補氣活血合劑對腦缺血再灌注模型大鼠血清外泌體及Nestin、GFAP蛋白表達的影響*

劉 通，廖翔宇，陳玉寧，蔣 穎，陳瓊君，熊 亮，鄺偉川，文 希，劉 悅△

（1.廣州中醫(yī)藥大學第五臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510095；2.廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院），廣東 廣州 510095）

腦卒中嚴重危害人類健康和生命安全，其發(fā)病率高、病死率高、致殘率高、復發(fā)率高。2019 年，發(fā)表于柳葉刀子刊《Lancet Neurology》的一項研究對1990 年至2019 年的204 個國家和地區(qū)進行了調(diào)查，調(diào)查結(jié)果顯示：全球有1220 萬中風發(fā)病病例，1.01億中風患病病例，1.43億傷殘調(diào)整壽命年中風病例，以及655 萬中風死亡病例。該結(jié)果表明：中風仍是世界第二大致死原因、第三大致殘原因（按傷殘調(diào)整生命年衡量）[1]。在我國，缺血性腦卒中在所有腦卒中患者中所占比例可高達85%，缺血性腦卒中幸存者中約有3/4 的患者遺留有不同程度的勞動能力喪失，給社會、家庭帶來極大的負擔[2-3]。因此，進一步探討如何促進腦卒中后肢體功能障礙的康復仍是全球亟待解決的問題。

補氣活血合劑（原名：中風復元合劑）是我院院內(nèi)制劑，對治療氣虛痰瘀型缺血性腦卒中有顯著的臨床療效[4-5]，然而其具體起效機制仍不明確。近期，有多項研究表明小膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)干細胞等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞均能分泌外泌體，并調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展，這些中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞衍生的外泌體在促進血管生成、調(diào)節(jié)炎癥和中風后大腦重塑方面發(fā)揮著關鍵作用[6-7]。巢蛋白（Nestin）是神經(jīng)干細胞的特征性標志物，膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）是星形膠質(zhì)細胞活化的標志物，卒中后神經(jīng)細胞的再生多伴隨有Nestin 和GFAP 的表達升高[8-9]。因此，本研究擬觀察補氣活血合劑對腦缺血再灌注模型大鼠血清外泌體及Nestin、GFAP蛋白表達的影響，進一步明確其起效機制，促進補氣活血合劑的進一步推廣應用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選取40 只成年雄性SPF 級SD 大鼠（廣東省動物實驗中心提供，合格證號：SCXKC(粵)2022-0002），體重200±20g。于廣東省第二中醫(yī)院動物實驗中心分籠飼養(yǎng)，5 只/籠，溫度25℃左右，相對濕度50%～60%，明暗周期12h，自由飲水、攝食，適應性飼養(yǎng)7天后將大鼠隨機分為假手術組、模型組、補氣活血合劑組、合劑+GW4869 組各10 只。按科技部2006 年發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》處理實驗動物，本研究經(jīng)廣東省第二中醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準，批號：048604。

1.2 主要儀器與試劑

大鼠硅膠線栓（佳靈生物，廣州）；動物用異氟烷（瑞普生物，天津）；氯化三苯基四唑（TTC）染色液（G3004，Solarbio）；戊二醛固定液（雷根生物，北京）；蘇木素染液（上海生工生物工程，上海），伊紅染液（索萊寶生物，北京）；Enhanced BCA Protein Assay Kit 測定試劑盒（P0009，Beyotime，China）；緩沖液（ES-8152，ECOTOP，China）；ECL Western Blotting Substrate（EX500B，ECOTOP，China）；Nestin、GFAP、CD63、GAPDH一抗（Abcam）。

1.3 模型制備

大腦中動脈閉塞（Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO）大鼠模型復制采用Zea-Longa 改良法[10]：給予易氟烷（誘導濃度3%，維持濃度1.5%）吸入麻醉，氣體麻醉后，將大鼠仰臥固定，頸部脫毛、消毒，行頸部正中切口縱向切開皮膚，鈍性分離左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈及迷走神經(jīng)。在頸總動脈近心端予醫(yī)用縫合線結(jié)扎，予微動脈夾夾閉頸外動脈及頸總動脈遠心端，在頸總動脈剪開一小切口，將線栓經(jīng)該小切口沿頸總動脈緩慢向頸內(nèi)動脈插入，出現(xiàn)輕度阻力時停止，此時線栓上黑點大約位于頸外動脈與頸內(nèi)動脈分叉口上方1mm，線栓插入的深度約18.0±1.0mm，并在頸總動脈處結(jié)扎，以防線栓脫落。最后松開動脈夾，如無活動性出血后，逐層縫合皮膚。切口常規(guī)消毒，單籠飼養(yǎng)觀察。2h 后，將線栓拔出1cm 左右，動物術后在25℃環(huán)境下飼養(yǎng)，自由進食、飲水。假手術組僅行血管神經(jīng)分離操作，不作插線處理，其他操作相同。

1.4 干預方法

假手術組、模型組與補氣活血合劑組同步灌胃等劑量生理鹽水。補氣活血合劑組、合劑+GW4869組在缺血再灌注2h后開始灌胃補氣活血合劑（粵藥制字Z20170002，廣東省第二中醫(yī)院制劑室提供），10mL/kg，3 次/日，連續(xù)灌胃7 天；其中合劑+GW4869 組前3 天每次灌胃前予腹腔注射外泌體抑制劑GW4869（2.5mg/kg·d），以抑制大鼠外泌體釋放。

1.5 觀察指標

1.5.1 神經(jīng)功能評估

根據(jù)Zea-Longa 評分表[10]的5 分制行神經(jīng)功能缺損評分。0 分：活動正常，無神經(jīng)損傷癥狀；1 分：不能完全伸展對側(cè)前爪，提尾時，對側(cè)前肢內(nèi)收、屈曲（為輕度神經(jīng)功能損傷）；2 分：行走時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈（為中度神經(jīng)功能損傷）；3 分：站立或行走時向?qū)?cè)傾倒（為重度神經(jīng)功能損傷）；4 分：不能自發(fā)行走，意識昏迷。評分值為1～3 分的MCAO 大鼠視為造模成功，納入為研究對象。

1.5.2 TTC染色法測定大鼠腦梗死體積

干預7天后予易氟烷氣體麻醉，斷頭取腦，放至培養(yǎng)皿中，迅速冷藏于-20℃冰箱，20min 后取出，將腦組織置于腦槽，沿冠狀面間隔2mm 進行切片，切好的腦組織薄片浸泡在2%的2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染液中，錫箔紙包好后避光置放于37℃恒溫箱中30min，期間不斷上下翻動腦組織薄片以使腦組織均勻浸泡染色液；30min 后進行拍照，采用Image J 軟件對腦組織梗死體積進行測量。計算公式為：腦梗死體積百分比=梗死區(qū)體積/大腦體積×100%。

1.5.3 HE染色檢測神經(jīng)損傷程度

異氟烷吸入麻醉后，斷頭取腦，取缺血側(cè)大腦運動皮層，組織取材后在PBS 中漂洗，4%PFA 中固定過夜。依次使用50%、70%、90%、100%乙醇脫水，進行石蠟包埋、切片，然后將切片進行二甲苯脫蠟，再次梯度乙醇（體積分數(shù)分別為100%、90%、70%、50%、70%）脫水，蘇木精-伊紅染色，100%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固。使用MshOt（ML31，China）拍照存圖，于顯微鏡下取10 倍光鏡觀察腦組織冠狀面切片，以每個樣本左下象限視野為觀察區(qū)域，觀察治療前后腦組織形態(tài)學改變。

1.5.4 Western blot 檢測缺血皮質(zhì)區(qū)Nestin、GFAP 蛋白表達

取凍存于-80℃冰箱的腦組織，稱質(zhì)量，加入適量RIPA 裂解液，冰上裂解15min 后，勻漿以13000×g離心20min。提取細胞總蛋白并測定蛋白含量，加入適量Loadingbuffer，用沸水將蛋白煮沸5min 進行蛋白變性，按每孔50μg 蛋白上樣。電泳時采用80V電壓將蛋白電泳至濃縮膠與分離膠分界線處，然后換為120V 繼續(xù)電泳70min，當溴酚藍的條帶跑至距膠底1cm 左右時停止電泳，開始電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)采用300mA 轉(zhuǎn)膜70min。轉(zhuǎn)膜完畢后，將蛋白所在區(qū)域切下，用含1%脫脂奶粉的TBST 封閉1h，后用Nestin、GFAP 一抗（均為1:1000）4℃孵育過夜，次日PBS 洗膜后采用辣根過氧化物酶標記的二抗37°C孵育45min，ECL 顯色，GAPDH 為內(nèi)參對照。Alpha Innotech?Fluor Chem FC2凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Image J 軟件定量分析Nestin、GFAP 的吸光度值，取Nestin、GFAP與GAPDH吸光度比值進行統(tǒng)計分析。

1.5.5 血清外泌體的提取及Western blot 檢測CD63蛋白表達取血后RT 放置2h，4°C，1500rpm離心3min，取上清到新的EP 管，以2000g 離心力、4℃條件離心10min，移液槍將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管，以10000g離心力、4℃條件離心30min。取上清用0.22μm 針頭濾器進行過濾，然后用0.22μm針頭濾器的PBS進行配平，要求精確到小數(shù)點后3 位。使用超速離心機進行110000g、4℃、70min 的離心，用移液槍吸走上清，沉淀為初步分離的外泌體。用0.22μm 針孔濾器過濾的PBS 再次重懸外泌體并配平，再次進行120000g、4℃、70min 的離心。用移液槍吸走上清，倒置離心管在吸水紙上，使液體流干，加入50μL 的PBS 溶解外泌體，放置于-80℃長期保存。Western blot檢測步驟同1.5.4。

1.6 統(tǒng)計方法

計量資料以均值加減標準差（±s）表示，多組間對照均值比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較方差齊時采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Dunnett's T3檢驗，均由SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)處理。以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分

干預后，假手術組未表現(xiàn)出神經(jīng)功能缺損癥狀，模型組神經(jīng)功能缺損評分顯著升高（P＜0.01），補氣活血合劑組神經(jīng)功能缺損評分較模型組顯著降低（P＜0.05）；應用GW4869后，神經(jīng)功能缺損評分較補氣活血合劑組顯著升高（P＜0.01），模型組和合劑+GW4869組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠干預前后神經(jīng)功能缺損評分比較

2.2 腦梗死體積

假手術組大鼠腦組織成正常紅色，未見肉眼蒼白梗死灶，模型組、補氣活血合劑組、合劑+GW4869組均可見右側(cè)大腦蒼白梗死灶；與假手術組相比，模型組、補氣活血合劑組、合劑+GW4869 組大鼠的腦梗死體積比均顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，補氣活血合劑組的大鼠腦梗死體積比顯著降低（P＜0.05）；與補氣活血合劑組相比，合劑+GW4869 組大鼠的腦梗死體積比均顯著增加（P＜0.01），模型組和合劑+GW4869組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2、圖3。

圖2 各組大鼠梗死區(qū)TTC染色情況

圖3 各組大鼠腦梗死體積百分比的比較

2.3 神經(jīng)損傷程度

假手術組染色均勻，組織完整，神經(jīng)細胞形狀為圓錐狀，排列整齊，核大居中，有明顯的核仁。模型組腦皮層神經(jīng)細胞排列不規(guī)則，神經(jīng)元明顯腫脹，核仁不明顯，出現(xiàn)核固縮、細胞間隙存在不同大小的空泡樣改變，出現(xiàn)間質(zhì)水腫。與模型組比較，補氣活血合劑組、合劑+GW4869 組神經(jīng)元壞死減少、組織水腫的形態(tài)表現(xiàn)較輕。與合劑+GW4869組比較，補氣活血合劑組壞死神經(jīng)元和腦組織水腫等病理損傷較輕，見圖4。

圖4 各組大鼠大腦皮層的HE染色結(jié)果（10x/20x）

2.4 蛋白表達

Western-blot 結(jié)果顯示：與假手術組相比，模型組GFAP、CD63 表達顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，補氣活血合劑組GFAP、CD63 表達顯著升高（P＜0.05）；加用GW4869 后，補氣活血合劑組GFAP、CD63 表達顯著下降（P＜0.05），Nestin 表達僅有與GFAP、CD63 相似的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖5、圖6。

圖5 各組大鼠梗死皮層中Nestin、GFAP及血清外泌體中CD63的表達

圖6 各組大鼠梗死皮層中Nestin、GFAP及血清外泌體中CD63的表達的比較

3 討論

腦卒中可分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，缺血性腦卒中是主要類型，約占全球范圍腦卒中患者總數(shù)的60%～70%[11-12]。溶栓是治療急性卒中的有效方法，但遺憾的是其治療時間窗僅為4.5h，超過該時間再使用溶栓藥可能會得不償失[13]，而出血轉(zhuǎn)化和氧化應激是主要的臨床風險，會進一步擴大病理級聯(lián)反應[14]。而卒中后缺血半暗帶的拯救是防止梗死區(qū)繼續(xù)擴大、促進卒中恢復的有效目標[15]。因此，卒中后的神經(jīng)保護對腦卒中患者的功能恢復非常重要。目前所有可用的神經(jīng)保護藥物在腦卒中治療的臨床研究中均以失敗告終[16-17]，故進一步探索治療腦卒中的有效候選藥物也迫在眉睫。

越來越多的研究表明，中藥及其有效成分在治療心肌缺血、心力衰竭、缺血性中風、動脈硬化等各種心腦血管疾?。–CVDs）方面具有獨特的療效[18-19]。補氣活血合劑是我院院內(nèi)制劑，由我院劉悅教授從1992 年應用至今，以益氣活血、化痰開竅為治法，由黃芪、赤芍、當歸、何首烏、桃仁、瓜蔞子、半夏、陳皮、萊菔子、石菖蒲等藥物組成，前期臨床和基礎實驗[4-5,20]已對其療效及有效成分等進行了初步驗證。

本實驗對補氣活血合劑的臨床起效機制進行了進一步探索，發(fā)現(xiàn)補氣活血合劑可縮小腦梗死體積，提高腦梗死組織中GFAP、Nestin蛋白的表達，改善大鼠缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損程度，該作用可能與促進外泌體分泌有關。巢蛋白（Nestin）是一種中間絲類型的蛋白，是能夠特異性地表達在神經(jīng)上皮干細胞上的一種分子標記物，為神經(jīng)干細胞的特征性標志物；GFAP 是星形膠質(zhì)細胞活化的標志物，參與細胞骨架的構(gòu)成并維持其張力強度；GFAP、Nestin蛋白表達的升高表明補氣活血合劑可顯著促進神經(jīng)干細胞和星形膠質(zhì)細胞的再生活化。外泌體直徑約為30～150nm，是一種異質(zhì)性細胞外囊泡，具有功能分子裝飾的磷脂雙分子層，富含蛋白質(zhì)、脂類和核酸[21-22]。CD63 是外泌體的標志蛋白之一，其表達量可一定程度上代表外泌體的含量。作為全細胞植入的替代治療策略，外泌體通過體液和循環(huán)將各種蛋白質(zhì)和核酸傳遞給鄰近和遠處的受體細胞，在細胞間通信中發(fā)揮著關鍵作用[23]。最近，基于外泌體的治療在腦卒中的血管生成、抗炎、神經(jīng)發(fā)生和抗凋亡方面顯示出巨大的作用[24-25]。小膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)干細胞等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞均能分泌外泌體，并調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展。這些中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞衍生的外泌體在促進血管生成、調(diào)節(jié)炎癥和中風后大腦重塑方面發(fā)揮著關鍵作用[25]。因此推測，補氣活血合劑可能是通過促進外泌體的分泌進一步調(diào)控了血管生成、炎癥反應等而起到了對腦功能調(diào)控的作用。

然而，本實驗仍然存在一定缺陷：首先，補氣活血合劑是多種藥物的復方制劑，其調(diào)控外泌體分泌的作用到底有哪些藥物密切相關仍需要進一步研究；其次，補氣活血合劑誘導的外泌體由何種細胞產(chǎn)生，以及外泌體中的何種成分起到關鍵作用，仍不清楚。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)補氣活血合劑可縮小腦梗死體積，提高腦梗死組織中GFAP蛋白的表達，改善大鼠缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損程度，該作用可能與促進外泌體分泌有關，但該制劑中的具體起效成分及其介導外泌體分泌的具體起效機制仍需進一步研究。