廣州地區(qū)無償獻(xiàn)血人群不同時期新冠病毒抗體檢測分析?

單振剛 羊華龍 楊樂東 黃杰庭 王敏 許茹 廖峭 鐘惠珊 劉博超 付涌水, 戎霞△

(1.廣州血液中心,廣東 廣州 510095,2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院)

新冠病毒是嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2) 的簡稱[1-2]。大多數(shù)新冠病毒感染者表現(xiàn)為無臨床癥狀或僅有輕微癥狀,但部分人如有基礎(chǔ)疾病的老年人感染后可能出現(xiàn)呼吸困難、持續(xù)胸痛、高燒、意識模糊等嚴(yán)重癥狀甚至危及生命[3]。我國?新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第八版)?明確指出康復(fù)者恢復(fù)期血漿可用于病情進(jìn)展較快的重型和危重型患者[4],同時有關(guān)部門也要求各地采供血機(jī)構(gòu)做好新冠康復(fù)者恢復(fù)期血漿供應(yīng)工作。因此,了解無償獻(xiàn)血者體內(nèi)不同時間段新冠病毒抗體水平,對于進(jìn)一步采集含有高效價抗體血漿,服務(wù)新冠感染救治工作有著重要意義。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)在廣州地區(qū)的無償獻(xiàn)血者中開展新冠病毒IgG、IgM 以及中和抗體的檢測分析,為恢復(fù)期血漿采集和臨床使用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 研究對象 隨機(jī)選取2023 年2—7 月在廣州血液中心獻(xiàn)血且所有檢測項(xiàng)目均合格的無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本1 168份。其中326 份(2023 年2 月獻(xiàn)血)檢測IgG 抗體,398 份(2023 年7 月獻(xiàn)血)同時檢測IgG 和IgM 抗體,444 份(2023年2 月獻(xiàn)血)檢測中和抗體。

1.2 試劑與儀器 新型冠狀病毒(2019-nCoV)IgM/IgG 抗體檢測試劑盒(北京華大吉比愛公司,批號20230102,IgM 檢測原理為ELISA 捕獲法,IgG 檢測原理為ELISA 間接法),新型冠狀病毒(2019-nCoV)中和抗體測定試劑盒(北京華大吉比愛公司,生產(chǎn)批號20221202,中和抗體測定原理為競爭法ELISA,測定方法溯源至WHO Reference Panel,NIBSC code:20/268),Microlab STAR-8CH 全自動加樣儀(HAMILTON 公司)、Multiskan MK3 酶標(biāo)分析儀(Thermo Fisher 公司)、高通量全自動酶免儀(深圳愛康公司)

1.3 方法

1.3.1 IgG 抗體檢測 根據(jù)?新冠肺炎康復(fù)者恢復(fù)期血漿臨床治療方案(試行第三版)?,新冠病毒IgG 抗體定性檢測呈陽性且160 倍稀釋后按照試劑說明書要求檢測仍為陽性反應(yīng)的血清/血漿符合采集標(biāo)準(zhǔn)。因此本研究中所有血漿標(biāo)本在IgG 檢測前均使用生理鹽水稀釋160 倍。

1.3.2 IgM 抗體檢測 IgM 抗體檢測使用未經(jīng)稀釋的血漿,所有操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。IgM 抗體陽性的血漿送第三方醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)公司做新冠病毒核酸檢測,同時對獻(xiàn)血者進(jìn)行隨訪。

1.3.3 中和抗體檢測 中和抗體檢測使用未經(jīng)稀釋的血漿。試劑盒定量檢測的線性范圍為(0.1～10)μg/mL(校準(zhǔn)品濃度分別為0 μg/mL、0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL,1 μg＝160 IU),結(jié)果高于線性范圍的一律計(jì)為10 μg/mL,結(jié)果低于0.06 μg/mL(空白限)的則計(jì)為中和抗體陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 22 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,圖表繪制使用Microsoft Excel 2016。計(jì)數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗(yàn),計(jì)量資料組間比較采用秩和檢驗(yàn),以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 獻(xiàn)血者一般情況 見表1。

表1 研究人群的基本情況(n,%)

2.2 獻(xiàn)血者新冠病毒IgG 抗體檢測結(jié)果 見表2。

表2 獻(xiàn)血者新冠病毒IgG 抗體檢測結(jié)果

2.3 獻(xiàn)血者新冠病毒IgM 抗體檢測結(jié)果 2023 年7 月采集的398 份血液標(biāo)本經(jīng)檢測有5 份為IgM 反應(yīng)性,反應(yīng)性率1.26%,隨訪發(fā)現(xiàn)4 位獻(xiàn)血者曾經(jīng)出現(xiàn)過新冠感染臨床癥狀,但在本次獻(xiàn)血前后沒有身體不適,見表3。

表3 IgM 抗體檢測反應(yīng)性獻(xiàn)血者基本情況

2.4 獻(xiàn)血者新冠病毒中和抗體檢測結(jié)果 444 份血液標(biāo)本中有440 份檢出中和抗體,反應(yīng)性率99.10%。不同性別及不同年齡段間的中和抗體濃度無差異(P>0.05),71.59%的反應(yīng)性獻(xiàn)血者的中和抗體濃度達(dá)到或超過試劑盒檢測上限,見表4。中和抗體定量的分布情況見圖1。

圖1 獻(xiàn)血者新冠病毒中和抗體定量分布

表4 獻(xiàn)血者新冠病毒中和抗體定量結(jié)果

3 討論

新冠病毒感染人體后可以引起廣泛的體液免疫應(yīng)答,產(chǎn)生多種抗體[5]?？贵w檢測在識別機(jī)體感染狀態(tài),評估人群感染水平、再感染風(fēng)險以及治療和管理效果等方面有著至關(guān)重要的作用[6],含有高效價(中和)抗體的恢復(fù)期血漿還可用于新冠重癥、危重癥患者的救治。鑒于目前大量獻(xiàn)血者為新冠感染的康復(fù)者,因此我們在廣州地區(qū)的無償獻(xiàn)血者中開展新冠病毒抗體的檢測分析。

自國家衛(wèi)健委宣布對新冠病毒感染實(shí)施“乙類乙管”以來,廣州地區(qū)的感染率上升較快。在我們的研究中,55.11%的獻(xiàn)血者體內(nèi)可以檢出IgG 抗體,考慮到血液標(biāo)本在檢測前已經(jīng)預(yù)先使用生理鹽水稀釋了160 倍,實(shí)際的感染率可能更高。7 月份的IgG 檢出率達(dá)79.4%,顯著高于2 月份,這說明廣州地區(qū)人群中大部分人都已經(jīng)感染了新冠病毒,且其中部分人可能感染了不止1 次,重復(fù)感染導(dǎo)致體內(nèi)IgG 水平升高。

有研究指出新冠病毒感染者抗體水平可能與性別有關(guān),該研究比較了127 名男性感染者和204 名女性感染者,發(fā)現(xiàn)女性在發(fā)病早期,體內(nèi)IgG 水平高于男性,并且在重癥患者中女性的IgG 水平也高于男性[7],這說明性別可能是導(dǎo)致新冠病毒感染不同結(jié)果的原因之一。不過該研究同時顯示在輕度、一般以及康復(fù)患者中未發(fā)現(xiàn)IgG 水平存在性別差異,這與我們的研究結(jié)果是一致的。另一個影響抗體水平的因素是病情嚴(yán)重程度,多個研究均發(fā)現(xiàn)重癥、危重癥患者的IgG水平高于非重癥患者[8-9]。由于無償獻(xiàn)血排除了60 歲以上老人等有新冠重癥風(fēng)險的人群,因此在我們的研究中未發(fā)現(xiàn)年齡與IgG 水平存在關(guān)聯(lián)。

新冠病毒感染者在恢復(fù)期有2 種血清學(xué)轉(zhuǎn)換模式,即IgG＋/IgM＋和IgG＋/IgM－。有研究指出血清學(xué)轉(zhuǎn)換模式受年齡影響,該研究分析了172 名處在恢復(fù)期的感染者發(fā)現(xiàn)IgG＋/IgM＋組老年人占比更高(P<0.05)[5],我們的數(shù)據(jù)也支持這一結(jié)論。本次研究我們對398 名獻(xiàn)血者(平均年齡32.5歲)進(jìn)行了IgM 抗體檢測,共發(fā)現(xiàn)了5 名IgM 反應(yīng)性獻(xiàn)血者。5 人平均年齡45.8 歲,高于整體平均年齡。對5 份IgM 反應(yīng)性血漿進(jìn)行新冠病毒核酸檢測,結(jié)果為陰性。由于獻(xiàn)血者IgG 檢測呈反應(yīng)性且在獻(xiàn)血前后未出現(xiàn)明顯不適,因此該5名獻(xiàn)血者大概率處于感染恢復(fù)期。本次研究中核酸檢測使用的是血漿標(biāo)本,未使用鼻咽拭子,因此無法確定獻(xiàn)血者體內(nèi)病毒是否已經(jīng)完全清除,但血漿中未檢出病毒核酸也說明恢復(fù)期血漿傳播病毒的可能性很低,恢復(fù)期血漿輸注不會對血液安全造成影響。實(shí)際上即使從血液中檢測到核酸,也不意味著新冠病毒可以通過輸血傳播。法國1 項(xiàng)研究調(diào)查了268 份獻(xiàn)血后回告標(biāo)本,發(fā)現(xiàn)其中有3 份為新冠病毒核酸陽性,然而不論是直接做病毒培養(yǎng)還是經(jīng)超離心后再培養(yǎng)的結(jié)果均為陰性,這說明檢測到的核酸可能僅為片段化的病毒RNA 或沒有完整病毒顆粒的RNA[10]。由于尚未發(fā)現(xiàn)輸血傳播病例,因此目前認(rèn)為輸血傳播新冠病毒的風(fēng)險很低[3,11]。

新冠病毒是1 種有包膜的RNA 病毒,其基因組有14 個開放閱讀框,可以編碼刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)以及核衣殼蛋白(N)等多種蛋白。位于刺突蛋白(S)上的受體結(jié)合域(RBD)能識別細(xì)胞表面受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE2)進(jìn)而感染宿主細(xì)胞。通過特異性識別RBD 阻斷病毒與宿主細(xì)胞ACE2 結(jié)合的抗體稱為中和抗體[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)廣州地區(qū)獻(xiàn)血人群的新冠病毒中和抗體檢測反應(yīng)性率接近100%,同時中和抗體水平也很高,71.59%的獻(xiàn)血者的中和抗體濃度≥10 μg/mL,這可能與廣州地區(qū)較高的疫苗接種率以及較早解除管控有關(guān)。付春燕等[14]檢測了349 例新冠滅活疫苗接種者的血清中和抗體水平,發(fā)現(xiàn)在第3 劑后150 d 中和抗體檢測的反應(yīng)性率仍然為100%。郭楠等[15]隨訪了未接種疫苗的新冠康復(fù)者,發(fā)現(xiàn)在出院后12 個月時中和抗體檢測反應(yīng)性率為94.12%,可見較高的疫苗加強(qiáng)針接種率或新冠病毒感染率均會提升人群的中和抗體水平。本研究中IgG 抗體檢測反應(yīng)性率低于中和抗體檢測反應(yīng)性率可能是血漿稀釋倍數(shù)不同造成的,IgG 抗體檢測使用的是稀釋后的血漿,而中和抗體檢測使用的是未經(jīng)稀釋的血漿。由于宿主體內(nèi)存在的干擾物如類風(fēng)險因子、嗜異性抗體、補(bǔ)體等以及新冠病毒與其他冠狀病毒的免疫交叉反應(yīng)都會影響抗體檢測的準(zhǔn)確性[6,16],所以也不排除中和抗體有假反應(yīng)性的可能。此外實(shí)驗(yàn)方法及試劑批次的不同也會對檢測結(jié)果產(chǎn)生一定影響。試劑方面,本研究所用的抗體檢測試劑均基于新冠病毒原型株開發(fā),該批次試劑對于感染新冠病毒不同變異株的個體的檢測性能可能會有一定差異。方法方面,有文獻(xiàn)指出衡量血漿中和潛力的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)是活病毒中和實(shí)驗(yàn)[17],而替代病毒中和實(shí)驗(yàn)(sVNT)的靈敏度僅有前者的80%[18]。歐洲1 項(xiàng)研究比較了5 種中和抗體發(fā)光檢測試劑與噬斑減少中和實(shí)驗(yàn)(PRNT)的檢測結(jié)果,發(fā)現(xiàn)相關(guān)性最高0.872,最低0.799[19]。蔣國潤等[20]使用ELISA(以S 蛋白為抗原)和微量細(xì)胞中和試驗(yàn)分別測定新冠滅活疫苗臨床試驗(yàn)血清標(biāo)本的中和抗體滴度,發(fā)現(xiàn)二者相關(guān)系數(shù)為0.494。陳維欣等[21]比較了ELISA、CLIA 和NT(中和實(shí)驗(yàn)) 3 種方法檢測新冠疫苗免疫后抗體水平的一致性,發(fā)現(xiàn)ELISA 與NT 定量結(jié)果的相關(guān)系數(shù)為0.69,CLIA 和NT 定量結(jié)果的相關(guān)系數(shù)為0.65。這提示我們在分析中和抗體的檢測結(jié)果時必須考慮實(shí)驗(yàn)方法與試劑的影響。本研究中僅使用1 種ELISA 試劑對中和抗體進(jìn)行了定量檢測,具有一定局限性。另外需要指出的是中和抗體檢測目前沒有統(tǒng)一的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn),例如本研究的中和抗體定量中位值為10 μg/mL,而胡欣等[22]測定新冠恢復(fù)期男性患者血漿的中和抗體效價中位數(shù)為1124.7 AU/mL,2 個檢測結(jié)果難以直接對比。因此抗體定量值只能作為評估恢復(fù)期血漿中和能力的參考,其準(zhǔn)確性還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上,廣州地區(qū)無償獻(xiàn)血人群在新冠病毒大規(guī)模流行后有較高的新冠病毒抗體水平,充分具備為臨床救治工作提供高效價抗體血漿的條件。但臨床使用效果如何以及是否需要根據(jù)使用情況動態(tài)調(diào)整采集標(biāo)準(zhǔn)還需要多中心大樣本研究。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。