E2F表達(dá)與肝癌患者預(yù)后及免疫浸潤的相關(guān)性分析

劉程豪　卓怡呈　楊晨　喬世源　卜媛媛　吳向未

摘要：目的 探討E2F基因與肝癌患者的預(yù)后關(guān)系及其作為肝癌標(biāo)志物的可能性。方法 GENT2 數(shù)據(jù)庫用于評估 E2F基因在肝癌中的表達(dá)。生存分析和 Cox 分析提示 E2F基因的預(yù)后價(jià)值。使用 STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建包含 40 個(gè)最相似基因和 E2F1-8 的基因網(wǎng)絡(luò)。TIMER數(shù)據(jù)庫用于分析 E2F基因表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤之間的相關(guān)性。cBioPortal數(shù)據(jù)庫分析E2F1-8的基因突變情況。GEO數(shù)據(jù)集用于驗(yàn)證 E2F5 的表達(dá)差異。UALCAN、MEXPRESS、GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫中甲基化信息用于分析E2F5的表達(dá)與啟動子甲基化之間的相關(guān)性，并通過人類肝癌細(xì)胞系進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 E2F1-8在肝癌組織中均高表達(dá)。晚期肝癌患者E2F1-3 和E2F5-8的轉(zhuǎn)錄水平與總生存率（OS）呈正相關(guān)。多因素分析顯示，高水平的E2F5 表達(dá)是肝癌患者OS縮短的獨(dú)立預(yù)后因素。E2F5/7在肝癌中的表達(dá)與腫瘤誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)激活和免疫浸潤有關(guān)。E2F5在腫瘤組織中高表達(dá)與基因突變及啟動子甲基化水平相關(guān)。結(jié)論 E2F5是肝癌患者生存的獨(dú)立預(yù)后生物標(biāo)志物。E2F家族成員在肝癌中的作用可能與其在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、免疫細(xì)胞浸潤或基因突變等方面的功能有關(guān)。

關(guān)鍵詞：肝癌；E2F基因家族；免疫浸潤；預(yù)后

中圖分類號：中圖分類號R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文獻(xiàn)標(biāo)識碼

Correlation between E2F expression and immune infiltrates and prognosis

of hepatocellular carcinoma

LIU? Chenghao1，ZHUO? Yicheng1，YANG? Chen1，QIAO? Shiyuan1，BU? Yuanyuan1，WU? Xiangwei1，2*

（1 School of Medicine，Shihezi University/NHC Key Laboratory of Prevention and Treatment of Central Asia High Incidence Diseases， Shihezi，Xinjiang 832000， China; 2 The First Affiliated Hospital， School of Medicine， Shihezi University，

Shihezi，Xinjiang 832000， China）

Abstract： ?Objective To explore the relationship between E2F gene and prognosis of patients with liver cancer and its potential as a marker of liver cancer. Methods The GENT2 databases were used to assess the expression of E2F1-8 in hepatocellular carcinoma and the association with individual cancer staging and tumor grading. Survival analysis and Cox analysis suggested the prognostic value of E2F. The STRING database was used to construct a gene network containing the 40 most similar genes and E2F1-8. The TIMER database was used to analyze the correlation between E2F expression and immune infiltrating cells. The cBioPortal database was analyzed for mutations in E2F. The GEO dataset was used to validate the expression differences of E2F5. Methylation information from the UALCAN， MEXPRESS， GEO and TCGA databases was used to analyze the correlation between E2F5 expression and promoter methylation， and validated by human hepatocellular carcinoma cell lines. Results E2F1-8 was highly expressed in all hepatocellular carcinoma tissues and correlated with tumor grade and pathological stage. The transcript levels of E2F1-3 and E2F5-8 were positively correlated with overall survival （OS） in hepatocellular carcinoma patients. Multifactorial analysis showed that high level of E2F5 mRNA was an independent prognostic factor for shortened OS in hepatocellular carcinoma patients. E2F5/7 expression in hepatocellular carcinoma was associated with tumor-induced activation of immune response and immune infiltration. High expression of E2F5 mRNA in tumor tissues correlated with gene mutation and promoter methylation levels. Conclusion E2F5 is an independent prognostic biomarker for survival in patients with hepatocellular carcinoma. The role of E2F family members in hepatocellular carcinoma may be related to their functions in cell cycle regulation， immune cell infiltration or gene mutation.

Key words： hepatocellular carcinoma;E2F gene family;immune infiltration;prognosis

肝癌，主要是肝細(xì)胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC），是世界范圍內(nèi)高發(fā)的一種預(yù)后較差的惡性消耗性疾?。?-2］。肝癌的特點(diǎn)是復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率較高，在可治愈期的檢出率極低，且治療無效［3］。因此，明確參與肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制和識別準(zhǔn)確的預(yù)后生物標(biāo)志物，有助于為肝癌的早期診斷和治療提供可靠的理論依據(jù)以及治療靶點(diǎn)。

E2F蛋白最初被認(rèn)定是啟動腺病毒 E2 基因的激活因子，可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生增殖［4-5］。目前已確定的E2F轉(zhuǎn)錄因子家族成員共有8名，即E2F1-8［6］。家族中各成員的生物學(xué)功能不盡相同，主要通過激活特定的下游靶基因來調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程［4］。目前在不同類型的癌癥中可普遍觀察到 E2F 家族基因表達(dá)水平的異常升高。例如，研究發(fā)現(xiàn)E2F1 和 E2F3 在肝癌中表達(dá)升高，而 E2F1/E2F3 的過表達(dá)可促進(jìn)小鼠自發(fā)性肝癌的惡性進(jìn)展［7］。由于其結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性，先前對 E2F 家族基因的研究僅局限在單個(gè) E2F 基因與肝癌之間的相關(guān)性。

本研究全面分析了E2F家族成員在肝癌不同病理階段中的表達(dá)水平。通過Cox 分析探索E2F基因表達(dá)水平在肝癌中的預(yù)后價(jià)值 。通過評估E2F表達(dá)與免疫微環(huán)境表型的相關(guān)性來挖掘潛在的抗腫瘤機(jī)制。本研究中的大部分?jǐn)?shù)據(jù)來自TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫，有助于更好的理解E2F家族基因在肝癌中的功能。最終表明 E2F 家族基因可作為肝癌治療研究的潛在生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

E2F5引物（F：5′-TGATACTTTGGCTGTGAGGCA-3′；R：5′-CAGCACCTACACCTTTCCACTG-3′ 購自上海生工生物有限公司），內(nèi)參引物（F：5′-AACCGCGAGAAGATGACCCAG-3′；R：5′-GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA-3′ 購自上海生工生物有限公司），特異性DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑地西他濱（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GENT2數(shù)據(jù)庫

GENT2數(shù)據(jù)庫（http：//gent2.appex.kr/gent2/）是一個(gè)可對公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)集中正常和腫瘤組織的基因表達(dá)模式進(jìn)行編譯的搜索平臺，可用于研究基于腫瘤亞型的差異表達(dá)及預(yù)后意義［8］。本研究以P<0.05作為納入標(biāo)準(zhǔn)。通過two-sample t 檢驗(yàn)比較表達(dá)的差異。

1.2.2 TCGA數(shù)據(jù)庫

癌癥基因組圖譜（The cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫是一個(gè)包括30多種人類癌癥的測序和臨床信息的數(shù)據(jù)分析平臺［9］。TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中下載的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)及與之配對的臨床參數(shù)可通過R軟件中 Limma 軟件包進(jìn)行預(yù)處理，剔除缺乏隨訪數(shù)據(jù)或E2F基因表達(dá)缺失的樣本，分析肝癌組織中E2F1-8的mRNA表達(dá)及與臨床參數(shù)的關(guān)系。使用Survival軟件包分析目的基因表達(dá)量與患者OS之間的相關(guān)性。通過Students t檢驗(yàn)比較目的基因表達(dá)差異，Cox分析比較生存相關(guān)性。

1.2.3 UALCAN數(shù)據(jù)庫

UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu）可對TCGA中的RNA-seq數(shù)據(jù)和31種癌癥類型的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析［10］。在本研究中，UALCAN用于分析E2F5在肝癌組織中的甲基化程度。通過Students t檢驗(yàn)比較轉(zhuǎn)錄表達(dá)的差異。

1.2.4 cBioPortal數(shù)據(jù)庫

cBioPortal （www.cbioportal.org） 數(shù)據(jù)庫可從多維度對癌癥基因組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和可視化［11］。本實(shí)驗(yàn)中分析了E2F1-8的基因組圖譜，包括來自GISTIC和mRNA表達(dá)z評分（RNASeq V2 RSEM）的突變，z評分閾值±1.8。E2F的基因突變及其與OS，肝癌患者的無病生存期 （DFS）、無進(jìn)展生存期（PFS）和疾病特異性生存期（DSS）之間的相關(guān)性并通過KM圖展示。通過Log-rank test統(tǒng)計(jì)生存曲線之間的差異。

1.2.5 免疫評分

ESTIMATE算法可通過基因表達(dá)特征來預(yù)測腫瘤樣本中基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的比率。TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌患者的免疫評分可從http：//bioinformatics.mdanderson.org/estimate下載［12］。本實(shí)驗(yàn)中根據(jù)免疫評分的中位值將肝癌病例分為高低兩組，判斷目的基因在各組中的表達(dá)情況。

腫瘤免疫評估資源（Tumor immune estimation resource，TIMER）數(shù)據(jù)庫是一個(gè)綜合分析腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)資源（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）［13］。免疫細(xì)胞浸潤程度可通過基因表達(dá)譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評估，并通過病理學(xué)評估進(jìn)一步驗(yàn)證。通過“Correlation”模塊評估肝癌中 E2F的表達(dá)與免疫浸潤細(xì)胞基因標(biāo)志物之間的Spearman 相關(guān)性和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.6 GEPIA2和STRING數(shù)據(jù)庫

基因表達(dá)譜交互分析2（Gene Expression Profiling Interactive Analysis 2，GEPIA2）網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器是基于 TCGA 和 GTEx 數(shù)據(jù)庫中腫瘤和正常樣本的基因表達(dá)分析平臺［14］。通過 “Similar Gene Detection” 模塊（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#similar）來識別與E2F1-8最相似的5個(gè)基因。STRING 數(shù)據(jù)庫可以收集、評分和整合各蛋白質(zhì)之間相互作用關(guān)系［15］。使用蛋白質(zhì)相互作用模塊，構(gòu)建E2F1-8 及40個(gè)相似基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)，通過本地工具Cytoscape（version 3.8.2）按degree算法評分對該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。

1.2.7 GO富集分析

通過基因本體論（Gene Ontology，GO）富集分析工具分析E2F潛在的生物學(xué)功能。GO富集分析主要包括細(xì)胞成分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）和生物過程（Biological Process，BP），由工具包（WebGestalt， http：//www.webgestalt.org/）［16］通過在線基因集進(jìn)行分析，設(shè)定各組間差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著的標(biāo)準(zhǔn)為P和FDR值均<0.05。

1.2.8 GEO數(shù)據(jù)集

數(shù)據(jù)集 GSE14520、GSE62232和GSE76427均由 Gene Expression Omnibus （GEO， https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/） 獲得。

1.2.9 細(xì)胞培養(yǎng)

MHCC97H和HuH-7細(xì)胞系均由中國科學(xué)院細(xì)胞庫購買。細(xì)胞在添加10%胎牛血清（Gibco）的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均無支原體污染。

1.2.10 RNA的提取和qRT-PCR分析

使用RNA提取試劑盒提取經(jīng)預(yù)先處理好細(xì)胞的總RNA。利用RevertAid First Strand cDNA提取試劑盒（Thermo Fisher Scientifi）將提取的總RNA中逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。基因表達(dá)在CFX96觸控實(shí)時(shí)PCR檢測系統(tǒng)（Bio-Rad）上進(jìn)行定量。

1.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

通過R 3.6.1 軟件用 Cox 回歸分析對 E2F 基因的表達(dá)與患者存活率之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行評估。使用非配對 t 檢驗(yàn)比較高、低免疫評分組之間E2F基因的表達(dá)差異，多個(gè)GEO數(shù)據(jù)集中正常和腫瘤組織之間 E2F5 的表達(dá)差異以及細(xì)胞系中處理組與對照組之間目的基因的表達(dá)差異。GraphPad Prism （v. 7.0） 用于統(tǒng)計(jì)分析和圖形創(chuàng)建。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌患者中E2F1-8 表達(dá)水平升高

肝癌患者中E2F1-8表達(dá)水平見表1。

通過GENT2數(shù)據(jù)庫在GPL570平臺的多個(gè)腫瘤芯片數(shù)據(jù)中比較腫瘤和正常組織樣本之間 E2F1-8 的表達(dá)。腫瘤患者中E2F1-8的表達(dá)水平均上調(diào)。在肝癌芯片數(shù)據(jù)集中，與正常組織相比，肝癌組織中E2F8表達(dá)水平增加了2.374倍（P<0.001）。此外，肝癌組織中E2F1（Log2FC=0.8621，P<0.001）、E2F7 （Log2FC=0.870，P<0.001）在肝癌組織中的表達(dá)也均高于正常組織（表1）。

2.2 晚期肝癌患者中E2F1-8 表達(dá)的預(yù)后價(jià)值

由于E2F1-8 在晚期肝癌患者中表達(dá)更顯著，因此通過生存分析進(jìn)一步探討 E2F1-8 表達(dá)與 Ⅲ 期 肝癌患者生存率之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，在肝癌Stage Ⅲ 期患者中較高的 E2F3/5表達(dá)與較差的 OS 相關(guān)（P<0.05，圖1C，圖1E）；同樣在Grade Ⅲ 期患者中，E2F2/4/5/6的高表達(dá)對 OS 更不利（P<0.05，圖1J，圖1L，圖1M，圖1N）。表明E2F1/2/3/5/6/7/8的表達(dá)與不同分期肝癌患者的預(yù)后顯著相關(guān)，由此初步判斷E2F基因可作為預(yù)測肝癌患者存活率的有效生物標(biāo)志物，且E2F5對于晚期肝癌患者更為敏感。

2.3 E2F1-8 表達(dá)水平對肝癌患者OS的獨(dú)立預(yù)后價(jià)值

利用TCGA數(shù)據(jù)庫中373例肝癌患者的mRNA表達(dá)和臨床資料進(jìn)行Cox分析。單因素分析顯示在肝癌中病理分期、T分期、M分期、E2F1-3和E2F5-8高表達(dá)與顯著縮短的OS相關(guān)。多因素分析顯示，僅E2F5高表達(dá)與OS的顯著縮短獨(dú)立相關(guān)（表2），表明E2F5是所有肝癌患者OS的獨(dú)立預(yù)后因素。

2.4 肝癌中E2F表達(dá)與免疫浸潤的關(guān)系

利用ESTIMATE算法計(jì)算TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌患者樣本的免疫評分，來預(yù)測腫瘤組織中是否存在浸潤性的免疫細(xì)胞。將肝癌患者按免疫評分的中位數(shù)分為高、低評分組，比較E2F1-8的表達(dá)差異（圖2A～圖2H）。結(jié)果顯示，E2F5在高評分組表達(dá)略顯升高而E2F7在高評分組表達(dá)顯著降低（P<0.05，圖2E，圖2G），提示E2F5/7可能參與了肝癌的免疫浸潤。

通過ssGSEA算法分析TCGA數(shù)據(jù)庫肝癌樣本中E2F5/7分別與各免疫浸潤細(xì)胞之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，E2F5/7均與Th2細(xì)胞呈正相關(guān)（圖2I，圖2J）。使用TIMER數(shù)據(jù)庫評估E2F1-8的表達(dá)與腫瘤純度和免疫浸潤細(xì)胞水平的關(guān)系。結(jié)果表明，E2F5/7的表達(dá)與肝癌的腫瘤純度及腫瘤細(xì)胞中的免疫浸潤水平相關(guān)（P<0.05，圖2K，圖2L）。

此外，利用TIMER數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析E2F5/7表達(dá)與免疫細(xì)胞標(biāo)志物之間的相關(guān)性（表3）。經(jīng)過腫瘤純度矯正后，E2F5/7的表達(dá)與不同功能T細(xì)胞、B細(xì)胞、DCs、中性粒細(xì)胞、NKs等大部分免疫細(xì)胞的基因標(biāo)志物顯著相關(guān)。由此表明，E2F5/7與肝癌中免疫細(xì)胞的浸潤有關(guān)。

2.5 肝癌患者中E2F基因突變及與生存的相關(guān)性

肝癌患者中E2F基因的突變率較高，在379例肝癌患者樣本中有177份樣本發(fā)生了突變，且E2F5的突變率最高，為22%（圖3A）。

生存分析和Log- rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，肝癌患者中E2F基因的遺傳改變均與更短的OS、PFS、DFS和DSS相關(guān)（圖3B～圖3E，P<0.05）。這些結(jié)果提示，E2F基因突變可顯著影響肝癌患者的預(yù)后。

2.6 肝癌患者中E2F及其相關(guān)基因變化對功能和通路的影響

通過GEPIA2 數(shù)據(jù)庫探索與E2F1-8密切程度最高的5個(gè)基因。應(yīng)用 STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建包含E2F1-8及40個(gè)已識別基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖3F）。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，E2F家族成員在肝癌中主要參與有絲分裂和細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)錄調(diào)控等功能相關(guān)（圖3G）。同樣的，與E2F基因密切相關(guān)的MCM2、EXO1、CCNF、DTL、MELK、MKI67、FBXO5和KIFC1等基因也多是調(diào)控染色體或驅(qū)動細(xì)胞有絲分裂的關(guān)鍵基因。MCM2可能是E2F基因在肝癌中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。根據(jù)STRING結(jié)果，E2F基因高表達(dá)可能與染色體有絲分裂有關(guān)。

2.7 E2F5可作為肝癌預(yù)后的潛在標(biāo)志物

GEO數(shù)據(jù)集中，E2F5在腫瘤組織中的表達(dá)量高于正常組織（圖4A～圖4C，P<0.05）。

為了解E2F5在肝癌組織中異常上調(diào)的機(jī)制，通過分析UALCAN、MEXPRESS數(shù)據(jù)庫，以及GEO14520和TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中的甲基化位點(diǎn)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)E2F5的表達(dá)水平與啟動子DNA序列中多個(gè)位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)（圖4D～圖4G，P<0.05）。此外，使用1 μmol·L-1甲基化抑制劑地西他濱處理細(xì)胞48 h后，通過qRT-PCR檢測肝癌細(xì)胞中E2F5的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，MHCC97H細(xì)胞中與對照組（1.000±0.221）相比，藥物刺激組（2.323±0.342）E2F5表達(dá)水平升高（P<0.01）；HuH-7細(xì)胞中與對照組（1.000±0.197）相比，藥物刺激組（1.908±0.240）E2F5表達(dá)水平升高（圖4H，P<0.01）。將TCGA-LIHC項(xiàng)目中的臨床數(shù)據(jù)校正年齡、性別、腫瘤分級、病理分期、T分期等多項(xiàng)臨床參數(shù)變量后，進(jìn)行單因素和多因素Cox分析。表明在肝癌中E2F5是一種可預(yù)測患者總生存的獨(dú)立預(yù)后因素（圖5A，圖5B）。

3 討論

雖然E2F家族中的部分成員在腫瘤發(fā)生和預(yù)后中的功能已得到部分證實(shí)［17-19］，但尚未進(jìn)行生物信息學(xué)分析來證明這些因子在肝癌中的作用。本研究基于公共數(shù)據(jù)庫的高質(zhì)量數(shù)據(jù)集，對肝癌患者中所有可獲得的E2F1-8 基因表達(dá)、基因突變、預(yù)后價(jià)值、與免疫浸潤的關(guān)系和潛在功能進(jìn)行了深入分析。在肝癌患者中觀察到E2F基因的突變率高達(dá)47%，并與較短的生存期相關(guān)。并且為E2F基因及其40個(gè)最密切相關(guān)的基因構(gòu)建了一個(gè)相互作用網(wǎng)絡(luò)。此外，E2F基因在晚期肝癌中的預(yù)后價(jià)值已被確定。E2F5的穩(wěn)定表達(dá)和生存價(jià)值在多個(gè)數(shù)據(jù)集中得到驗(yàn)證。本研究通過對E2F1-8全面分析，為提高肝癌患者的預(yù)后準(zhǔn)確性及肝癌的治療做出貢獻(xiàn)。

E2F家族成員中，E2F1在細(xì)胞中功能已被不斷證實(shí)。研究發(fā)現(xiàn)，E2F1通過介導(dǎo)LOC100130075激活MDM2的轉(zhuǎn)錄使宮頸癌的惡性程度進(jìn)一步加深［20］；E2F1可通過調(diào)節(jié)STMN1的過表達(dá)促進(jìn)卵巢癌的增殖和遷移［21］；DTX3通過調(diào)控E2F1及其下游基因CDC2和Cyclin D3表達(dá)來調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長［22］。此外，E2F1還是真核細(xì)胞中細(xì)胞周期的主要調(diào)控因子，在細(xì)胞有絲分裂G1-S期的轉(zhuǎn)化中起到促進(jìn)作用［23-24］。與此相同的，本研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中E2F1的表達(dá)顯著高于正常組織，且E2F1表達(dá)與肝癌患者的分期和分級密切相關(guān)。E2F1表達(dá)較高的肝癌患者總體生存率普遍較低。

到目前為止，E2F2在人類癌癥中的表達(dá)和功能仍然相對空白。生理狀態(tài)下，在細(xì)胞增殖、分化和DNA損傷應(yīng)答等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用［25］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，E2F2可通過調(diào)控細(xì)胞周期阻滯、DNA損傷和細(xì)胞增殖抑制等方式參與內(nèi)皮細(xì)胞的衰老過程［26］。在肝癌中，E2F2可作為LncRNA AC026401.3調(diào)控的下游靶向轉(zhuǎn)錄因子。AC026401.3通過與OCT1作用來促進(jìn)其對E2F2啟動子區(qū)的募集，從而增強(qiáng)肝癌患者對索拉非尼和樂伐替尼的耐藥性［27］。本實(shí)驗(yàn)中，E2F2在肝癌組織中的表達(dá)量隨腫瘤惡性程度分級的加深而不斷增加，且總體生存率更加惡化。

E2F3位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄表達(dá)時(shí)有E2F3a和E2F3b兩種替代的亞型蛋白［28］。其過表達(dá)對腫瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的惡性生物學(xué)行為目前已被普遍認(rèn)可。E2F3在兒童的成神經(jīng)細(xì)胞瘤中具有和E2F1相似的下游轉(zhuǎn)錄特征。E2F1和E2F3作為成神經(jīng)細(xì)胞瘤獨(dú)立的預(yù)后因素，高表達(dá)時(shí)患者的預(yù)后普遍較差，可能與其異常表達(dá)可導(dǎo)致成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞周期和DNA復(fù)制失控有關(guān)［29］。在肝癌中也有相關(guān)miRNA被證明可通過調(diào)控E2F3來影響細(xì)胞增殖和抑制G0/G1期。據(jù)報(bào)道，miR-15a-5p可通過靶向E2F3調(diào)控肝癌細(xì)胞的遷移、凋亡和生長［30］。同樣的，與正常對照組相比，肝癌樣本中E2F3表達(dá)上調(diào)且與腫瘤分期顯著相關(guān)。E2F3過表達(dá)的肝癌患者OS普遍較差。綜上所述，認(rèn)為E2F3在肝癌中可能是一種較強(qiáng)的致癌基因。

目前已有報(bào)道指出，E2F4在鼻鱗癌腫瘤組織中高表達(dá)且與預(yù)后不良有關(guān)。E2F4在細(xì)胞核中作為轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，被認(rèn)為是診斷和治療鼻咽癌的重要分子靶點(diǎn)，是鼻咽癌潛在的預(yù)后因素［31］。除此之外，E2F4在結(jié)直腸癌中也普遍被認(rèn)為是潛在的致癌基因。在人結(jié)直腸癌細(xì)胞中，E2F4及其靶細(xì)胞周期蛋白A的表達(dá)均上調(diào)。E2F4的表達(dá)受抑制時(shí)可減緩細(xì)胞周期中G1/S相的轉(zhuǎn)化和降低結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖率［32］。不僅如此，E2F4還可以刺激AGAP2-AS1通過調(diào)節(jié)miR-182-5p/CFL1 軸促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)展［33］。與先前報(bào)道相符，本研究發(fā)現(xiàn)E2F4在肝癌細(xì)胞中與正常細(xì)胞相比表達(dá)上調(diào)。然而，E2F4的表達(dá)上調(diào)與較短的OS之間并無明顯相關(guān)，表明其在肝癌中并未起到主要的致癌作用。

E2F5的高表達(dá)和致癌能力目前已在多種腫瘤中得到證實(shí)，然而在肝癌中的研究還相對較少。胰腺癌中，METTL3可通過調(diào)控E2F5的m6A甲基化修飾來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展［34］；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中，circ_0084811通過吸附miR-18a（18b）-5p對E2F5的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控來促進(jìn)細(xì)胞增殖［35］；miR-32、miR-34a和miR-181a-5p可以通過靶向E2F5調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲［32］。本研究發(fā)現(xiàn)E2F5在肝癌組織中的表達(dá)高于正常組織。在腫瘤分級及個(gè)別腫瘤分期中，E2F5的高表達(dá)與不利的OS顯著相關(guān)，提示是OS縮短的獨(dú)立因素。此外，E2F5與肝癌中CD4+/CD8+ T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和DC的浸潤呈顯著正相關(guān)，提示E2F5可能通過參與免疫浸潤細(xì)胞的招募和調(diào)節(jié)來影響肝癌患者的預(yù)后。E2F5的表達(dá)主要與Th細(xì)胞不同亞群標(biāo)記物的表達(dá)相關(guān)，包括Th1細(xì)胞（STAT1）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CCR8、CD25）。表明E2F5在調(diào)節(jié)Th細(xì)胞腫瘤浸潤中發(fā)揮重要作用。由于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在腫瘤免疫抑制中發(fā)揮重要作用，這可能從側(cè)面解釋了為什么E2F5是一種致癌基因。8個(gè)E2F基因中E2F5的基因突變率最高，E2F5的高基因突變可能通過破壞Th2/Th1的相對平衡狀態(tài)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。綜上所述，我們的研究結(jié)果表明，E2F5可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中免疫細(xì)胞的浸潤，在肝癌的發(fā)生和惡性進(jìn)展中起著重要作用。

E2F6在多種腫瘤中均有表達(dá)上調(diào)的報(bào)道，但在肝癌中的作用卻未涉及較深入的研究。E2F6在肝癌的惡性增殖中并未起到主要作用，其作為輔助因子可與CENPU發(fā)生物理作用來促進(jìn)其泛素化降解，通過影響E2F1的轉(zhuǎn)錄水平來促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖［36］。在本研究中，E2F6在肝癌中的表達(dá)水平升高，且與OS之間具有顯著相關(guān)性。因此，E2F6在肝癌中致癌的潛在機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

在腫瘤中E2F7既是轉(zhuǎn)錄抑制因子，也可作為激活因子［37-38］。有文獻(xiàn)提到，透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中RP11-478C19.2/E2F7軸參與了預(yù)后和免疫浸潤水平，可作為治療的新生物標(biāo)志物［37］。目前有研究表明，E2F7作為E2F家族中一個(gè)特殊成員，對其下游基因的功能具有一定抑制作用，并且其在癌癥中所發(fā)揮的功能目前頗有爭議［38］。E2F7是在肝癌中普遍上調(diào)的一個(gè)抑制性轉(zhuǎn)錄因子，其高表達(dá)與患者的臨床病理特征不良和生存率差相關(guān)。E2F7可通過抑制miR-383-5p轉(zhuǎn)錄和依次激活SP1/SOX4/Anillin軸促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長［38］。在本研究中，E2F7在肝癌組織中比在正常組織中表達(dá)更高，且與患者的個(gè)體癌癥分期和腫瘤分級相關(guān)。免疫相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，E2F7在肝癌高評分組中表達(dá)顯著降低，并且與包括Th1/Th2細(xì)胞、耗竭性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在內(nèi)的T細(xì)胞亞群標(biāo)記物密切相關(guān)。由此推斷，E2F7可能通過免疫浸潤改善肝癌患者的預(yù)后。

家族最后一個(gè)成員E2F8可通過調(diào)節(jié)E2F1的活性來控制DNA損傷相關(guān)的細(xì)胞周期過程［29，32］。在包括肝臟在內(nèi)的一些組織中，細(xì)胞增殖的有絲分裂過程中可被轉(zhuǎn)錄抑制因子E2F7和E2F8抑制，導(dǎo)致多倍體細(xì)胞的形成［39］。此外，E2F8在結(jié)直腸癌患者中上調(diào)，并且是miR-1258.72的特異性靶點(diǎn)。一項(xiàng)研究報(bào)道，敲低E2F8會減少細(xì)胞周期調(diào)控因子的表達(dá)，并且可通過調(diào)節(jié)NF-κB通路影響結(jié)腸癌細(xì)胞的生長［32］。同樣，本研究顯示，所有肝癌患者中E2F8表達(dá)上調(diào)，且提示OS不良。但其在肝癌中的預(yù)后作用尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

如上所述，本研究證實(shí)E2F基因的高突變率（48%）及遺傳改變與較短的生存期相關(guān)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，E2F5高表達(dá)是所有肝癌患者OS縮短的獨(dú)立預(yù)后因素且對晚期肝癌患者的預(yù)測更為敏感。通過免疫相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)E2F5與腫瘤誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)激活和免疫浸潤相關(guān)。這可能是E2F5影響肝癌進(jìn)展的潛在機(jī)制。此外，通過分析數(shù)據(jù)庫的甲基化樣本以及甲基化抑制實(shí)驗(yàn)，證實(shí)啟動子低甲基化是導(dǎo)致其異常表達(dá)的重要原因之一。本次研究結(jié)果希望將為拓寬E2F基因作為肝癌中重要標(biāo)志物的認(rèn)識提供幫助，同時(shí)為肝癌的免疫治療提供新的思路。然而，需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證我們的發(fā)現(xiàn)。

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（責(zé)任編輯：編輯唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2022-11-17

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81760570），中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2020-PT330-003），新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)財(cái)政科技計(jì)劃項(xiàng)目（2021BB006），新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)中青年領(lǐng)軍人才項(xiàng)目（2018CB017）

作者簡介：劉程豪（1995—），男，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)橥饪茖W(xué)。

*通信作者：吳向未（1973—），男，教授，博士生導(dǎo)師，從事干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)、肝膽外科良惡性疾病的臨床與基礎(chǔ)研究，e-mail：wxwshz@126.com。