Collagen V在推拿促進長期大負荷運動大鼠肌肉干細胞自我更新中的作用研究*

張瑞馳，靳松林，李倫宇，阿衣留布，丁海麗

（成都體育學院，四川 成都 610041）

超負荷原則是現(xiàn)代運動訓練體系的主要原則，人體不斷適應增加的運動負荷，從而使身體機能和運動能力得到提升[1]。在此過程中，若運動負荷長時間過度超出機體承受能力，可能會導致骨骼肌損傷發(fā)生，損傷又需要足夠的時間修復[2]，但實際情況下訓練與損傷修復的時間平衡點往往難以把控。若損傷未愈仍持續(xù)大負荷運動，可導致機體組織損傷進一步累積并遷延[3]，影響運動表現(xiàn)。競技體育中，推拿常被應用于運動員訓練及賽后的肌肉疲勞恢復和損傷治療，效果顯著。目前，現(xiàn)有研究在免疫調(diào)節(jié)[4]、蛋白合成/分解代謝[5-6]和細胞外基質(zhì)[7]等方面進行了探究，證實推拿以力學形式作用于損傷或疼痛部位軟組織，從而達到緩解癥狀和促進組織修復的效果[8]。但其具體作用分子機制仍不清晰，有待進一步探討。

肌衛(wèi)星細胞（Muscle Satellite Cells, MSC）具有干細胞特性，即肌肉干細胞，是成體骨骼肌再生修復的主要細胞類型，通常處于靜息狀態(tài)[9]。當骨骼肌遭受損傷性刺激時，MSC 被激活并大量增殖，以滿足機體干細胞需求，這一過程中，部分激活和增殖的MSC 會重新退回靜息狀態(tài)以維持骨骼肌再生潛能，影響損傷修復[10]。V 型膠原蛋白（Collagen V,COLV）由MSC 分泌并通過作用于MSC 表面降鈣素受體介導MSC 靜息狀態(tài)的維持，是MSC 靜息生態(tài)位關鍵組成成分[11-12]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[13]，推拿可上調(diào)一次性大負荷運動骨骼肌損傷的Collagen V表達，促進損傷修復。然而，推拿對長期大負荷運動骨骼肌損傷的干預效果及機制仍不明晰。本實驗旨在觀察長期大負荷運動后推拿對Collagen V表達及損傷修復的影響，探討推拿能否介導Collagen V表達促進MSC 自我更新。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組8 周齡健康SPF 級雄性SD 大鼠共32 只，初始體重185±6g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，許可證號：SYXK（川）2020-030。實驗動物在成都體育學院標準動物房內(nèi)分籠飼養(yǎng)，整個實驗過程中保持自由飲食、飲水，室溫20℃～24℃，相對濕度30%～60%，12h 光照/黑暗模擬晝夜交替環(huán)境。適應性喂養(yǎng)3 天后，所有大鼠按隨機數(shù)字表法分為空白對照組（C 組，n=8）、長期大負荷運動組（E 組，n=8）、長期大負荷運動+推拿組（ET 組，n=8）、長期大負荷運動+假推拿組（ES組，n=8）。本實驗過程中對動物所有處理均遵循動物倫理學標準，并得到成都體育學院動物倫理委員會批準。

1.2 試劑與器材免疫染色封閉液、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒、ECL試劑盒：碧云天。反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit）、熒光定量試劑盒（TB Green TM Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus））：寶日醫(yī)。BCA 蛋白濃度測定試劑盒：博士德。Collagen V 抗體：Thermo Fisher Scientific。Pax7 抗體：圣克魯斯。MyoD1 抗體、Myf5 抗體：Affinity Biosciences。HRP 標記抗兔二抗：成都正能。TSAPLus 熒光雙重染色試劑盒、Fitc 標記抗兔二抗、Cy3 標記抗小鼠二抗：賽維爾。Finger-8-TR 型推拿量化儀：蘇州長顯光電科技。YLS-13A 大小鼠抓力測定儀：徐州利華電子科技。

1.3 造模方案所有大鼠進入動物房后適應性喂養(yǎng)3天，其中E、ES、ET 組大鼠進行1 周適應性運動并參考張學林[14]所用方法建立4 周大負荷運動損傷模型，C組不進行運動作為對照，運動方案見表1。

表1 大鼠大負荷運動方案

1.4 干預措施根據(jù)《靈樞·經(jīng)筋》中“以痛為腧”，推拿操作主要利用阿是穴原理，對損傷部位進行揉按，將機械力刺激傳遞至損傷部位。自正式運動起，每日運動結束后6h，除E組不予處理外，高年資中醫(yī)推拿科主治醫(yī)師參照鄭氏手法操作要求[15]對ET 組大鼠小腿三頭肌施以揉法為主的推拿手法，每側(cè)5min，每天1次，每周6天，休息1天，操作過程中借助Finger-8-TR 型FSR 薄膜式壓力傳感器對推拿參數(shù)進行量化和監(jiān)測，根據(jù)團隊前期實驗結果[13]，并參照文獻[16]，控制推拿力度為4N 左右，頻率為120 次/min。僅對ES 組大鼠于小腿三頭肌處皮膚施以輕撫，頻率和時間同ET組。

1.5 樣本采集與處理于末次干預后24h 采用1%戊巴比妥鈉30mg/kg 腹腔麻醉，剝離兩側(cè)腓腸肌組織，左側(cè)腓腸肌內(nèi)側(cè)頭采用3%戊二醛固定用于透射電子顯微鏡檢測；右側(cè)腓腸肌組織分為兩份，一份采用環(huán)保型GD 肌肉固定液固定用于后續(xù)免疫組化和免疫熒光染色，另一份以-80℃保存用于后續(xù)Western Bolt和實時熒光定量PCR檢測。

1.6 觀察指標

1.6.1 后肢抓力測試參照Wang H等[17]的方法，使用YLS-13A 大小鼠抓力測定儀進行檢測：右手抓住大鼠背部將其放于網(wǎng)格抓桿，使其下肢抓住抓桿，左手托起大鼠上半身緩緩將其放平，然后右手握該大鼠尾部，將抓力儀推至前端，踩踏板清零，待大鼠抓牢后，緩緩拉動大鼠尾部，直至其脫落或計數(shù)截止。抓力測定儀能夠準確記錄大鼠后肢抓力的最大值，每只大鼠重復測試3次，取平均值。

1.6.2 透射電鏡 腓腸肌組織于3%戊二醛預固定后，1%四氧化鋨再固定。丙酮逐級脫水后，將樣品先經(jīng)脫水劑處理，又用環(huán)氧樹脂包埋，再經(jīng)加溫聚合后切片。采用超薄切片機制備約50nm切片后，漂浮于刀槽液面上，再撈至銅網(wǎng)。室溫下用醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色液染色，運用JEM-1400PLUS 透射電鏡觀察超微結構并采集圖像。

1.6.3 免疫組織化學染色將固定后的組織經(jīng)全自動脫水機脫水，石蠟包埋，7μm 切片，脫蠟后的切片經(jīng)3%甲醇雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加免疫染色封閉液進行抗原修復，室溫封閉20min，加入一抗Collagen V（1：100），4℃孵育過夜。于次日PBS 水洗后，加入山羊抗兔二抗（1：1000），37℃孵育30min，再次PBS水洗。使用DAB顯色試劑盒顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。使用BA200Digital 數(shù)碼顯微攝像系統(tǒng)對切片進行圖像采集。采用Imagepro Plus 6.0 分析同一參數(shù)下總和光密度值，根據(jù)圖片總面積計算平均光密度值。

1.6.4 實時熒光定量PCR 各大鼠取100mg骨骼肌組織，采用Trizol法提取mRNA，并將獲得的mRNA 經(jīng)超微量分光光度計（Thermo）檢驗純度和濃度。使用PrimeScript RT reagent Kit 試劑盒進行基因組DNA 除去反應和逆轉(zhuǎn)錄反應，獲得樣品cDNA。按照TB Green TM Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）建立20μL 預混液反應體系，95℃預變性30s，95℃變性5s，55℃退火30s，72℃充分延伸30s，45 循環(huán)，并用PIKORed 96實時熒光定量儀進行擴增和采集熒光。使用PikoReal 軟件分析各檢測樣本的CT（Threshold cycle）值，通過2-△△CT計算Col5a1 和Col5a3 相對mRNA 表達水平。引物均由上海生工生物工程股份有限公司設計合成，序列如下：Col5a1:5'-GGACTCCGACTCCAATGTCTCTCC-3'；Col5a1:5'-GGCTCAATGATGGCTGGTTCTCC-3'；Col5a3:5'-TGAGAAGCTGCCGGAGACTGG-3'；Col5a3:5'-CCCTATGCACACCCAAGGTTTCC-3'；β-actin:5'-GAAGATCAAGATCATTGCTCC-3'；β-actin:5'-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3'。

1.6.5 Western Blot 各大鼠取20mg 腓腸肌組織與裂解液混合并勻漿，4℃、12000r/min離心5min，取上清液采用BCA 法測定蛋白濃度，加熱變性制作蛋白樣品。獲得樣品后加入十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠進行電泳（濃縮：80V 30min；分離：120V 90min），再以200mA 轉(zhuǎn)膜90min。用含5% 脫脂奶粉的TBST 封閉2h，分別加入Pax7（1：600）、MyoD1（1：1000）、Myf5（1：500）、β-actin（1：50000）一抗，4℃孵育過夜，TBST 充分洗滌，加入山羊抗兔二抗（1：10000），37℃孵育2h，TBST 再次充分洗滌，使用增強ECL 化學發(fā)光液顯影、定影，采用Image-J 軟件分析目標蛋白及內(nèi)參蛋白的灰度值并計算比值。

1.6.6 免疫熒光共定位將固定后的組織經(jīng)全自動脫水機脫水，石蠟包埋，7μm 切片。經(jīng)梯度乙醇脫蠟后，使用EDTA（pH 8.0）對玻片進行抗原修復。滴加免疫染色封閉液室溫封閉10min 后，分別添加一定比例Collagen V（1：500）、Pax7（1：300）一抗混合液，室溫孵育1～2h 后轉(zhuǎn)移至4℃過夜。次日PBS 水洗后，滴加Fitc 標記山羊抗兔和Cy3 標記山羊抗小鼠二抗，室溫孵育2h。再次PBS 水洗，滴加DAPI，室溫孵育10min，用抗熒光淬滅封片劑封片。采用Pannoramic 250 全自動數(shù)字掃描顯微鏡進行拍照觀察，隨機選取視野采集。

1.7 統(tǒng)計方法采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)均以均值加減標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。方差齊性檢驗采用Brown-Forsythe test和Bartlett's test，方差齊時，采用LSD檢驗；方差不齊時，采用Tamhan's T2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠后肢抓力測試各組間初始后肢抓力無顯著性差異（P＞0.05）。E 組、ES 組與ET 組4 周后抓力較C 組均顯著增加（P＜0.01）。經(jīng)校準，E 組與ES 組在完成運動方案后抓力增加值較C組具有顯著性差異（P＜0.05），ET 組也具有顯著性差異（P＜0.01）；同時，ET 組較E 組和ES 組抓力增加值也具有顯著性差異（P＜0.05）；E組與ES組無顯著性差異（P＞0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠后肢抓力變化（g）

2.2 透射電鏡觀察腓腸肌超微結構C 組大鼠腓腸肌肌原纖維排列整齊，肌節(jié)明暗帶清晰可見，線粒體完整且有規(guī)律地排列在Z 線兩側(cè)。E 組與ES 組大鼠腓腸肌超微結構發(fā)生改變，肌原纖維發(fā)生斷裂和降解、Z 線斷裂、肌漿網(wǎng)腫脹、線粒體結構不清且腫脹。ET 組大鼠腓腸肌超微結構較E 組和ES 有明顯改善，肌原纖維排列整齊、肌漿網(wǎng)完整，但仍有部分線粒體結構不清，見圖2。

圖2 各組大鼠腓腸肌超微結構（×20000）

2.3 免疫組織化學染色各組大鼠腓腸肌組織均出現(xiàn)深棕色顆粒陽性表達，其中C組和ET組深棕色顆粒顯著多于E 組和ES 組。E 組與ES 組Collagen V表達水平較C 組均呈下降趨勢，其中E 組降低具有顯著性（P＜0.05）；ET 組Collagen V表達較其余三組均顯著升高（P＜0.01）；E 組與ES 組無顯著性差異（P＞0.05），見圖3。

圖3 各組大鼠Collagen V表達（×400）

2.4 實時熒光定量PCR E 組、ES 組與ET 組Col5a1mRNA 表達水平較C 組均顯著降低（P＜0.01）；ET 組表達較E 組和ES 組呈上升趨勢，其中較E 組升高具有顯著性（P＜0.05）。E 組與ES 組Col5a3 mRNA 表達水平較C 組均顯著降低（P＜0.01）；ET 組表達較C組顯著升高（P＜0.05），同時較E 組與ES 組也顯著升高（P＜0.01）；E 組與ES 組無顯著性差異（P＞0.05），見圖4。2.5 Western Blot E 組Pax7 蛋白表達水平較C 組降低（P＜0.01），同時ES 組Pax7 蛋白表達較C 組也降低（P＜0.05），兩組MyoD 和Myf5 蛋白表達較C 組均降低（P＜0.01）；而ET 組較C 組除Pax7 蛋白表達無顯著差異（P＞0.05）外，其Pax7蛋白表達較E組和ES組顯著升高（P＜0.01），且MyoD 和Myf5 蛋白表達較另三組均顯著升高（P＜0.01）；ES 組較E 組除MyoD蛋白表達升高顯著（P＜0.05）外，其余蛋白表達均無顯著差異（P＞0.05），見圖5。

圖4 各組大鼠Col5a1和Col5a3 mRNA表達

圖5 各組大鼠Pax7、MyoD和Myf5蛋白表達

2.6 免疫熒光共定位紅色熒光標記Pax7，綠色熒光標記Collagen V，Pax7 與Collagen V共定位呈現(xiàn)黃色熒光。E組和ES組黃色熒光信號較C組減少；ET組黃色熒光信號較C 組無明顯差異，而較E 組和ES組增加；E 組和ES 組黃色熒光信號無明顯差異，見圖6。E 組與ES 組Pax7 與Collagen V的Overlap 系數(shù)較C 組均顯著降低（P＜0.01）；ET 組較C 組無顯著性差異（P＞0.05），而較E 組和ES 組均顯著升高（P＜0.01）；E組與ES組無顯著性差異（P＞0.05），見圖7。

圖6 各組大鼠Collagen V與Pax7免疫熒光共定位結果（×400）

圖7 各組大鼠Collagen V與Pax7共定位表達

3 討論

推拿作為中國傳統(tǒng)療法之一，常應用于治療長期過度使用骨骼肌引起的慢性肌肉勞損，緩解肌肉酸痛和疲勞無力等癥狀[18]。競技運動中，運動員平日反復進行的高強度訓練導致骨骼肌重復性微損傷積累，造成骨骼肌過度使用，久之則易形成慢性勞損[19-20]。有研究證實，離心大負荷運動易造成骨骼肌超微結構變化，導致骨骼肌微損傷[21-22]。而長期大負荷運動過程中，為適應骨骼肌的過度使用，其超微結構損傷及重復性微損傷會累積，出現(xiàn)組織炎癥浸潤及纖維化等現(xiàn)象[23]。推拿已被證實具有加速運動所致骨骼肌損傷修復的作用[24]，與團隊前期研究發(fā)現(xiàn)推拿可加速一次性大負荷運動骨骼肌超微結構損傷修復結果一致[13]。且有研究表明，通過推拿給予機體一定機械力刺激可誘導細胞骨架蛋白重塑[25]，這也對骨骼肌超微結構損傷修復具有重要意義。本研究運用大鼠四周遞增連續(xù)離心下坡跑模擬運動員長期大負荷運動狀態(tài)，通過透射電鏡觀察到大鼠腓腸肌超微結構發(fā)生了肌原纖維斷裂及降解、Z線斷裂等改變，而經(jīng)推拿干預的大鼠腓腸肌超微結構有明顯改善，提示推拿可促進長期大負荷運動所致骨骼肌損傷修復。此外，另有研究表明推拿在促進損傷修復的同時還能有效改善肌肉力量[26]。本研究結果顯示，推拿組大鼠后肢抓力的提升遠超單純運動大鼠，這進一步說明推拿促進損傷修復的同時，能更有效地鞏固并增強長期大負荷運動產(chǎn)生的肌肉力量。

MSC 自我更新是骨骼肌損傷修復的內(nèi)源性動力，該過程受MSC 生態(tài)位嚴格調(diào)控。Pax7 是MSC及其自我更新的關鍵標志物，參與維持MSC 生態(tài)位、調(diào)控其自我更新且持續(xù)表達抑制成肌細胞肌源性分化程序[27]。與此同時，骨骼肌再生修復依賴肌源性調(diào)節(jié)因子來調(diào)節(jié)分化程序[28]。MSC 通常處于靜息狀態(tài)，穩(wěn)定表達Pax7，當受到損傷刺激活化后，則開始表達MyoD 和Myf5，參與肌肉中成纖維細胞等非肌肉細胞向肌肉的轉(zhuǎn)化過程。本研究檢測了大鼠腓腸肌中Pax7、MyoD 和Myf5 蛋白表達情況，以探究推拿對MSC自我更新的影響。有證據(jù)證明，運動引起的重復性損傷會降低MyoD 和Myf5 表達[29]，本研究發(fā)現(xiàn)單純運動組中Pax7、MyoD 和Myf5蛋白表達均降低，這說明長期大負荷運動可能導致重復性損傷。而推拿組相較于空白對照組MyoD 和Myf5 蛋白表達顯著升高，提示骨骼肌損傷后推拿有助于MSC自我更新。另一方面，推拿組三種蛋白表達較單純運動組和假推組均顯著升高，結合透射電鏡結果，提示推拿可能因促進MSC自我更新而加速長期大負荷運動所致骨骼肌損傷修復。

Collagen V是MSC 生態(tài)位關鍵組成成分，對維持MSC靜息態(tài)起重要作用。Baghdadi MB等[11]發(fā)現(xiàn)Collagen V缺失時，會導致MSC進入異常細胞周期，消耗干細胞池，影響MSC 生態(tài)位穩(wěn)定，進而導致自我更新受損。為驗證推拿能否通過干預Collagen V表達，影響MSC 自我更新，本研究采用免疫組織化學染色法檢測Collagen V表達，發(fā)現(xiàn)長期大負荷運動后Collagen V表達顯著降低，而介入推拿會上調(diào)Collagen V表達，與團隊前期研究推拿對一次性大負荷運動所致骨骼肌損傷Collagen V表達變化趨勢一致[13]。與此同時，本研究還檢測了Collagen V主要基因Col5a1和Col5a3 mRNA表達，推拿干預下兩基因mRNA 表達升高，與免疫組織化學染色結果類似，這提示長期推拿有助于上調(diào)Collagen V表達。為進一步探究Collagen V在推拿干預下對MSC 自我更新的作用，本研究就Collagen V與Pax7 進行免疫熒光共定位，結果顯示長期大負荷運動后Collagen V與Pax7 共定位程度降低，而長期推拿使共定位程度有所提高，這說明Collagen V參與推拿促進MSC 自我更新過程。由此推測，推拿的確可能通過上調(diào)Collagen V表達，促進長期大負荷運動大鼠骨骼肌損傷中所進行的MSC自我更新。

綜上所述，本研究探究了推拿可能通過上調(diào)Collagen V表達的方式，促進MSC自我更新，從而加速長期大負荷運動導致骨骼肌損傷的修復，并增強肌肉力量。但由于MSC生態(tài)位成分復雜，是否還有其他細胞和因子參與推拿修復骨骼肌損傷過程，或參與調(diào)控Collagen V來間接影響其損傷修復，仍有待進一步研究。