新冠病毒抗體ELISA 篩查假陽性反應(yīng):不同方法檢測(cè)結(jié)果的內(nèi)在邏輯?

王立林 李然 李彤 張愛佳 劉衡 許曉絢 曾勁峰 鄔林楓

(深圳市血液中心,廣東 深圳 518035)

2020 年初至2023 年5 月,新型冠狀病毒感染(coronavirus disease 2019,COVID-19)一直是影響全球的突發(fā)公共衛(wèi)生事件。隨著研究的深入和疾病檢測(cè)診斷經(jīng)驗(yàn)的積累,血清學(xué)檢測(cè)方法對(duì)公共衛(wèi)生的意義引發(fā)更多關(guān)注。2020 年3 月?新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)?在原有核酸檢測(cè)和測(cè)序基礎(chǔ)上增加“血清學(xué)檢測(cè)”作為確診依據(jù)[1]。但是,不同的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)診斷方法適應(yīng)于特定的時(shí)間、環(huán)境和人群,不同條件下檢測(cè)結(jié)果也會(huì)大相徑庭。在COVID-19 流行早期,低流行率的人群出現(xiàn)較高的抗體假陽性率[2-4],影響抗體篩查對(duì)疾病的診斷和流行防控功能。這種情況在流行率顯著低于試劑的假陽性率時(shí)更加突出[5]。已知流行率不變,提高試劑特異性能減少假陽性,降低誤診率。

新發(fā)再發(fā)傳染病流行初期,當(dāng)暫未有新一代靈敏特異試劑可供選擇,未有更先進(jìn)的儀器設(shè)備可以使用,如何最大限度鑒別假陽性標(biāo)本是檢驗(yàn)人員需要思考的問題。本研究探索在無償獻(xiàn)血人群中,通過多種方法對(duì)篩查出來的抗體反應(yīng)性標(biāo)本進(jìn)行確證,分析不同方法的有效性和可行性,謹(jǐn)慎地對(duì)假陽性人群進(jìn)行甄別,真正將疫情防控在初期,同時(shí)避免不必要的假陽性困擾。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 新冠抗體反應(yīng)性組 2020 年3 月28 日至4 月28 日,8 632 人次(8 505 名)獻(xiàn)血者新冠抗體ELISA 篩查反應(yīng)性標(biāo)本設(shè)為陽性組(PC 組),其追蹤血漿標(biāo)本為FC 組。反應(yīng)性獻(xiàn)血者及其追蹤的血漿標(biāo)本分裝,－20℃凍存。獻(xiàn)血者已通過?獻(xiàn)血者健康檢查要求?的問詢。本研究獲得深圳市血液中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào)SZBC-2020-R013),獻(xiàn)血者已簽署知情同意書。

1.1.2 疾病對(duì)照標(biāo)本組 2020 年1 月30 日至4 月7 日,30名在深圳市血液中心捐獻(xiàn)血漿的新冠康復(fù)者血漿標(biāo)本作為疾病對(duì)照組(DC 組)。

1.1.3 陰性對(duì)照標(biāo)本組 采用系統(tǒng)隨機(jī)抽樣方法,抽取2020年2 月2 日至4 月27 日,165 例新冠總抗體陰性標(biāo)本作為陰性對(duì)照組(NC 組)。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 血液篩查常規(guī)血清學(xué)檢測(cè) HBsAg 試劑1(DiaSorin S.p.A.UK Branch),HBsAg 試劑2(北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司),抗-HCV 試劑1(Ortho-Clinical Diagnostics),抗-HCV試劑2(珠海麗珠試劑股份有限公司),HIV Ag-Ab 試劑1(BIO-RAD),抗-HIV 試劑2(北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司),抗-TP 試劑1(DiaSorin S.p.A.UK Branch),抗-TP 試劑2(珠海麗珠試劑股份有限公司)。

1.2.2 SARS-CoV-2 血清學(xué)檢測(cè) 采用北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的新型冠狀病毒總抗體檢測(cè)試劑(批號(hào):NCOA20200204B、NCOA20200306B)、新型冠狀病毒IgG 抗體檢測(cè)試劑(批號(hào):NCOG20200306B)、新型冠狀病毒IgM 抗體檢測(cè)試劑(批號(hào):NCOM20200205B)。新型冠狀病毒刺突蛋白S1 結(jié)構(gòu)域的受體結(jié)合域(receptor binding domain,RBD 蛋白,35 KD)和核衣殼蛋白(Nucleocapsid,N 蛋白,47 KD)的重組蛋白購自義翹生物。實(shí)驗(yàn)室合成新型冠狀病毒受體結(jié)合蛋白(3 倍體RBD 蛋白,60-110 KD)。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG 二抗(索萊寶生物)。

1.2.3 血液篩查核酸檢測(cè) Procleix Ultrio Elite 檢測(cè)試劑,Procleix HIV-1、HCV、HBV Discriminatory Assay 鑒別試劑(Grifols,西班牙),MPX v2.0 HBV、HCV、HIV(1＋2 型)PCR-熒光法NAT 聯(lián)合檢測(cè)試劑(羅氏,美國),Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 test,version 2.0(羅氏,美國)。珀金埃爾默(PerkinElmer)新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒(RT-PCR)(提取試劑批號(hào):SBM20200301,擴(kuò)增試劑批號(hào):AY20200204/AY20200406)。

1.2.4 儀器 諾華全自動(dòng)NAT 平臺(tái)(PROCLEIX Tigris System,美國諾華),美國羅氏診斷公司cobas s 201 核酸CAP/CTM 檢測(cè)系統(tǒng),由全自動(dòng)混樣儀(HAMILTON Microlab STAR IVD,瑞士HAMILTON),核酸提取儀(cobas AmpliPrep)與分析儀(cobas TaqMan)組成。珀金埃爾默(PerkinElmer)高通量explorerTMG3 全自動(dòng)新冠病毒核酸檢測(cè)系統(tǒng)。FAME24/20 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀器(瑞士HAMILTON),Xantus 酶聯(lián)免疫加樣儀器(深圳愛康),酶標(biāo)儀(TECAN sunrise)。垂直電泳儀(165-8003)、電轉(zhuǎn)儀(170-3930)、凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD Gel Doc XR＋) 、半干轉(zhuǎn)儀器(1704150)均為美國伯樂。

1.3 方法

1.3.1 ELISA 方法檢測(cè)試驗(yàn)流程及判定規(guī)則 應(yīng)用檢測(cè)總抗體(total antibody,TAb)的ELISA 試劑篩查獻(xiàn)血者血漿,采血1 月后隨訪TAb 反應(yīng)性獻(xiàn)血者。對(duì)TAb 陽性獻(xiàn)血者標(biāo)本及隨訪標(biāo)本補(bǔ)充IgG、IgM 項(xiàng)目檢測(cè)及pVNT 項(xiàng)目檢測(cè)。操作方法和結(jié)果的判定均按照試劑說明書執(zhí)行?？贵w試劑檢測(cè)值與CUTOFF 比值大于1.0 經(jīng)雙孔復(fù)試,復(fù)試中有1 孔CUTOFF 比值大于1.0 則判為反應(yīng)性,復(fù)試均陰性則判定為陰性。

1.3.2 pVNT 此部分試驗(yàn)委托廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院完成[6]。應(yīng)用慢病毒包裝質(zhì)粒(psPAX2,Addgene＃12260)、SARS-CoV-2 S 蛋白表達(dá)質(zhì)粒(含有來自MN908947.3 菌株密碼子優(yōu)化的S 蛋白基因)和綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)報(bào)告載體構(gòu)建針對(duì)SARS-CoV-2 S 抗原(spike antigen) 的假型化慢病毒 (lentiviral pseudotype particle,LVpp)。選取H1299-ACE2hR 細(xì)胞進(jìn)行感染及中和試驗(yàn)。首先,LVpp 與連續(xù)稀釋總抗體陽性血漿(1 ∶10、1 ∶40、1 ∶160、1 ∶640、1 ∶2560、1 ∶10240)共同孵育1 h,孵育后,將上述血漿混合物100 μL 加入96 孔板細(xì)胞中,共培養(yǎng)36 h 后,應(yīng)用Operetta CLS 高通量儀器(PerkinElmer)成像觀察。采用Columbus軟件2.5.0(PerkinElmer)定量測(cè)定mNeonGreen(＋)細(xì)胞熒光,最后,比較陰性血漿對(duì)照孔與總抗體陽性試驗(yàn)孔mNeon-Green(＋)細(xì)胞減少率(%),對(duì)應(yīng)中和活性。通過4 參數(shù)logistic(4PL)回歸確定每個(gè)標(biāo)本的pVNT ID50(maximal dilution ratio at half-infection inhibition,ID50)值,即達(dá)到50%感染抑制所需的最大稀釋倍數(shù)。ID50>30 為判定中和抗體陽性的臨界值。采用此種方法制備成的假病毒有且僅有新冠病毒的外膜蛋白,其感染易感細(xì)胞完全依賴新冠病毒外膜蛋白介導(dǎo),且能被識(shí)別新冠病毒外膜蛋白的特異性抗體所阻斷中和。

1.3.3 Western Blot 方法檢測(cè)新冠特異性抗體 將商品化新冠N、S 重組蛋白以合適濃度免疫轉(zhuǎn)移至0.45μm 孔徑硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane,簡稱NC 膜)上。所有待確證血漿加入電泳緩沖液TBST,以1 ∶40 體積比稀釋,與轉(zhuǎn)印有重組蛋白的NC 膜室溫孵育3 h,PBST 洗3 次,每次8 min。NC 膜在1 ∶5 000 倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG 二抗中,室溫孵育2 h,PBST 洗3 次,每次8 min。膜條采用辣根過氧化物酶底物DAB(3,3-二氨基聯(lián)苯胺四氫氯化物)顯色。新冠N、S 重組蛋白相應(yīng)分子量區(qū)帶均顯色判為陽性,單獨(dú)N、S 重組蛋白條帶顯色為可疑陽性。

1.3.4 追蹤隨訪 采血1 月后追蹤TAb 陽性獻(xiàn)血者,問詢高危因素,采集血液檢測(cè)pVNT 及TAb、IgM、IgG 抗體、WB。采用系統(tǒng)隨機(jī)抽樣的方法,隨機(jī)抽取總抗體陽性的獻(xiàn)血者進(jìn)行隨訪。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 pVNT 試驗(yàn)陽性反應(yīng)和隨訪總抗體陽性反應(yīng),并且滿足pVNT 和IgG 同時(shí)陽性反應(yīng)的標(biāo)本才被判定為真陽性。

2 結(jié)果

2.1 DC 組和NC 組標(biāo)本的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 新冠康復(fù)者血漿(DC 組)TAb、IgG 全部(30/30)、pVNT、WB 方法學(xué)均呈陽性反應(yīng),IgM 有93.33%(28/30)呈陽性反應(yīng)?？偪贵w、IgG、IgM檢測(cè)的S/CO 值的±s 分別為15.30±1.94、13.8±3.79、12.21±10.67,pVNT 的半數(shù)感染抑制最大稀釋率ID50 范圍為30～1 378 910,±s 為72.55±2 447.42。新冠WB 試驗(yàn)結(jié)果見圖1,其中1～8 為NC 組標(biāo)本,全部為陰性結(jié)果,9～18 為DC 組標(biāo)本,N 蛋白條帶全部為陽性,1×RBD 蛋白條帶全部為陽性,3×RBD 蛋白條帶除9 號(hào)、14 號(hào)標(biāo)本略弱,其余全部為陽性。

圖1 不同組血漿標(biāo)本新冠WB 試驗(yàn)結(jié)果

2.2 PC 組及FC 組標(biāo)本及其追蹤標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果 8 632 人次獻(xiàn)血者標(biāo)本新冠核酸結(jié)果均陰性,檢出TAb 陽性獻(xiàn)血者34 名,其中,IgG 陽性5 名,IgM 陽性8 名,pVNT 試驗(yàn)陽性4例,WB 試驗(yàn)陽性2 例。1 個(gè)月后成功追蹤其中26 名,TAb 陽性獻(xiàn)血者21 名,其中,IgG 陽性獻(xiàn)血者4 名,IgM 陽性獻(xiàn)血者2名,pVNT 試驗(yàn)陽性2 例,WB 試驗(yàn)陽性2 例。結(jié)果見表1,2。

表1 新冠抗體ELISA 篩查34 例反應(yīng)性標(biāo)本不同項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果

2.3 PC 組中pVNT 陽性標(biāo)本及其追蹤標(biāo)本的一般信息 PC組中有4 例pVNT 陽性,追蹤TAb＋標(biāo)本中有2 例pVNT 陽性,均與2 例WB 陽性標(biāo)本重合。7 號(hào)和18 號(hào)標(biāo)本追蹤IgG的S/CO 值未升高,不符合抗體動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。7 號(hào)標(biāo)本及其追蹤WB 試驗(yàn)僅N 條帶陽性。18 號(hào)標(biāo)本的追蹤pVNT 檢測(cè)轉(zhuǎn)為陰性,兩者WB 試驗(yàn)各條帶均無反應(yīng)。12 號(hào)和33 號(hào)追蹤標(biāo)本IgG 的S/CO 值升高、IgM 值降低,符合抗體動(dòng)態(tài)改變。12 號(hào)標(biāo)本的追蹤pVNT 檢測(cè)也轉(zhuǎn)為陰性,但WB 一直為多條帶陽性。33 號(hào)標(biāo)本及其追蹤pVNT 及WB 結(jié)果一致陽性(表3)。

3 討論

準(zhǔn)確評(píng)估一般人群中新冠病毒抗體的流行率對(duì)控制流行病非常重要,但假陽性反應(yīng)結(jié)果會(huì)影響對(duì)流行病的評(píng)估。新冠流行早期,部分SARS-CoV-2 抗體試劑缺乏同時(shí)針對(duì)刺突蛋白(S1、S2)和核衣殼蛋白的檢測(cè)能力[7],pVNT 和其它中和試驗(yàn)也會(huì)產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。如何在新發(fā)再發(fā)傳染病大流行伊始,在診斷試劑尚未優(yōu)化提升時(shí),最大限度甄別ELISA 抗體篩查中假陽性標(biāo)本,不僅是對(duì)獻(xiàn)血人群的人文保護(hù)和尊重,更是為政策制定部門科學(xué)決策,控制疫情爆發(fā)于未然提供強(qiáng)有力的支持。

本研究中使用的總抗體主要是針對(duì)刺突蛋白S1 亞基的RBD 區(qū)設(shè)計(jì),可以最大限度地檢測(cè)疑似標(biāo)本。IgG 血清學(xué)檢測(cè)可以用于檢測(cè)既往感染。文中1 個(gè)月后對(duì)獻(xiàn)血者檢測(cè)TAb 和pVNT 均呈陽性反應(yīng),理論上在出現(xiàn)病癥的中位數(shù)14 d 就可以檢測(cè)到對(duì)病毒特異的IgG[8]。但是,即使最好的檢測(cè)試劑,第一類錯(cuò)誤和第二類錯(cuò)誤都是無法避免的。美國食品和藥品管理局(FDA)建議,如果流行率較低,試驗(yàn)室應(yīng)使用“正交測(cè)試算法”(即依次采用兩個(gè)獨(dú)立檢測(cè)方法)來確認(rèn)陽性檢測(cè)結(jié)果。2020 年3—4 月,深圳地區(qū)流行率較低,人群歸屬低危級(jí)別。此期間,8 632 人次深圳地區(qū)獻(xiàn)血者血漿中篩查出34 例TAb 反應(yīng)性,2 例pVNT 試驗(yàn)陽性、初次篩查和隨訪總抗體和IgG 均陽性,WB 結(jié)果陽性,可判定為真陽性,真陽性率只有0.024%。與費(fèi)雷等[9]以及廣州和其他國家和地區(qū)[10-14]的研究相比,深圳研究期間的真實(shí)流行率是非常低的。確證方法、流行階段以及初篩試劑性能都會(huì)顯著影響真實(shí)陽性率[4]。人群高流動(dòng)性對(duì)新冠疫情的監(jiān)測(cè)造成了巨大威脅,深圳采取了嚴(yán)格的疫情防控和檢疫隔離政策,為控制新型冠狀病毒感染傳播發(fā)揮了重要作用[12]。采取嚴(yán)格疫情防控地區(qū)人群從理論上講是低危人群,也導(dǎo)致了深圳普通人群抗體檢測(cè)較高假陽性率。

本文對(duì)獻(xiàn)血人群中初次篩查出的PC 組及其隨訪標(biāo)本,檢測(cè)了新冠特異性IgG、IgM、pVNT 以及新冠WB。在檢測(cè)之前,研究首先通過檢測(cè)PC 組標(biāo)本對(duì)試驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證。DC組標(biāo)本TAb、IgG、pVNT、WB 檢測(cè)結(jié)果均一致,試劑性能初步判斷可作為隨后的確證依據(jù)。其中WB 方法為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部建立,優(yōu)勢(shì)在于:在NC 膜上轉(zhuǎn)移多個(gè)病毒特異性抗原,觀測(cè)病毒蛋白特定大小區(qū)域條帶是否有反應(yīng),檢測(cè)相應(yīng)病毒特異性抗體,類似于人類免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)抗體的確證試驗(yàn)。判定這類病毒學(xué)驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部方法,早在2003 年非典后就有報(bào)道[15]。圖1 中,使用了新冠特異性N 蛋白,1×RBD 蛋白,3×RBD 蛋白,若某種蛋白在低危人群中假陽性率較高,但多個(gè)病毒特異性蛋白同時(shí)檢測(cè),規(guī)定多個(gè)蛋白均有反應(yīng)判為陽性,可提高診斷的特異性,大幅減少假陽性反應(yīng)。

在非SARS-CoV-2 感染患者甚至健康對(duì)照組的血清標(biāo)本中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有假陽性反應(yīng)或交叉反應(yīng)現(xiàn)象,涉及多種因素。首先,β 冠狀病毒與SARS-CoV-2 的血清學(xué)交叉反應(yīng),是基于它們的蛋白質(zhì)具有同源性序列。SARS-CoV-2 和非典型肺炎病毒(SARS-CoV)具有高度同源性(同源性76%,相似性87%),其次是中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)、人冠狀病毒OC43(HCoV-OC43)和人冠狀病毒HKU1(HCoVHKU1),均與SARS-CoV-2 高度同源。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)SARSCoV-2 和SARS/MERS-CoV 抗體之間的交叉反應(yīng)最強(qiáng),這是因?yàn)樗鼈兊拇掏坏鞍字g的序列和結(jié)構(gòu)同源性最高[16,17]。SARS-CoV-2 抗體可以識(shí)別出暴露在病毒衣殼表面的4 種SARS-CoV-2 蛋白中的3 種:包括核衣殼(N)、包膜(E)、刺突(S)蛋白[8]。SARS-CoV-2 S 蛋白是由S1 和S2 亞基組成,分別介導(dǎo)附著和進(jìn)入靶細(xì)胞。有研究報(bào)道SARS-CoV-2 S2 亞基和N 蛋白中比S1 亞基有更多的保守的抗原表位,最終導(dǎo)致在人冠狀病毒陽性患者血清中有更多的交叉反應(yīng)[10,18]。然而,另1 項(xiàng)研究報(bào)道,“普通感冒”相關(guān)的人類季節(jié)性流感病毒(比如HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-HKU-1、HCoVNL63)與我們的檢測(cè)并不會(huì)引起明顯的交叉反應(yīng)[19]。本研究表1 和表2 中多種檢測(cè)方法對(duì)ELISA 檢測(cè)結(jié)果結(jié)果不一致的原因,可能與使用的檢測(cè)分析系統(tǒng)差異或者被調(diào)查的人群不同有關(guān),所以更加凸顯探索新發(fā)再發(fā)傳染病確證方法的意義[20]。

表2 新冠抗體ELISA 篩查反應(yīng)性標(biāo)本26 例追蹤標(biāo)本不同項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果

表3 中,因TAb 陽性PC 組中4 例pVNT 陽性標(biāo)本及FC組2 例pVNT 陽性標(biāo)本,均與2 例WB 陽性標(biāo)本重合,所以列表分析這4 例標(biāo)本的特點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),18 號(hào)標(biāo)本的追蹤pVNT 檢測(cè)轉(zhuǎn)為陰性,PC 組和FC 組兩標(biāo)本W(wǎng)B 試驗(yàn)各條帶均無反應(yīng),考慮到TAb 的S/CO 值并不高,IgG 始終陰性,推測(cè)本研究中pVNT 試驗(yàn)也存在假陽性情況。7 號(hào)標(biāo)本及其追蹤標(biāo)本IgG 均陰性,盡管pVNT 檢測(cè)結(jié)果均為陽性,但考慮到WB 試驗(yàn)僅N 條帶陽性,同時(shí)問卷調(diào)查中該獻(xiàn)血者近期有EB 病毒感染史,推測(cè)該標(biāo)本pVNT、WB 試驗(yàn)結(jié)果受影響導(dǎo)致假陽性。12 號(hào)和33 號(hào)追蹤IgG 的S/CO 值升高、IgM 值降低,綜合pVNT、WB 試驗(yàn)結(jié)果符合抗體動(dòng)態(tài)改變,所以判定為真陽性標(biāo)本。本研究認(rèn)為在新發(fā)再發(fā)傳染病大流行伊始,應(yīng)綜合多種診斷試劑結(jié)果,病毒特異性pVNT 中和抗體主要用于監(jiān)測(cè)免疫反應(yīng)和疫苗效價(jià),多條帶WB 試驗(yàn)結(jié)果用于判斷多種抗體產(chǎn)生情況,同時(shí)依據(jù)抗體動(dòng)態(tài)演變規(guī)律,結(jié)合人群流行率和人口流動(dòng)情況,共同確證ELISA 抗體篩查中假陽性標(biāo)本。

表3 pVNT 陽性標(biāo)本及其追蹤情況

此外,除了考慮病毒特征性抗體演變邏輯和宿主免疫外,問卷調(diào)查也有助于提高我們對(duì)疾病傳播的了解。但是,由于本研究標(biāo)本數(shù)量有限,篩選出的陽性樣品數(shù)量較少,所以,雖然有一定的結(jié)果但不能完全通過結(jié)果來斷定其結(jié)論,會(huì)有很多未知潛在干擾因素導(dǎo)致假陽性反應(yīng)。今后需要在更大數(shù)量的標(biāo)本中,進(jìn)行深入細(xì)致研究,以提高新發(fā)再發(fā)病原體抗體監(jiān)測(cè)的準(zhǔn)確性。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。