中華湖蛭的鑒定及藥物浸浴殺滅效果研究

胡金春 葉嘉政 任思齊 鄭善堅

摘要首次報道了一種寄生于天然水體鰱、鳙魚鰓部的中華湖蛭（Limnotrachelobdella sinensis）。2019—2022年，每年10月份后在部分水庫鰱、鳙魚鰓上發(fā)現(xiàn)少量幼蟲感染，翌年4—6月為感染高峰，7月份后自行脫落消失。它吸食魚鰓上的血液，嚴(yán)重影響魚體生長及市場銷售價格，給漁業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失。經(jīng)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定其為中華湖蛭。利用幾種常用藥物（敵百蟲、川楝子、生石灰、硫酸銅）對中華湖蛭進行離體和在體（寄生在鰱魚鰓上）的浸浴殺滅效果試驗。離體試驗結(jié)果表明，生石灰200 mg/L、川楝子400.00 mg/L、敵百蟲4.00 mg/L浸浴1 h可以全部殺滅中華湖蛭；在體試驗表明，400.00 mg/L川楝子、2.00 mg/L敵百蟲、100.00 mg/L生石灰浸浴1 h后撈出至清水中暫養(yǎng)24 h觀察，蟲體全部死亡脫落而鰱魚安全。

關(guān)鍵詞中華湖蛭；浸??；殺滅效果；離體試驗；在體試驗

中圖分類號S 917.4文獻標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2023）24-0082-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.24.018

Study on the Identification of Limnotrachelobdella sinensis and the Germicidal Efficacy of Drug Immersion Bath

HU Jinchun1，2，YE Jiazheng1，REN Siqi1 et al

（1.Key Laboratory of Wildlife Biotechnology and Conservation and Utilization of Zhejiang Province/Zhejiang Normal University，Jinhua，Zhejiang 321004;2.Aquatic Technology Promotion Station in Quzhou City，Quzhou，Zhejiang? 324000）

AbstractLimnotrachelobdella sinensis，a freshwater leech parasitic on the gills of Aristichthys nobilis and Hypophthalmichthys molitrix in natural water body，was reported for the first time.During 2019-2022，a small number of larvae were found to be infected on the gills of A.nobilis and H.molitrix in some reservoirs after October each year.The infection peaked from April to June in the following year，and then disappeared after July.It absorbed the blood on the fish gills，which seriously affected the fish growth and market sales price，and brought huge economic losses to the fishery production.It was identified by morphology and molecule methods as L.inensis.The killing effect of several commonlyused drugs （trichlorfon，toosendan，quicklime and cupric sulfate） on L.sinensis was tested by dipping bath in vitro and in vivo （parasitized on the gills of H.molitrix）.The in vitro test showed that soaking with 200.00? mg/L quicklime，400.00? mg/L toosendan and 4.00? mg/L trichlorfon for 1 hour could kill all L.inensis，while in vivo test showed that 400.00? mg/L toosendan，2.00? mg/L trichlorfon and 100.00? mg/L quicklime were soaked for 1 hour and then temporarily cultured in clean water，and all the parasites were killed for 24 hours and H.molitrix was safe.

Key wordsLimnotrachelobdella sinensis;Immersion bath;Germicidal efficacy;In vitro test;In vivo test

鰱（Hypophthalmichthys molitrix）、鳙（Hypophthalmichthys nobilis）是典型的浮游生物食性魚類，在我國主要的大型水庫、湖泊中具有重要的生態(tài)學(xué)意義。隨著“潔水漁業(yè)”的發(fā)展，我國水庫湖泊都以放養(yǎng)鰱鳙魚為主，一方面鰱、鳙魚通過非經(jīng)典生物操縱控制藻類水華的發(fā)生［1］，另一方面水庫等清水養(yǎng)殖的鰱鳙魚品質(zhì)較好，能帶來較大的經(jīng)濟效益，形成了以千島湖有機魚等品牌為代表的特色產(chǎn)業(yè)，深受市場喜愛。自2019年以來，浙江省部分中小型水庫陸續(xù)發(fā)現(xiàn)鳙、鰱魚鰓上感染類似中華湖蛭（Limnotrachelobdella sinensis）的寄生蟲，其他魚類上未發(fā)生感染。3月上旬在大規(guī)格鳙、鰱魚鰓上可見少量白色幼蟲感染，4—7月發(fā)現(xiàn)大量感染，特別是對鳙魚的感染率極高，每條魚上可見30～50條褐色成蟲，雖然不會引起死亡，但會影響其銷售，造成了較大的經(jīng)濟損失。

目前已知中華湖蛭在我國山東、江蘇、湖南和黑龍江地區(qū)廣泛分布，主要利用其強力的尾吸盤吸附于鯉（Cyprinus carpio）、鯽（Carassius auratus）魚鰓蓋骨上，頭部和身體的前段游離在鰓腔里面，通過吻在鰓瓣上吮吸血液［2］。另外，水庫等大型水體魚類感染中華湖蛭缺乏有效的防控措施，存在用藥成本大、生態(tài)風(fēng)險高的問題，考慮到其死亡率不高，筆者認(rèn)為比較經(jīng)濟的措施是在鰱鳙魚起捕后采用藥物短期浸浴殺滅蟲體。筆者開展藥物浸浴對中華湖蛭的殺滅效果試驗，以期為大型水體鰱鳙魚中華湖蛭的安全有效防控提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

2020年6月從活體鳙魚鰓部采集到體長（45±5） mm、體寬（15±5） mm的魚蛭（暫命名為JH20200616）500多條，用于鑒定及藥物殺滅效果試驗。另外，從該水庫選擇鰓部感染中華湖蛭數(shù)量相近［（20±2）條］、規(guī)格（3±1） kg/尾的鰱魚150尾，暫養(yǎng)在實驗室養(yǎng)殖桶內(nèi)。試驗用水為經(jīng)曝氣24 h以上的自來水，試驗期間保持曝氣，pH為6.7～7.2，溶解氧7.5～9.0? mg/L，水溫23.5～25.5 ℃。

1.2試驗藥物

選擇4種常用殺蟲藥物用于試驗，敵百蟲（含量≥90%，南通江山農(nóng)藥化工股份有限公司）；五水硫酸銅（含量≥98%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；生石灰、川楝子均購自當(dāng)?shù)厥袌?。其中，川楝子研磨成粉，稱取2 g藥粉，加入400 mL蒸餾水經(jīng)文火煎煮1 h，冷卻后經(jīng)多層滅菌篩絹網(wǎng)過濾，再用滅菌水定量，調(diào)制成1 g/L的母液，5～7 ℃下放置備用。

1.3試驗方法

1.3.1形態(tài)與分子生物學(xué)鑒定。

取寄生蟲活體將其置于培養(yǎng)皿中，在蔡司體視顯微鏡（BHCS-LT004）下觀察，進行拍照和測量，并描述其外部形態(tài)特征。使用動物基因組 DNA 抽提試劑盒提取寄生蟲DNA，查閱文獻設(shè)計下列引物擴增其COI序列［3］。

F1為5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，R1為5′-TAAACTTCAGGGTGACCCAAAAAATCA-3′。

25 μL 反應(yīng)體系：ddH2O 12 μL，Taq 酶10 μL，正、反向引物和模板DNA各1 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 1 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。

PCR 擴增完成后，取 5 μL PCR擴增產(chǎn)物使用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站在線Blast數(shù)據(jù)庫進行序列同源性比較，并通過Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2離體條件下藥物對中華湖蛭成蟲的殺滅效果試驗。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，每種藥物配制5個藥物濃度梯度［4］（表1）置于燒杯中，每個試驗燒杯中分別放入中華湖蛭10條，每組設(shè)3個重復(fù)。藥物浸浴1 h后，觀察并記錄中華湖蛭死亡情況，死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)為中華湖蛭身體伸長、針刺無反應(yīng)。

1.3.3在體條件下藥物對中華湖蛭成蟲的殺滅效果試驗。

根據(jù)離體試驗結(jié)果，選擇生石灰、川楝子和敵百蟲對已感染中華湖蛭的鰱魚進行在體試驗。藥物濃度同表1，養(yǎng)殖桶試驗水體300 L，并在每個桶內(nèi)放養(yǎng)3尾鰱魚，每組設(shè)3個重復(fù)。將鰱魚在藥物中浸浴1 h后撈至清水養(yǎng)殖桶內(nèi)繼續(xù)觀察，試驗期間若出現(xiàn)魚體體色變淡，應(yīng)迅速中斷試驗，將其撈至清水養(yǎng)殖桶內(nèi)，試驗24 h后再對魚體寄生的蟲體情況進行檢查并記錄。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)均使用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，并使用Origin軟件繪圖。

2結(jié)果與分析

2.1形態(tài)特征及鑒定

此次發(fā)現(xiàn)寄生在鳙、鰱魚鰓上的蟲體呈長橢圓形，背面隆起，腹面平坦。體長25～60 mm，體寬8～22 mm，頭部呈橫卵圓形，軀干部寬而長，略呈長卵圓形，中部最寬闊。頸部狹且短。背面深褐色，腹面灰白色，前、尾兩吸盤和頸部均呈米黃色，尾吸盤部位呈深杯狀，腹部兩側(cè)有膜質(zhì)的搏動囊11對，能有節(jié)律地搏動，除第1對較小外，其余10對均較大，主要寄生在鰱和鳙魚鰓弓上以及鰓絲基部或鰓瓣之間（圖1）。這與《中國動物志：環(huán)節(jié)動物門 蛭綱》［5］

所描述的中華湖蛭（Limnotrachelobdella sinensis）的形態(tài)特征相吻合。根據(jù)線粒體基因COI進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)寄生蟲JH20200616與Limnotrachelobdella sinensis（LC275140.1）聚為一支（圖2），因此根據(jù)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)數(shù)據(jù)確定為中華湖蛭。

2.2離體條件下藥物對中華湖蛭的殺滅效果

選擇4種常用漁藥進行離體條件下對中華湖蛭的殺滅效果試驗。結(jié)果表明，生石灰200.00 mg/L、川楝子400.00 mg/L、敵百蟲4.00 mg/L浸浴1 h可以全部殺滅中華湖蛭（圖3）。硫酸銅濃度高達200.00 mg/L也只能使60%的中華湖蛭死亡，殺滅效果不理想。

2.3在體條件下藥物對中華湖蛭的殺滅效果

在體條件下將感染中華湖蛭的鰱魚進行不同濃度藥物浸浴，1 h后撈至清水中暫養(yǎng)24 h進行觀察。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，濃度25.00和50.00 mg/L川楝子浸浴1 h的殺滅效果較差，24 h后觀察發(fā)現(xiàn)蟲體仍比較活躍；濃度100.00和200.00 mg/L川楝子浸浴后，24 h觀察發(fā)現(xiàn)蟲體大部分脫落死亡，但仍有少量蟲體存活；濃度400.00 mg/L川楝子浸浴24 h后蟲體全部死亡脫落，在此期間鰱魚活動正常，未見不良反應(yīng)。

0.25和0.50 mg/L敵百蟲浸浴1 h對中華湖蛭的殺滅效果較差，24 h后觀察發(fā)現(xiàn)蟲體仍比較活躍；1.00 mg/L敵百蟲浸浴后，24 h觀察發(fā)現(xiàn)蟲體有少量脫落，仍有少量蟲體存活；2.00 mg/L敵百蟲浸浴1 h可以有效抑制中華湖蛭的活性，且鰱魚活動正常，撈至清水中24 h后蟲體全部死亡脫落；4.00 mg/L敵百蟲浸浴20 min后鰱魚出現(xiàn)不適反應(yīng)，主要表現(xiàn)為體色變淡發(fā)白，迅速撈至清水中后很快恢復(fù)正常，24 h后檢查發(fā)現(xiàn)蟲體已全部死亡脫落。

12.50、25.00、50.00 mg/L生石灰浸浴1 h對中華湖蛭的殺滅效果較差，24 h后觀察發(fā)現(xiàn)蟲體仍比較活躍；100.00 mg/L生石灰浸浴1 h可以有效抑制中華湖蛭的活性，且鰱魚活動正常，撈至清水中24 h后蟲體全部死亡脫落；200.00 mg/L生石灰浸浴5 min后鰱魚出現(xiàn)不適反應(yīng)，主要表現(xiàn)為活動劇烈，體色變淡發(fā)白，迅速撈至清水中后很快恢復(fù)正常，24 h后檢查發(fā)現(xiàn)蟲體僅有部分死亡脫落，少數(shù)蟲體仍然存活。

綜上所述，對于感染中華湖蛭的鰱鳙魚建議使用400.00 mg/L 川楝子、2.00 mg/L敵百蟲、100.00 mg/L生石灰浸浴1 h后撈至清水中暫養(yǎng)，可對中華湖蛭起到較好的殺滅作用，但對鰱鳙魚安全。

3討論

隨著潔水漁業(yè)的發(fā)展，我國大多數(shù)湖泊水庫以放養(yǎng)鰱鳙魚為主，2019—2022年在浙江地區(qū)多個水質(zhì)清澈的水庫中出現(xiàn)中華湖蛭感染病例，對鰱鳙魚養(yǎng)殖的危害較大。從病害流行情況來看，中華湖蛭寄生在大規(guī)格鰱、鳙魚（平均體重≥3 kg/尾）鰓弓和鰓絲基部，感染率在90%以上，感染強度大小不等，一般感染強度為8～20條/尾。目前發(fā)現(xiàn)中華湖蛭主要感染鳙魚，其他魚類幾乎不感染，僅發(fā)現(xiàn)在少數(shù)大眼華鳊（Sinibrama macrops）鰓上有少量寄生。每年10月底或11月初會在鰱、鳙魚鰓上偶見發(fā)生，3月份鰱鳙魚鰓上就有肉眼可見、數(shù)量不等的幼蟲；4—6月份為感染高峰，主要觀察到中華湖蛭的成蟲，個體較大，感染強度高的達到50～60條/尾；7月份高溫以后自行脫落。調(diào)查發(fā)現(xiàn)水溫在27 ℃以上時鰱鳙魚鰓絲寄生的中華湖蛭數(shù)量明顯減少，僅2～4條/尾。中華湖蛭成蟲背面深褐色，腹面灰白，與魚鰓顏色較為相似，而且寄生在鰓瓣之間，不容易被發(fā)現(xiàn)。寄生處魚鰓表皮組織受到破壞，出現(xiàn)發(fā)白、潰爛的現(xiàn)象，有的魚鰓甚至出現(xiàn)空洞，引起貧血和繼發(fā)感染，影響鰱鳙魚正常生長。

大水面魚類的寄生蟲防控一直是漁業(yè)病害防控中的難點。有關(guān)魚蛭的藥物防控報道較少，唐毅等［6］對寬體金線蛭（Whitmania pigra）幼體的急性毒性試驗結(jié)果表明，寬體金線蛭幼蛭對伊維菌素、苯扎溴銨、戊二醛敏感，而對高錳酸鉀、聚維酮碘、二氧化氯不敏感。洪萬樹等［7］研究發(fā)現(xiàn)單獨使用1 mg/L敵百蟲、100～200 mg/L福爾馬林或者二者混合使用對大彈涂魚（Boleophthalmus pectinirostris）寄生魚蛭的殺滅效果較好，而硫酸銅對其無明顯殺滅作用，且高濃度硫酸銅會使宿主產(chǎn)生不適反應(yīng)。王永波等［8］認(rèn)為1? mg/L的敵百蟲和福爾馬林對石斑魚（Epinephelus sp.）魚蛭的殺滅效果有限，0.05 mL/L 阿維菌素可以有效殺滅石斑魚魚蛭。敵百蟲作為一種有機磷酯殺蟲劑，因其高效、低毒、低殘留性而被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖類寄生蟲的防治，但其長期使用仍會對魚體造成一定的毒害作用，會產(chǎn)生魚體殘留和水質(zhì)污染等問題［9-10］。另外，王永波等［8］發(fā)現(xiàn)南美白對蝦（Penaeus vanname）可以攝食1～4 cm的魚蛭，石斑魚和蝦苗混養(yǎng)可以一定程度上防止魚蛭的暴發(fā)。

有別于池塘或小水體魚蛭的用藥，對水庫鰱、鳙魚寄生的中華湖蛭防控，從經(jīng)濟和可操作的角度來看，將鰱、鳙魚進行短時間浸浴的效果最好。為了保證魚產(chǎn)品的安全性，筆者建議使用400.00 mg/L川楝子、100.00 mg/L生石灰浸浴1 h進行殺蟲后清水暫養(yǎng)，一般蟲體會死亡脫落。川楝子所含的川楝素對寄生蟲腸肌產(chǎn)生興奮、麻痹的作用，最終導(dǎo)致蟲體能量不足，附著能力降低，繼而被驅(qū)離于體外［11］。王高學(xué)等［12］研究22種植物提取液以及川楝素等化合物對金魚指環(huán)蟲的殺滅效果，發(fā)現(xiàn)川楝素對指環(huán)蟲的殺滅作用最強。王大鵬等［13］研究發(fā)現(xiàn)將刺激隱核蟲（Cryptocaryon irritans）包囊置于濃度60 mg/L、由苦楝樹葉和其他幾味中草藥制成的復(fù)方藥劑中浸浴4.0～4.5 h，可徹底將蟲體殺滅。生石灰的作用機理是通過提高水體pH來殺滅水體中的寄生蟲或細菌等，最終在水中形成CaCO3 ，因而它是無殘留、綠色環(huán)保的水產(chǎn)常用藥物之一［14］。雖然川楝子、生石灰等短時間浸浴對中華湖蛭具有較好的殺滅效果，但無法對庫區(qū)感染中華湖蛭的鰱鳙魚進行防控。因此，今后仍需要進一步研究中華湖蛭綠色安全的生態(tài)防控技術(shù)，實現(xiàn)長期和有效控制。

參考文獻

［1］劉建康，謝平.揭開武漢東湖藍藻水華消失之謎［J］.長江流域資源與環(huán)境，1999，8（3）：312-319.

［2］ 楊潼.關(guān)于湖蛭屬及其一新種的記述［J］.水生生物學(xué)報，1987，11（3）：268-273.

［3］ 肖凌.水蛭DNA鑒定、活性多肽分離及其作用機制的研究［D］.武漢：湖北中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

［4］ 劉冉，曹志會，趙月，等.PFOA和PFOS對大型蚤急性毒性試驗研究［J］.安全與環(huán)境工程，2015，22（4）：51-55，74.

［5］ 楊潼.中國動物志：環(huán)節(jié)動物門蛭綱［M］.北京：科學(xué)出版社，1996：97-100.

［6］ 唐毅，吳榮華，袁淵，等.六種常用漁藥對寬體金線蛭的急性毒性試驗［J］.淡水漁業(yè)，2019，49（3）：78-82.

［7］ 洪萬樹，張其永.大彈涂魚寄生蛭治療實驗研究［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2000，19（2）：7-10.

［8］ 王永波，符書源，李丙順，等.池塘養(yǎng)殖石斑魚魚蛭病防治實驗［J］.熱帶生物學(xué)報，2011，2（1）：59-62.

［9］ 徐維娜，張鑫，劉文斌.敵百蟲對異育銀鯽（Carassais auratus gibebio）毒性及其影響因素的研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2007，26（S1）：68-71.

［10］ ABUBAKAR M，ALI H，ALI SHAD S，et al.Trichlorfon resistance：Its stability and impacts on biological parameters of Bactrocera zonata （Diptera：Tephritidae）［J］.Applied entomology and zoology，2021，56（4）：473-482.

［11］ 孫裔雷，王荻，劉紅柏.中草藥防治淡水魚小瓜蟲病的研究進展［J］.生物技術(shù)通訊，2015，26（2）：301-304.

［12］ 王高學(xué)，程超，陳安良，等.22種植物提取物及其6種化合物對魚類指環(huán)蟲的殺滅研究［J］.西北植物學(xué)報，2006，26（12）：2567-2573.

［13］ 王大鵬，何安尤，謝達祥，等.龍膽石斑刺激隱核蟲病防治技術(shù)研究［J］.水產(chǎn)科技情報，2013，40（1）：22-26.

［14］ 周彤彤，常國亮，吳楠，等.生石灰對中華絨螯蟹消化酶活性及免疫功能的影響［J］.淮陰師范學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2015，14（1）：56-59.