枸杞多糖對阿爾茨海默病合并2型糖尿病小鼠學習記憶能力及腦內(nèi)Tau蛋白磷酸化水平的影響

葉紅霞　賀穎西　齊妍強　楊光　屈祖衛(wèi)　胡艷麗

摘要：目的 探討枸杞多糖（LBP）對阿爾茨海默?。ˋD）合并2型糖尿病（T2DM）小鼠學習記憶能力及腦內(nèi)Tau蛋白磷酸化水平的影響。方法 5月齡C57BL/6J小鼠16只隨機分為對照組、T2DM組，同月齡APP/PS1小鼠32只隨機分為AD組、AD+T2DM組、LBP組（100 mg·kg-1）、多奈哌齊組（0.75 mg·kg-1），每組各8只。T2DM組、AD+T2DM組、LBP組、多奈哌齊組小鼠高糖高脂飼料聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素建立T2DM模型。治療組以相應劑量藥物干預，其余組給予等體積生理鹽水。連續(xù)給藥3個月后，Morris水迷宮實驗評價各組小鼠學習記憶能力，HE染色觀察各組小鼠腦組織細胞形態(tài)變化，Western Blot檢測各組小鼠腦內(nèi)不同位點磷酸化Tau蛋白及GSK3β蛋白的表達水平。結果 LBP可縮短AD+T2DM模型小鼠逃避潛伏期、第一次穿越平臺時間（P<0.05，P<0.05），增加穿越平臺次數(shù)及目標象限停留時間（P<0.01，P<0.01），改善大腦皮層神經(jīng)元形態(tài)損傷，降低皮層及海馬Tau蛋白Ser404、Ser396及Ser199位點磷酸化水平（P<0.05，P<0.05，P<0.05；P>0.05，P<0.01，P<0.01）和GSK-3β及Tyr216位點磷酸化水平（P>0.05，P<0.01；P<0.01，P<0.01），提高GSK-3β蛋白Ser9位點磷酸化水平（P<0.01，P<0.05）。結論 枸杞多糖可改善AD+T2DM模型小鼠的學習記憶能力，降低腦內(nèi)Tau蛋白的磷酸化水平。

關鍵詞：枸杞多糖；阿爾茨海默??；2型糖尿??；Tau蛋白磷酸化；糖原合成激酶-3β

中圖分類號：R749.1中圖分類號文獻標志碼：A文獻標識碼

Effect of Lycium barbarum polysaccharides on learning and memory ability and

Tau protein phosphorylation level in brain withAlzheimers disease and type

2 diabetes mellitus mice

YE? Hongxia，HE? Yingxi，QI? Yanqiang，YANG? Guang，QU? Zuwei，HU? Yanli*

（Department of Phamacy， Shihezi University/Key Laboratory of Xingjiang Phytomedicine Resources Utilization， Ministry of Education， Shihezi，Xinjiang

832000， China）

Abstract： ?Objective To investigate the effect of Lycium barbarum polysaccharide（LBP）on learning and memory ability and brain Tau protein phosphorylation level in mice with Alzheimer s disease（AD）and type 2 diabetes mellitus（T2DM）. Methods Sixteen 5-month-old C57BL/6J mice were randomly divided into control group and T2DM group， thirty-two APP/PS1 mice of the same age were randomly divided into AD group， AD+T2DM group， LBP group（100 mg·kg-1）and donepezil group（0.75 mg·kg-1）， with 8 mice in each group. T2DM group， AD+T2DM group， LBP group and donepezil group were fed with high glucose and high fat diet combined with intraperitoneal injection of streptozotocin to establish T2DM model. The treatment group was intervened with corresponding doses of drugs， and the same volume of normal saline was given to the treatment group. After 3 months of continuous administration， Morris water maze test was used to evaluate the learning and memory ability of mice in each group. HE staining was used to observe the morphological changes of brain tissue cells in each group. Western Blot was used to detect the phosphorylation levels of Tau protein and GSK-3β protein at different sites in the brain of mice in each group. Results LBP could shorten the escape latency， the first crossing platform time（P<0.05， P<0.05）， increase the number of crossing platforms and the target quadrant residence time（P<0.01， P<0.01）of AD+T2DM model mice. Improvement of nuclear condensation and vacuoles in cerebral cortex neurons. Reduced phosphorylation of Tau protein Ser404， Ser396 and Ser199 in cortex and hippocampus（P<0.05， P<0.05， P<0.05; P>0.05， P<0.01， P<0.01）、decreased the phosphorylation levels of GSK-3β and Tyr216 in cortex and hippocampus（P>0.05， P<0.01; P<0.01， P<0.01）and increased the phosphorylation level of Ser9 site（P<0.01， P<0.05）. Conclusion LBP can improve the learning and memory ability of AD+T2DM model mice and reduce the phosphorylation level of Tau protein in the brain.

Key words： lycium barbarum polysaccharide;Alzheimers disease;Type 2 diabetes;Tau protein phosphorylation;glycogen synthase kinase-3β

隨著人口老齡化的加劇及生活條件的改善，阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease， AD）與2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus， T2DM）的患病率呈直線上升趨勢［1-2］。AD是一種常見的中樞神經(jīng)退行性疾病，其病因復雜，假說眾多［3］。其中，Tau蛋白學說是主要的AD發(fā)病機制假說之一［4］。相關研究表明，神經(jīng)元中過度磷酸化的Tau蛋白形成的神經(jīng)原纖維纏結（neurofifibrillary tangles， NFTs）數(shù)量與AD患者的癡呆程度呈正相關，其已成為國際公認評價AD病理進程的標準之一［5-6］。流行病學研究發(fā)現(xiàn)，T2DM是AD發(fā)生的危險因素之一［7］，T2DM患者罹患AD的風險是正常人群的1.5～2.5倍［8］，且Tau蛋白的磷酸化程度是T2DM罹發(fā)AD的關鍵因素［9］。因此，降低腦內(nèi)Tau蛋白磷酸化水平可能成為一種預防及治療AD合并T2DM認知障礙的有效策略。

枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide， LBP）是枸杞果實中提取的主要有效成分之一，具有良好的抗衰老、抗氧化以及神經(jīng)保護作用［10-11］。研究發(fā)現(xiàn)，LBP能夠改善AD模型小鼠學習記憶能力、減少海馬組織內(nèi)Aβ1-42的含量［12］，還可改善鏈脲佐菌素誘導糖尿病大鼠的認知功能損傷［13］。但目前還未有相關研究報道其對AD合并T2DM小鼠學習記憶能力的影響?；谝陨涎芯?，本實驗采用APP/PS1轉基因小鼠給與高糖高脂飼料聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素構建AD合并T2DM小鼠模型，初步探討了LBP對AD合并T2DM小鼠學習記憶能力及腦內(nèi)Tau蛋白磷酸化水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

1.1.1 實驗動物

本實驗選用5月齡C57BL/6J遺傳背景的APP/PS1（（APPswe， SEN1d E9） 85Dbo）小鼠32只、同月齡C57BL/6J小鼠16只，雌雄各半，體重23～26 g，購自南京君科生物工程有限公司（SPF級，合格證號：20180006018886）。實驗期間自由攝食飲水，12 h明暗交替照明，所有實驗均照實驗規(guī)定進行，操作和管理均遵守《實驗動物管理條例》。

1.1.2 儀器

安穩(wěn)+型血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司）；DMS-2型Morris水迷宮實驗裝置（中國醫(yī)學科學院藥物研究所）；DB-09型石蠟包埋機（湖北德森科技有限公司）；RM2245型石蠟切片機（德國徠卡公司）；Axio Imager A2正置顯微鏡（德國蔡司公司）；4503R型低溫高速離心機（Eppendorf公司）；蛋白含量測定儀（美國Quawell公司）；電泳儀、電轉儀（美國BIO-RAD公司）；UVP 化學發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Ultra-Violet）。

1.1.3 實驗藥品與主要試劑

枸杞多糖（LBP，含量≥90 %，南京景竹生物科技有限公司，批號：JZ21042710）；鹽酸多奈哌齊（衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司，批號：2102079）；60 %高糖高脂鼠糧、10 %低脂鼠糧（Dyets，批號：20210621）；鏈脲佐菌素（STZ，SIGMA S0130）；0.1 mol·L-1 pH4.4檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（源葉，批號：J11GR154622）；伊紅、蘇木精染液；p-Tau（Ser404）兔多克隆抗體、p-Tau（Ser396）鼠多克隆抗體、GSK3β鼠多克隆抗體、p-GSK3β（Ser9）兔單克隆抗體（Cell Signaling technology，批號：#11837S、#9632S、#9832S、#9336S）；p-Tau（Ser199）兔單克隆抗體（life technologies，批號：786604E）；p-GSK3β（Tyr216）兔單克隆抗體（Santa Cruz Blotechnology，批號：F0811）；GAPDH小鼠單克隆抗體、辣根酶標記山羊抗小鼠/兔lgG（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：210041028、214801119、229760105）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、模型建立及給藥

5月齡C57BL/6J小鼠16只隨機分為對照組、T2DM組，同月齡APP/PS1 小鼠32只，隨機分為AD組、AD+T2DM組、LBP組、多奈哌齊組，每組8只。T2DM組、AD+T2DM組、LBP組和多奈哌齊組的小鼠持續(xù)給與60 %高糖高脂鼠糧1個月后，禁食不禁水12 h，連續(xù)4 d腹腔注射60 mg·kg-1鏈脲佐菌素（0.1 mol·L-1 pH4.4檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配置），72 h后測量空腹血糖值（FBG），以FBG≥11.1 mmol·L-1作為T2DM成模標準，建立T2DM模型；對照組及AD組小鼠給與10 %低脂鼠糧，腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。給藥組分別給與LBP 100 mg·kg-1、多奈哌齊0.75 mg·kg-1，其它組給予等體積生理鹽水，連續(xù)給藥3個月。

1.2.2 Morris水迷宮實驗

灌胃給藥3個月后，Morris水迷宮實驗檢測各組小鼠的學習記憶能力。實驗期間，水溫需保持（22 ± 2）℃，保持光線穩(wěn)定、環(huán)境安靜。Morris水迷宮實驗分為定位航行實驗與空間探索實驗。第一天至第五天為定位航行試驗，記錄小鼠在120 s內(nèi)找到平臺的時間即逃避潛伏期，若小鼠在120 s內(nèi)未找到平臺則其逃避潛伏期為120 s，每只小鼠訓練完畢后不論是否找到平臺均將之放于平臺上學習15 s，每天分別從平臺相鄰相對象限入水學習兩次；第六天進行空間探索試驗，撤去平臺，檢測小鼠相對象限入水后第一次穿越平臺時間及120 s內(nèi)穿越平臺的次數(shù)。

1.2.3 樣本收集

行為學實驗結束后，各組隨機選取5只動物，深度麻醉經(jīng)心臟灌注后在低溫環(huán)境下取出腦組織，取左半腦在4 %多聚甲醛中固定1周后進行石蠟包埋，分離剩余小鼠海馬和皮層組織，儲存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 HE染色

石蠟包埋的腦組織連續(xù)冠狀切片，切片厚4 μm。68 ℃ 烤片15 min（不超過30 min），依次進行二甲苯脫蠟，梯度乙醇洗脫，自來水沖洗，蘇木素染色5 min，自來水沖洗切片至水接近無色透明。酸酒精分化3～5 s，自來水沖洗3次，水中返藍5 min。0.5 %伊紅染色6～8 s，水洗之后進行乙醇脫水，二甲苯透明，自然晾干后封片。顯微鏡下拍攝腦組織海馬和皮層區(qū)的神經(jīng)元形態(tài)，評價LBP對阿爾茨海默病合并2型糖尿病小鼠腦組織形態(tài)學損傷的改善作用。

1.2.5 Western Blot檢測腦組織p-Tau（Ser404、Ser396、Ser199）、GSK3β、p-GSK3β（Ser9、Tyr216）蛋白表達水平

精確稱取適量皮層或海馬組織，加入RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，機械勻漿后離心取上清（總蛋白），通過蛋白測定儀Q5000測定蛋白濃度。加入4×上樣緩沖液和電泳液，配制成5 μg·μL-1蛋白樣品。蛋白變性后進行SDS-PAGE凝膠電泳，將目的蛋白轉至 PVDF膜后室溫封閉1 h，一抗（1∶1 000）4 ℃ 隔夜孵育，第二天將PVDF膜置于HRP標記的相應種屬二抗稀釋液（1∶10 000）中室溫孵育一小時，UVP 化學發(fā)光檢測儀收集曝光條帶圖像。

1.2.6 統(tǒng)計學分析

使用Image J軟件對Western Blot實驗條帶進行灰度值分析，SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。其中，Morris水迷宮實驗中定位航行實驗數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析（two-way ANOVA），其它實驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（one-way ANOVA），結合LSD檢驗法，比較各組間差異，結果以均值±標準差（± SD）表示，P<0.05有統(tǒng)計學意義，P<0.01有極顯著性差異，使用Origin 2021作圖。

2 結果

2.1 Morris水迷宮

各組小鼠游泳軌跡軌跡圖如圖1所示。

定位航行實驗結果表明，與對照組相比，AD組、T2DM組及AD+T2DM組小鼠逃避潛伏期均有所增加（P<0.01，P<0.05，P<0.01），提示AD組、T2DM組及AD+T2DM組小鼠有不同程度的空間學習障礙；與AD+T2DM組小鼠相比，LBP組與多奈哌齊組小鼠逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05，P<0.01）（表1）。

空間探索實驗結果顯示，與對照組相比，AD組、T2DM組、AD+T2DM組小鼠第一次穿越平臺時間明顯增長（P<0.05，P<0.05，P<0.01）、穿越平臺次數(shù)均明顯減少（P<0.01）、目標象限游泳距離明顯縮短（P<0.01，P<0.05，P<0.01），AD組及AD+T2DM組小鼠目標象限停留時間均明顯縮短（P<0.01），說明AD組、T2DM組及AD+T2DM組小鼠記憶能力有不同程度的降低（圖2）；與AD+T2DM組相比，LBP組和多奈哌齊組小鼠第一次穿越平臺時間明顯縮短（P<0.05）、穿越平臺次數(shù)明顯增多（P<0.01）、目標象限停留時間明顯增長（P<0.05，P<0.01），多奈哌齊組目標象限游泳距離明顯增長（P<0.05）（圖2）。以上結果提示，LBP可在一定程度上改善AD合并T2DM小鼠的學習記憶能力。

2.2 LBP對阿爾茨海默病合并2型糖尿病小鼠腦組織病理學改變的影響

通過HE染色觀察各組小鼠大腦皮層神經(jīng)元細胞的的形態(tài)變化。與對照組相比，AD組、T2DM組、AD+T2DM組小鼠大腦皮層神經(jīng)元均出現(xiàn)不同程度的細胞核固縮、核仁消失、空泡性變性；AD+T2DM模型小鼠經(jīng)過LBP與多奈哌齊給藥干預后，神經(jīng)元細胞空泡減少，結構均有不同程度的改善（圖3）。提示LBP可在一定程度上改善阿爾茨海默病合并2型糖尿病小鼠大腦皮層神經(jīng)元細胞的病理損害。

2.3 LBP對阿爾茨海默病合并2型糖尿病小鼠腦內(nèi)p-Tau（Ser404、Ser396、Ser199）、GSK3β、p-GSK3β（Ser9、Tyr216）蛋白表達水平的影響

Western Blot檢測各組小鼠大腦皮層及海馬組織中Tau蛋白Ser404、Ser396、Ser199位點磷酸化水平，結果如圖4A、圖4B所示。

與對照組相比，AD組、T2DM組、AD+T2DM組大腦皮層及海馬Tau蛋白Ser404、Ser396、Ser199位點磷酸化水平均有不同程度的升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；經(jīng)LBP給藥后，AD+T2DM模型小鼠皮層Tau蛋白Ser404、Ser396及Ser199位點磷酸化水平明顯降低（P<0.05）、海馬Tau蛋白Ser396及Ser199位點磷酸化水平顯著降低（P<0.01）（圖4C～圖4E）。LBP可降低AD合并T2DM小鼠大腦皮層及海馬組織Tau蛋白Ser404、Ser396和Ser199位點磷酸化水平，從而發(fā)揮保護神經(jīng)元、改善AD合并T2DM小鼠學習記憶能力的作用。

Western Blot檢測各組小鼠大腦皮層及海馬組織中GSK3β、p-GSK3β（Ser9）、p-GSK3β（Tyr216）蛋白表達水平結果顯示（圖5A，圖5B），與對照組相比，AD組與T2DM組海馬GSK3β蛋白表達水平明顯升高（P<0.05）、AD+T2DM組小鼠皮層及海馬GSK3β蛋白表達水平明顯升高（P<0.05）（圖5C）；p-GSK3β（Ser9）蛋白表達水平在AD及T2DM組小鼠大腦皮層和海馬、AD+T2DM組海馬中明顯降低（P<0.05），在AD+T2DM組皮層中顯著降低（P<0.01）（圖5D）；p-GSK3β（Tyr216）蛋白表達水平在AD組小鼠皮層與海馬中明顯升高（P<0.05），而在T2DM組及AD+T2DM組中顯著升高（P<0.01）（圖5E）。與AD+T2DM組相比，LBP組與多奈哌齊組皮層及海馬GSK3β蛋白表達水平有所降低（P>0.05，P<0.01；P<0.01，P<0.05）、皮層p-GSK3β（Ser9）蛋白表達水平有所升高（P<0.01，P<0.05）、皮層及海馬p-GSK3β（Tyr216）蛋白表達水平顯著降低（P<0.01）。以上結果提示，LBP可降低阿爾茨海默病合并2型糖尿病小鼠皮層及海馬組織中升高的GSK3β、p-GSK3β（Tyr216）蛋白表達水平并提高其皮層和海馬組織中降低的p-GSK3β（Ser9）蛋白表達水平。

3 討論

AD是一種與年齡密切相關的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為進行性記憶功能衰退、學習能力下降、認知行為障礙及其它神經(jīng)精神癥狀。大量研究證實， T2DM發(fā)生認知功能障礙的風險相比正常人顯著增加， T2DM和各種類型癡呆的發(fā)生均具有很強相關性［14］。更有臨床研究顯示，AD 患者往往也會患有T2DM，二者存在著一定的相關性［15］。評價動物學習記憶功能的行為學測試方法有多種，其中，Morris水迷宮實驗是一項針對嚙齒動物空間學習記憶能力檢測的經(jīng)典實驗，可用來評價各組小鼠的學習記憶能力。本實驗結果顯示，AD組、T2DM組及AD+T2DM組小鼠學習記憶能力均出現(xiàn)不同程度的下降，其中，AD+T2DM組學習記憶能力最差，而LBP改善了AD合并T2DM模型小鼠的學習記憶能力。

相關研究顯示，T2DM與AD在發(fā)病過程、病理變化、臨床表現(xiàn)和預后等方面有著很多的相似性［7］。其中，Tau蛋白過度磷酸化形成神經(jīng)原纖維纏結（neurofifibrillary tangles， NFTs）是AD與T2DM共有的病理學特征之一［16-17］。Tau蛋白是神經(jīng)元主要的微管相關蛋白，其主要功能是結合到微管蛋白上，促進微管蛋白組裝成微管并穩(wěn)定微管的結構［18］。研究發(fā)現(xiàn)，Tau蛋白的過度磷酸化與認知功能障礙的產(chǎn)生密切相關［19-20］。當tau蛋白發(fā)生異常水平的磷酸化后產(chǎn)生的病理性聚集將會影響微管的穩(wěn)定性，引起神經(jīng)元結構和功能的破壞，導致大腦認知功能障礙，而使用磷酸化Tau蛋白聚集抑制劑可有效改善人或動物的認知功能障礙［21］。本實驗結果顯示，AD組、T2DM組及AD+T2DM組小鼠腦內(nèi)Tau蛋白Ser404、Ser396、Ser199位點磷酸化水平均明顯升高，神經(jīng)元產(chǎn)生了不同程度的病理性損傷，其中，AD+T2DM組小鼠腦內(nèi)Tau蛋白磷酸化程度最大、大腦皮層神經(jīng)元損傷最嚴重；經(jīng)LBP治療后，AD合并T2DM模型小鼠腦內(nèi)Tau蛋白磷酸化水平降低、大腦皮層神經(jīng)元損傷減少。以上結果提示，LBP可抑制AD合并T2DM模型小鼠腦內(nèi)Tau蛋白的過度磷酸化，保護大腦神經(jīng)元。

研究表明［22］Tau蛋白的磷酸化受蛋白激酶和蛋白磷酸酶的雙重調(diào)節(jié)，其中，糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β， GSK-3β）是重要的蛋白激酶之一，在調(diào)節(jié)腦內(nèi)Tau蛋白Ser404、Ser396、Ser199等多個位點磷酸化水平中發(fā)揮了關鍵的作用。而GSK-3β在Ser9位點磷酸化后使GSK-3β活性降低、抑制Tau蛋白磷酸化，Tyr216位點磷酸化則可使其活性增強并促進Tau蛋白磷酸化［23］。為進一步明確LBP降低AD合并T2DM小鼠腦內(nèi)Tau蛋白磷酸化水平的作用機制，本實驗進一步檢測了GSK-3β蛋白表達水平及其Ser9、Tyr216位點磷酸化水平。與對照組相比，AD組、T2DM組及AD+T2DM組小鼠腦內(nèi)GSK-3β蛋白及其Tyr216位點磷酸化水平均有不同程度的升高、Ser9位點磷酸化水平有所降低，且AD+T2DM組變化最大。LBP可降低AD合并T2DM模型小鼠Tyr216位點磷酸化水平、提高Ser9位點磷酸化水平，降低GSK-3β蛋白在腦內(nèi)的表達水平。以上結果提示，LBP可以通過調(diào)節(jié)AD合并T2DM模型小鼠腦內(nèi)GSK-3β在Ser9位點及Thr216位點的磷酸化水平，降低GSK-3β蛋白表達水平，從而抑制Tau蛋白磷酸化。

綜上所述，LBP可調(diào)節(jié)AD合并T2DM模型小鼠腦內(nèi)GSK-3β蛋白Ser9、Thr216位點的磷酸化，降低GSK-3β蛋白表達水平，抑制Tau蛋白磷酸化，從而改善模型小鼠學習記憶功能障礙及神經(jīng)元損傷。

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（責任編輯：編輯唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2022-08-28

基金項目：國家自然科學基金項目（81960665）

作者簡介：葉紅霞（1997—），女，碩士研究生，專業(yè)方向為神經(jīng)藥理學研究。

*通信作者：胡艷麗（1976—），女，教授，從事神經(jīng)藥理學研究，e-mail： wzx330@163.com。