UPLC法分析比較梔子和水梔子中主要成分的含量

蔡曉洋，劉聰，李敏

梔子為茜草科植物梔子（Gardenia jasminoidesEllis）的干燥成熟果實，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒的功效[1]。研究表明，梔子中含量較高的主要是環(huán)烯醚萜類和西紅花苷類成分，其代表成分是梔子苷和西紅花苷-1、西紅花苷-2。其中梔子苷具有保肝利膽、降血糖、抗氧化、抗腫瘤等作用，西紅花苷-1、西紅花苷-2成分具有抗動脈粥樣硬化、抗血栓、抗炎等作用，這二者均為梔子中最主要的有效成分[2-5]。

水梔子為茜草科植物水梔子（G·jasminoides ElIis var·grandiflora Nakai）的成熟果實，是梔子的變種，自古以來多不作藥用，主要用于工業(yè)上的染料和色素[6,7]。但研究發(fā)現(xiàn)，水梔子在化學(xué)成分上與梔子極為相似[8]，且有藥理研究表明，水梔子與梔子一樣具有利膽抗炎作用，且利膽作用較梔子更強[9]。而在栽培上，水梔子結(jié)果率更高、果實長而大，產(chǎn)量遠(yuǎn)高于梔子。因此，水梔子應(yīng)有較好的藥用開發(fā)前景。

近年來，國內(nèi)針對梔子與水梔子的對比研究主要集中在藥理、鑒別、梔子苷的含量方面[9-12]，而關(guān)于梔子苷和西紅花苷-1、西紅花苷-2等多個成分和主要成分的含量對比研究鮮見報道。本研究首次采用UPLC法對梔子和水梔子中的主要成分進(jìn)行含量測定和分析對比，為充分開發(fā)利用水梔子的藥用價值提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

美國Waters ACQUITY UPLC H-Class System（包括四元高壓泵系統(tǒng)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、TUV檢測器、Empower色譜工作站）；BP-12l s精密電子天平（浙江精密儀器有限公司）；KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

乙腈為色譜純，水為超純水， 其余試劑均為分析純；梔子苷對照品（批號130428，純度≥98%）購自四川省維克奇生物科技有限公司；西紅花苷-1對照品（111588-201202）、西紅花苷-2對照品（111589-201304）均購自中國食品藥品檢定研究院。

梔子、水梔子果實共收集15批（見表4），分別經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)李敏教授鑒定為茜草科植物梔子（Gardenia jasminoidesEllis）和水梔子（G·jasminoides ElIis var·grandigflora Nakai）的成熟果實，所有樣品經(jīng)統(tǒng)一的方法加工并干燥。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1X50 mm，1.7 μm)，流動相乙腈（A）—水（B）；梯度洗脫：0～5 min（5%～20%A），5～10 min（20%～30%A），10～15 min（30%～5%A）；檢測波長240 nm(0～5min)，440 nm(5～15 min)；流速0.3 mL·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱定梔子苷、西紅花苷-1、西紅花苷-2適量，加甲醇溶解，制成梔子苷（161.6 μg·mL-1）、西紅花苷-1（32.64 μg·mL-1）、西紅花苷-2（10.5 μg·mL-1）的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取各樣品粉末（過4號篩）約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲40 min，放冷，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，0.22 μm濾膜濾過，取濾液即得。

2.4 線性關(guān)系考察

將混合對照品溶液分別稀釋2,4,8,16倍，制成不同質(zhì)量濃度的系列溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，分別以對照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，得相應(yīng)的回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5 精密度試驗

取同一供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計算得到梔子苷、西紅花苷-1和西紅花苷-2的色譜峰面積的RSD分別為0.20%，0.36%，0.65%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取梔子和水梔子樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、16、24 h按“2.1”項下色譜條件測定各指標(biāo)成分含量，以峰面積值為指標(biāo)考察方法中的樣品穩(wěn)定性，梔子樣品中梔子苷、西紅花苷-1、西紅花苷-2的RSD分別為0.22%、0.64%、1.07%，水梔子樣品的梔子苷、西紅花苷-1、西紅花苷-2的RSD分別為0.35%、0.59%、0.76%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

分別取同一批次的梔子和水梔子樣品各6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件測定，計算得到梔子樣品中梔子苷、西紅花苷-1和西紅花苷-2的色譜峰面積的RSD分別為0.45%，0.57%，0.96%，水梔子分別為0.52%，0.49%，0.78%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收試驗

分別取已測定的梔子和水梔子樣品粉末各6份（每份0.05 g），精密稱定，每份加入相同量的梔子苷、西紅花苷-1和西紅花苷-2對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算回收率，結(jié)果見表2，表3，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

圖1 UPLC色譜圖A.混合對照品；B.水梔子；C.梔子；1.梔子苷；2.西紅花苷-1；3.西紅花苷-2

表2 梔子樣品的3種成分回收率實驗（n=6）

表3 水梔子樣品的3種成分回收率實驗（n=6）

2.9 樣品測定

取所收集的15批樣品，分別稱取粉末約0.1 g，精密稱定，按“2.3”項下方法操作，制備樣品供試品溶液，每個批號3份，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，并計算樣品中3種成分的含量，以均值作為最終結(jié)果，結(jié)果見表4。

表4 樣品的成分測定結(jié)果(n=3)

測定結(jié)果顯示，梔子與水梔子中梔子苷的含量分別在2.36%～5.98%，6.14%～7.81%，均高于藥典規(guī)定的1.8%，西紅花苷-1和西紅花苷-2的總含量分別在0.84%～1.47%，1.28%～1.49%。水梔子的梔子苷含量與西紅花苷-1、西紅花苷-2總含量普遍比梔子高，其中梔子苷含量最高可達(dá)3倍。

3 討論

通過對乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-水等多個洗脫系統(tǒng)進(jìn)行比較，結(jié)果表明乙腈-水可很好的將3個成分分離。在樣品處理中考察了不同濃度的甲醇和乙醇等多種提取溶媒，同時考察了不同時間的超聲提取，最終確定了色譜條件和樣品制備方法。

本研究采用UPLC方法同時進(jìn)行梔子苷、西紅花苷-1和西紅花苷-2含量測定，與傳統(tǒng)HPLC方法相比，明顯縮短了出峰時間，僅為HPLC時間的1/3～1/4，且還具有檢測效率高、靈敏度高、精密度好、重現(xiàn)性強、進(jìn)樣體積小、溶劑消耗少等優(yōu)勢。本方法快速、簡便、準(zhǔn)確，可用于梔子藥材和水梔子的多指標(biāo)、多成分檢測和質(zhì)量控制。

梔子與水梔子的含量測定結(jié)果表明：水梔子在梔子苷含量和西紅花苷-1、西紅花苷-2總含量上均高于梔子，這與HPLC法和薄層層析-紫外分光光度法分析比較梔子與水梔子中含量差異的研究結(jié)果是一致的[7,8,11]。因此，水梔子在主要化學(xué)成分含量上確實高于梔子，從此觀點來看，若要進(jìn)行藥用資源開發(fā)，尚需進(jìn)一步結(jié)合藥理和臨床療效方面的對比研究。