA 高度致敏患者提供血小板,一定程度上減少血小板資源的浪費。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。