獻(xiàn)血者HBsAg 陰性NAT 可疑標(biāo)本HBV 感染狀態(tài)確認(rèn)

王全慧 樊晶

(天津市血液中心 天津 300110)

隨著輸血醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展,血液輸注是目前臨床必不可少的1 種治療手段,經(jīng)輸血傳播病毒的風(fēng)險仍是我們關(guān)注的重要血液安全問題。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是乙型肝炎高流行國家血液安全的1 個焦點(diǎn)問題。由于乙肝疫苗的接種我國HBsAg 攜帶率從1992 年的9.75%降低至2020 年3%[1]。但是近年來國內(nèi)外的研究表明即便是NAT 檢測陰性的獻(xiàn)血者血液中仍可能含有低病毒載量的HBV DNA,輸血感染HBV 仍然是血液篩查中最為主要的風(fēng)險之一[2]。特別是HBV 感染窗口期(window period,WP)、隱匿性乙型肝炎病毒感染(occult hepatitis B virus infection,OBI)以及病毒變異等特殊情況下,仍不能達(dá)到完全屏蔽的作用[3]?；谵D(zhuǎn)錄介導(dǎo)核酸擴(kuò)增技術(shù)(transcription-mediated nucleic acid amplification technology,TMA)在本血站已經(jīng)施行了10 余年,得益于HBV 核酸檢測的高靈敏度,發(fā)現(xiàn)部分獻(xiàn)血者標(biāo)本的檢測結(jié)果為HBsAg－/NAT 聯(lián)檢反應(yīng)性,血液全部報(bào)廢處理,及時阻斷了經(jīng)血傳播風(fēng)險。鑒別試驗(yàn)陽性獻(xiàn)血者雖經(jīng)屏蔽處理,但仍有近60%鑒別試驗(yàn)陰性獻(xiàn)血者并未屏蔽,這部分獻(xiàn)血者是NAT 聯(lián)檢假陽性,還是窗口期感染以及病毒載量極低的OBI,有待進(jìn)一步確認(rèn)。因此,我們通過對HBsAg－/NAT 可疑獻(xiàn)血者大體積血漿進(jìn)行病毒富集,超敏的熒光定量PCR 進(jìn)行HBV DNA 檢測,PANTHER 系統(tǒng)復(fù)測鑒別實(shí)驗(yàn),確認(rèn)獻(xiàn)血者感染狀態(tài),為本地區(qū)輸血安全研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2021 年1—8 月本中心采集69 362 份無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本,全部標(biāo)本均經(jīng)HBsAg、梅毒(抗-TP)膠體金快速試紙條檢測合格和ALT 半自動檢測初篩合格。經(jīng)血清學(xué)和NAT 檢測后共收集到HBsAg－/NAT 可疑的標(biāo)本66 份?？梢蓸?biāo)本血液由于聯(lián)檢陽性,血液進(jìn)行報(bào)廢處理。采用單純隨機(jī)抽樣的方法選取23 份NAT 可疑獻(xiàn)血者報(bào)廢血漿,每袋留取血漿50 mL,－20℃以下冰箱凍存用于后續(xù)研究。

1.2 試劑與儀器 HBsAg 試劑(麗珠公司,批號:20200914 08—2021010208,伯樂公司,批號:OK0288—1B0291),Procleix ULTRIO Elite 核酸聯(lián)合檢測/鑒別試劑(Grifols 公司,批號:702597、703037),HBV DNA 定量檢測試劑(羅氏診斷公司,批號:J08068),MicroLab STAR 全自動加樣系統(tǒng)、MicroLab FAME24/30 全自動微板檢測系統(tǒng)(HAMILTON 公司),Procleix PANTHER System 全自動核酸檢測系統(tǒng)(Grifols 公司),Optima L-100 XP 超高速離心機(jī)(Beckman 公司)。所有試劑均在有效期內(nèi)使用,儀器都經(jīng)過校準(zhǔn)并在正常狀態(tài)下使用。

1.3 方法

1.3.1 血清學(xué)檢測 2 遍ELISA 檢測,檢測項(xiàng)目包括HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP。檢測程序須嚴(yán)格按照試劑盒說明書及標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行操作。雙試劑反應(yīng)性,不需要復(fù)試。單試劑反應(yīng)性需用原試劑進(jìn)行雙孔復(fù)試,任意1 孔有反應(yīng)均判為篩查反應(yīng)性。

1.3.2 核酸檢測 采用單人份Procleix PANTHER 核酸檢測系統(tǒng)進(jìn)行HBV、HCV、HIV 3 項(xiàng)核酸聯(lián)檢。聯(lián)檢反應(yīng)性標(biāo)本需要進(jìn)行鑒別試驗(yàn)區(qū)分病毒種類,鑒別陽性判為NAT＋。鑒別結(jié)果陰性判為NAT 可疑。

1.3.3 HBsAg－/NAT 可疑標(biāo)本病毒富集及分子生物學(xué)檢測

可疑標(biāo)本經(jīng)4℃175 000×g 離心3.5 h,將36 mL 血漿進(jìn)行病毒濃縮,離心后棄去上層血漿,加PBS(磷酸鹽)緩沖液,得到1.2 mL 濃縮混懸液。使用羅氏HBV DNA 定量檢測試劑檢測(檢出限:5.5 IU/mL)并用Grifols PANTHER 檢測系統(tǒng)復(fù)測(檢出限:3.4 IU/mL)。2 種方法中任意1 種陽性即確認(rèn)HBV 感染。2 種方法均陰性,則判定為HBV 未感染。

1.3.4 HBV 血清學(xué)標(biāo)志物檢測 可疑標(biāo)本標(biāo)本送迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行乙肝兩對半檢測(HBsAg、抗-HBs 進(jìn)行定量檢測)。

1.3.5 HBV 感染狀態(tài)的確認(rèn) 1)血清學(xué)陽性O(shè)BI:抗-HBs和/或抗-HBc 反應(yīng)性,2)血清學(xué)陰性O(shè)BI:血清學(xué)標(biāo)志物均為陰性,3)WP 感染:血清學(xué)標(biāo)志物均為陰,追蹤檢測出現(xiàn)HBsAg 陽轉(zhuǎn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 24.0 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,標(biāo)本率的比較均采用Pearson 卡方檢驗(yàn),Fisher′s精確檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBsAg－/NAT 可疑標(biāo)本分子生物學(xué)及血清學(xué)檢測結(jié)果

23 份NAT 可疑標(biāo)本中,TMA 鑒別試驗(yàn)HBV DNA 陽性11份(47.8%),HBV DNA 定量檢測陽性10 份(43.5%)。其中5份(50%)在檢測限(10 IU/mL)以下,TMA 鑒別檢測與羅氏HBV DNA 定量檢測陽性率比較,χ2＝0.767,P>0.05。5 份可定量標(biāo)本除1 份病毒載量最高464 IU/mL,其余4 份均<100 IU/mL,中位數(shù)為15.4 IU/mL。乙肝兩對半檢測抗-HBc 陽性19 份(82.6%),抗-HBs 定量檢測陽性12 份(52.2%),抗-HBe陽性7 份(30.4%),HBsAg 和HBeAg 未檢出陽性。獻(xiàn)血者中男性18 名,女性5 名,見表1。

表1 NAT 可疑標(biāo)本血清學(xué)及分子生物學(xué)檢測結(jié)果

2.2 NAT 可疑標(biāo)本血清標(biāo)志物分布 23 份NAT 可疑標(biāo)本經(jīng)PANTHER 鑒別檢測、HBV DNA 定量檢測,其中14(60.9%)份為HBV DNA＋。這14 份HBV DNA＋標(biāo)本1 份為血清學(xué)標(biāo)志物全陰性,由于未進(jìn)行追蹤檢測,懷疑為窗口期感染,13 份為OBI,其中8 份(61.5%)為抗-HBs－/抗-HBc＋,5份(38.5%)為抗-HBs＋/抗-HBc＋。HBV 感染者與未感染者血清標(biāo)志物陽性率比較,χ2＝7.756、P>0.05,見表2。

表2 NAT 可疑標(biāo)本血清標(biāo)志物分布(n,%)

2.3 感染者與未感染者人口學(xué)分布特征 見表3。

表3 感染者與未感染者人口學(xué)分布特征(n,%)

2.4 HBV 感染者、OBI 者、未感染者抗-HBs 濃度分布 見表4。

表4 HBV 感染者、OBI 者、未感染者抗-HBs 濃度分布(n,%)

3 討論

我國是乙肝的高流行國家,HBV 是重要的輸血傳播病原體之一,對我國輸血安全構(gòu)成威脅。隨著血清學(xué)檢測方法靈敏度的不斷提高及核酸檢測的廣泛應(yīng)用,HBV 輸血傳播的殘余風(fēng)險主要與HBsAg－病毒載量極低的隱匿性乙肝感染有關(guān),這種低濃度病毒載量往往在NAT 檢測限左右[4],并且呈Poisson 分布[5]。即便是最靈敏的ID-NAT 也只能間隙性檢出。同時也造成了PANTHER 系統(tǒng)檢測時出現(xiàn)NAT 聯(lián)檢陽性,鑒別陰性的問題。

有研究認(rèn)為核酸檢測非重復(fù)反應(yīng)性現(xiàn)象與病毒載量極低的OBI 有關(guān)。對于含有極低HBV DNA 水平的OBI 獻(xiàn)血者,用MP-NAT 和ID-NAT 很難檢出HBV DNA,可考慮重復(fù)檢測(單檢或鑒別),或是加大標(biāo)本血漿提取體積、并用超高速離心機(jī)進(jìn)行病毒富集,通過針對病毒基因組不同區(qū)域的替代檢測(實(shí)時熒光PCR、巢氏PCR)進(jìn)行確認(rèn)。國內(nèi)外研究表明超離體系已證實(shí)可用于病毒載量極低的OBI 確認(rèn)[6],瑞士在11 432 名ID-NAT－/抗-HBc＋獻(xiàn)血者中通過大體積血漿超高速離心體系最終確認(rèn)7 例OBI 感染者[7],但超高速離心機(jī)價格昂貴、且每次只能離心6 個標(biāo)本,限制了其在血站系統(tǒng)的廣范應(yīng)用。

OBI 是HBV 感染的1 種特殊類型,容易發(fā)生漏檢。當(dāng)檢測到HBV DNA 載量時,通常都很低(<200 IU/mL/1 000 拷貝/mL),甚至超過90%的OBI 患者的血清中病毒載量極低(<20 IU/mL)[8]。本研究中HBV DNA 定量檢測陽性10 份,其中5 份在檢測限(10 IU/mL)以下,5 份可定量(11～464 IU/mL,中位數(shù)15.4 IU/mL)。本研究血漿標(biāo)本經(jīng)超高速離心后大概被濃縮了30 倍(假設(shè)吸附在管壁的病毒顆粒全部溶解在緩沖液中),根據(jù)濃縮倍數(shù)可粗略推測標(biāo)本初始狀態(tài)下病毒載量,大約(0.36～15.46)IU/mL,中位數(shù)0.51 IU/mL。Candotti 等[9]的研究推測HBV 最低感染劑量從之前預(yù)測的20 IU/mL 降低至約3 IU/mL。為了防止通過輸血傳播HBV,核酸檢測靈敏度需從目前的3.4 IU/mL 降低至0.15 IU/mL,這也證實(shí)這一推測的合理性。

本研究顯示HBV 感染者中男性比例(85.7%)較高,而且隨著年齡增高感染比例越大,與朱麗莉等[10]的研究結(jié)果(84.85%)一致。感染者年齡偏大(中位數(shù)42 歲),可能存在2 方面的原因:一是我國自1992 年起實(shí)施新生兒乙肝疫苗接種,部分HBsAg＋的母親所生嬰兒經(jīng)免疫阻斷后可能存在OBI[11],二是隨著年齡的增高,乙肝疫苗免疫接種率低,有研究證實(shí)乙肝感染者隨著時間的推移可部分轉(zhuǎn)變?yōu)镺BI[12]。

抗-HBc 被認(rèn)為是OBI 關(guān)鍵的血清學(xué)標(biāo)志物[13]。本研究中NAT 可疑標(biāo)本抗-HBc 陽性率達(dá)到82.6%,低于葉賢林等[14](89.8%)與李素萍等[15](89.53%)的研究數(shù)據(jù)。HBV感染者陽性率為92.8%,除去1 份疑似WP 標(biāo)本,OBI 感染者抗-HBc 陽性率為100%。血清/血漿中抗-HBc＋不僅提供了既往感染的證據(jù),還有可能排除大多數(shù)NAT 無法檢測到的OBI。本研究中NAT 可疑標(biāo)本抗-HBc 陽性率高達(dá)82.6%,這可能與本地具有較高的乙肝流行率有關(guān),同時也提示這些獻(xiàn)血者中可能含有較高比例的OBI 感染者,但由于病毒載量太低而未發(fā)現(xiàn)。

抗-HBs 是具有特異性保護(hù)功能的中和抗體,有研究表明獻(xiàn)血者或受血者存在抗-HBs 時,HBV 傳染率顯著降低[14]?？?HBs 的保護(hù)水平仍然備受爭論,英國、加拿大等國家和中國香港特別行政區(qū)建議當(dāng)抗-HBc ＋且抗-HBs≥100 IU/L 時血液是安全的[13]。日本紅十字會基于HBV 高流行率和血液供需,自1989 年起規(guī)定當(dāng)抗-HBc＋且抗-HBs≥200 IU/L 時血液是合格的[16]。本研究HBV 感染者中抗-HBs>200 IU/L 僅占7.14%(1/14),抗-HBs 陰性64.3%(9/14),比例較高,提示本地區(qū)OBI 獻(xiàn)血者血液的保護(hù)性較弱。

綜上所述,經(jīng)超高速離心大體積血漿病毒富集并結(jié)合高靈敏分子生物學(xué)方法在23 份NAT 可疑獻(xiàn)血者中共確認(rèn)HBV 感染者14 例,OBI 13 例。ID-NAT 聯(lián)檢反應(yīng)鑒別非反應(yīng)現(xiàn)象與病毒載量極低的OBI 有關(guān),抗-HBc 檢測可有助于此類HBV 感染獻(xiàn)血者的排除。ID-NAT 存在漏檢WP、OBI,輸血后HBV 感染仍不可避免。重復(fù)檢測可以提高HBV DNA的確認(rèn)率,但考慮到OBI 的波動性,為防范錯誤判定需要更高靈敏度的HBV DNA 確認(rèn)方法。抗-HBs≥200 IU/L 似乎更具有保護(hù)性。本文存在進(jìn)行病毒富集標(biāo)本太少以及未進(jìn)行追蹤檢測確證感染的不足之處。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。