不同產(chǎn)地寬筋藤藥材質(zhì)量研究*

許廣寧，曹斯瓊，何嘉瑩，邱韻靜，胡綺萍，潘禮業(yè)，孫冬梅△

（1.廣東省藥品監(jiān)督管理局審評認(rèn)證中心，廣東 廣州 510000；2.廣東一方制藥有限公司·廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244）

寬筋藤又名伸筋藤、寬根藤等，為防己科植物中華青牛膽Tinospora sinensis（Lour.）Merr.的干燥藤莖，主產(chǎn)于廣東、廣西、云南、湖南等地，野生于村邊、山坡、溝邊疏林或灌木叢中[1]；其味苦性微寒，功效舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)止痛，臨床常用于風(fēng)濕痹痛、筋脈拘攣、屈伸不利、跌打損傷[2]。寬筋藤作為骨科臨床常用藥材[3-4]，在民間以跌打風(fēng)濕藥應(yīng)用歷史悠久，主要含有黃酮類、木脂素類、苯丙素類、萜類、生物堿類等化學(xué)成分[5-8]，現(xiàn)代藥理研究表明其具有鎮(zhèn)痛、抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等藥理活性[9-11]。歷版《中國藥典》均未收載寬筋藤，作為地方用藥，目前有關(guān)寬筋藤的質(zhì)量評價研究較少[12]，與其產(chǎn)地相關(guān)的研究更少。由于寬筋藤的產(chǎn)地分布較廣，在南方地區(qū)一帶均有分布，因此對不同產(chǎn)地的寬筋藤藥材進(jìn)行研究，為其商品藥材品質(zhì)提供參考，具有十分重要的意義。本研究通過建立寬筋藤的超高效液相色譜（UPLC）特征圖譜，并同法進(jìn)行含量測定，對不同產(chǎn)地的寬筋藤藥材質(zhì)量進(jìn)行綜合評價，以期為寬筋藤藥材及其制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

Thermo 高效液相色譜儀（vanquish，賽默飛公司），萬分之一天平（AP224W，梅特勒-托利多公司），百萬分之一天平（XBR36，梅特勒-托利多公司），恒溫水浴鍋（HWS28 型，上海一恒科技有限公司），超純水系統(tǒng)（Comfort 1，德國賽多利斯公司）。

紫丁香苷對照品（含量：95.20%，批號：111574-201605），中國食品藥品檢定研究院；木蘭花堿對照品（含量：98%，批號：wkq-20031310），四川省維克奇生物科技有限公司。乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

21 批寬筋藤藥材信息詳見表1，經(jīng)孫冬梅主任藥師鑒定，為防己科植物中華青牛膽Tinospora sinensis（Lour.）Merr.的干燥藤莖。

表1 寬筋藤藥材樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 選擇Waters HSS T3 C18（2.1×150mm，1.8μm）為色譜柱，以乙腈為流動相A，0.1%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0～9min，8%A；9～19min，8%→10%A；19～25min，10%→17%A；25～28min，17%→40%A；28～30min，40%→95%A）；檢測波長為264nm，進(jìn)樣量為1μL，流速為0.35mL/min，柱溫為30℃。

2.2 供試品溶液制備精密稱定本品粉末（過三號篩）1g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，稱定重量，加熱回流30min，放冷，再稱定重量，補(bǔ)重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對照品溶液制備精密稱取紫丁香苷對照品、木蘭花堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL各含20μg的混合溶液，作為對照品參照物溶液。

2.4 特征圖譜研究

2.4.1 特征圖譜方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1.1 精密度考察取同一份供試品溶液（S14），按“2.1”項色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，以15 號峰木蘭花堿為參照峰，分別計算20 個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD 均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.1.2 重復(fù)性考察 取同一批次藥材（S14），采用“2.1”項下方法制備供試品溶液，平行制備6 份，按“2.2”項色譜條件分別進(jìn)樣，以15號峰木蘭花堿為參照峰，分別計算20 個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.1.3 穩(wěn)定性考察取同一份供試品溶液（S14），采用“2.1”項色譜條件，分別室溫放置0、2、4、6、8、12h進(jìn)行測定，以15 號峰木蘭花堿為參照峰，分別計算20 個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于3%，表明樣品在室溫放置12h穩(wěn)定。

2.4.2 特征圖譜建立及共有峰指認(rèn)取21 批寬筋藤樣品，按“2.2”項下方法制備，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，峰面積結(jié)果見表2。將所得色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)（國家藥典委員會，2012.0 版）進(jìn)行結(jié)果分析，確定20 個共有峰，并生成了對照特征圖譜R，計算各批次樣品與對照特征圖譜的相似度，結(jié)果均大于0.9，說明樣品間質(zhì)量較為接近，結(jié)果見圖1、表3。通過與混合對照品指認(rèn)，確定2個色譜峰的成分，分別為紫丁香苷（峰5）、木蘭花堿（峰15），其中15號峰（木蘭花堿）分離度較好，響應(yīng)較高，位置居中，故以15號峰為參照峰S，見圖2。

圖1 21批寬筋藤藥材UPLC特征圖譜共有峰

圖2 特征圖譜共有峰指認(rèn)

表2 21批寬筋藤藥材UPLC特征圖譜共有峰相對峰面積

表3 21批寬筋藤藥材UPLC特征圖譜相似度結(jié)果表

2.4.3 寬筋藤樣品聚類分析將各色譜峰面積相對于稱樣量量化，運(yùn)用SPSS 20.0軟件對4個產(chǎn)地寬筋藤樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法，以夾角余弦作為樣品相似度的距離公式。聚類分析將寬筋藤樣品分為2 類，I類包括S1～S10，即廣東肇慶和廣東陽江聚為一類；Ⅱ類包括S11～S21，即廣西河池與廣西百色聚為一類，詳見圖3。

圖3 聚類分析結(jié)果

2.4.4 偏最小二乘法分析以21 批不同產(chǎn)地的寬筋藤樣品中20 個色譜峰相對峰面積作為變量，通過SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行判別分析，共得到2 個主成分，其模型解釋率參數(shù)R2X為0.679，R2Y為0.804，Q2為0.626，模型的預(yù)測能力較好（見圖4），并通過20折置換檢驗(yàn)，得到R2擬合Y 坐標(biāo)的截距為0.261，小于0.3，說明模型擬合較好；Q2 擬合Y 坐標(biāo)的截距為-0.195，小于0.05，說明模型未過度擬合，見圖5。21批樣品的得分圖見圖6，廣東肇慶、廣東陽江分為一類，廣西百色、廣西河池分為一類，與聚類分析的結(jié)果一致。對主要影響的變量VIP 值進(jìn)行分析（見圖7），以VIP 值大于1 限度，得到7 個貢獻(xiàn)度高的差異性化合物，分別為峰12、峰18、峰11、峰7、峰2、峰17、峰20，說明上述幾個成分可能為寬筋藤的潛在質(zhì)量標(biāo)志物。

圖4 2個主成分累計貢獻(xiàn)率

圖5 置換驗(yàn)證圖

圖6 不同樣品PLS-DA得分圖

圖7 PLS-DA VIP值圖

2.5 含量測定研究

2.5.1 線性考察精密稱取木蘭花堿對照品2.270mg于10mL量瓶中，加甲醇制成223.0956μg/mL的對照品母液。精密量取上述木蘭花堿對照品母液0.1mL，置50mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成每1mL 含木蘭花堿對照品0.446μg 的對照品溶液；精密量取上述母液0.10.4mL、0.4mL，分別置5mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成每1mL 含木蘭花堿對照品4.462μg、17.848μg 的對照品溶液；精密量取上述對照品母液0.2mL、0.3mL、0.7mL、1mL，分別置2mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成每1mL 含木蘭花堿對照品22.310μg、33.464μg、78.083μg、111.548μg 的對照品溶液；分別按照“2.1”項下色譜條件依次進(jìn)樣1μL，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（y），對照品濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為：y=5292.6x+4400.4，相關(guān)系數(shù)r=0.9996，表明在濃度為0.446μg/mL～111.548μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2 精密度考察精密吸取木蘭花堿對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，以木蘭花堿峰面積計算RSD為0.98%，說明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性考察取本品粉末（S19），按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12h 進(jìn)樣測定，計算峰面積RSD 值為2.10%，說明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性考察取同一批藥材粉末（S19）約1g，精密稱定，平行稱定6 份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液6 份，按“2.1”項下色譜條件測定，計算含量RSD值為1.46%，該分析方法的重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率考察取本品粉末（S19）約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，平行制備6 份，每份按照對照品與樣品含量比例為1：1 加入對照品，按“2.2”項下確定的供試品溶液制備方法制備供試品溶液，測定，計算加樣回收率范圍為94.92%～102.89%，RSD值為2.99%，結(jié)果表明回收率良好。

2.5.6 樣品測定取21 批寬筋藤樣品按上述方法進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表4。根據(jù)結(jié)果可知木蘭花堿含量均值為0.64mg/g，RSD 為30.60%，實(shí)測范圍0.35～1.31mg/g，廣東肇慶的含量均值為0.76mg/g，廣東陽江的含量均值為0.66mg/g，廣西河池的含量均值為0.52mg/g，廣西百色的含量均值為0.63mg/g，說明不同產(chǎn)地間的含量波動較大。

表4 21批寬筋藤樣品含量測定結(jié)果

3 討論

本文采用超高效液相色譜法（UPLC）建立了同法測定寬筋藤特征圖譜及含量測定的方法，對21批來自廣東肇慶、廣東陽江、廣西河池、廣西百色的寬筋藤進(jìn)行系統(tǒng)研究。寬筋藤化學(xué)成分豐富，利用超高效液相色譜法（UPLC）分析時間短、效率高的優(yōu)勢，可以實(shí)現(xiàn)快速分析。同時對不同檢測波長進(jìn)行了考察，最終選擇了色譜峰信息最豐富的264nm 為檢測波長，并在此基礎(chǔ)上對流動相進(jìn)行考察，選擇乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相系統(tǒng)，所建立的方法科學(xué)合理。

特征圖譜研究結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地間的樣品質(zhì)量較為接近，相似度達(dá)到0.9 以上。聚類分析及偏最小二乘法分析結(jié)果顯示，廣東肇慶、廣東陽江的樣品可以分為一類，廣西百色、廣西河池的樣品可以分為一類，兩者結(jié)果一致。偏最小二乘法分析結(jié)果同時提取了7 個成分，可能為寬筋藤的潛在質(zhì)量標(biāo)志物，但本研究尚未能明確其具體成分，有所不足，下一步可繼續(xù)研究。文獻(xiàn)研究顯示，生物堿是寬筋藤的藥理藥效成分之一，因此本研究對特征圖譜中確認(rèn)的生物堿成分木蘭花堿進(jìn)行了定量研究。含量測定結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地的寬筋藤藥材木蘭花堿的含量波動較大，因此可以選擇木蘭花堿作為寬筋藤的質(zhì)量控制指標(biāo)，從而客觀反映寬筋藤藥材的質(zhì)量差異[8]。有文獻(xiàn)報道寬筋藤藥材在全國分布無明顯地域特征，但在一些相鄰的省份藥材質(zhì)量較為相似[13]。本研究選定的4 個產(chǎn)地均為嶺南地區(qū)，為亞熱帶季風(fēng)氣候，光熱充沛，雨熱同季，夏長冬短，因此受環(huán)境影響，寬筋藤藥材的質(zhì)量從特征圖譜可見整體相對穩(wěn)定。但廣東肇慶、廣東陽江為北回歸線附近地區(qū)，沿海氣候，而廣西河池、廣西百色地處云貴高原南麓，是典型的山區(qū)環(huán)境，因此地區(qū)環(huán)境差異導(dǎo)致不同產(chǎn)地寬筋藤藥材質(zhì)量的略有不同。

本研究通過建立寬筋藤藥材的UPLC特征圖譜及含量測定方法，對4 個不同產(chǎn)地的21 批寬筋藤藥材進(jìn)行了綜合評價，結(jié)果能更全面反映不同產(chǎn)地寬筋藤藥材的質(zhì)量，為寬筋藤藥材的質(zhì)量控制提供了參考。