凡納濱對蝦細(xì)菌的分離與鑒定

錢詩悅 王興強(qiáng) 鄒易恒 曹梅 劉栩華 李永

摘要以凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）為研究對象，通過DNA提取和PCR擴(kuò)增分離鑒定樣本中的歐文斯弧菌（Vibrio owensii）、哈維氏弧菌（V.harveyi）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）、副溶血性弧菌（V.parahaemolyticus）、新喀里多尼亞弧菌（V.neocaledonicus）、創(chuàng)傷弧菌（V.vulnificus）、坎式弧菌（V.campbellii）、霍亂弧菌（V.cholerae）、含CTX腸毒素霍亂弧菌（V.cholera CTX）、擬態(tài)弧菌（V.mimicu）和河流弧菌（V.fluvialis）11種致病性弧菌。根據(jù)樣本TCBS平板檢測結(jié)果，統(tǒng)計(jì)樣本中所檢測弧菌的重復(fù)出現(xiàn)率，按出現(xiàn)頻率逐級分析，對檢出率較高的歐文斯弧菌（V.owens）、哈維氏弧菌（V.harveyi）和溶藻弧菌（V.alginolyticus）進(jìn)行詳細(xì)探討，并根據(jù)養(yǎng)殖過程出現(xiàn)的具體情況制定相應(yīng)的預(yù)防和控制策略，為凡納濱對蝦細(xì)菌性疾病的防治提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞凡納濱對蝦；細(xì)菌；分離；鑒定

中圖分類號S 945.4+9文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2023）24-0074-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.24.016

Isolation and Identification of Bacteria from Litopenaeus vannamei

QIAN Shiyue，WANG Xingqiang，ZOU Yiheng et al

（College of Marine Science and Fisheries，Jiangsu Ocean University，Lianyungang，Jiangsu 222005）

AbstractIn this paper，Litopenaeus vannamei were taken as the research object，11 pathogenic Vibrios，including V.owensii，V.harveyi，V.alginolyticus，V.parahaemolyticus，V.neocaledonicus，V.vulnificus，V.campbellii，V.cholerae，V.cholera CTX，V.mimicu and V.fluvialis were isolated and identified by DNA extraction and PCR amplification.According to the detection results of the sample TCBS plate，the repeated occurrence rate of vibrios detected in the sample were counted，analyzing step by step according to the occurrence frequency.V.owens，V.harveyi and V.alginolyticus with high detection rate were discussed in detail，formulating the corresponding prevention and control strategies according to the specific situation in the breeding process and providing technical support for the prevention and treatment of bacterial diseases of L.vannamei.

Key wordsLitopenaeus vannamei;Bacteria;Separation;Identification

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）是目前產(chǎn)量最高的養(yǎng)殖甲殼類，它具有生長速度快、抗病能力強(qiáng)和出肉率高等優(yōu)點(diǎn)。從2010年開始，在人工養(yǎng)殖過程中病害頻發(fā)，導(dǎo)致成活率顯著降低甚至絕收，嚴(yán)重影響其養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。凡納濱對蝦常患的病害包括細(xì)菌性疾病，病毒性疾病以及寄生蟲病，其中細(xì)菌性疾病較為常見，如副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、鰻弧菌（V.anguillarum）、歐文斯弧菌（Vibrio owensii）、哈維氏弧菌（V.harveyi）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）、新喀里多尼亞弧菌（V.neocaledonicus）、創(chuàng)傷弧菌（V.vulnificus）、坎式弧菌（V.campbellii）、霍亂弧菌（V.cholerae）、含CTX腸毒素霍亂弧菌（V.cholera CTX）、擬態(tài)弧菌（V.mimicu）和河流弧菌（V.fluvialis）以及假單胞菌（Pseudomonas）等引起的相關(guān)疾病，其主要表現(xiàn)有紅體、紅腿、腸炎和爛鰓等癥狀。

陳健舜等［1］對浙江地區(qū)凡納濱對蝦紅體病病原研究后，從病蝦體內(nèi)分離出的病原體大多為弧菌，包括副溶血性弧菌、坎氏弧菌和需鈉弧菌（V.natriegens），病菌主要分布在凡納濱對蝦體內(nèi)、甲殼上皮和結(jié)締組織等部位，處于急性期的對蝦通體呈紅色，特別是尾扇和游泳足最為明顯。研究表明，對蝦的肝胰腺受到破壞后能夠分泌出大量的肝胰腺類胡蘿卜素，引起紅體癥狀［2］。夏秋季雨水較多，養(yǎng)殖水體鹽度較低，而養(yǎng)殖水溫明顯升高，凡納濱對蝦易受嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）的感染，可誘發(fā)紅腿病；當(dāng)凡納濱對蝦患嚴(yán)重的紅腿病時(shí)，它的胃壁會呈現(xiàn)紅色，肝部表現(xiàn)橙黃色［3］。張玲宏等［4］通過顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)，紅腿病蝦患部紅色素細(xì)胞呈擴(kuò)張狀態(tài)，鰓絲末端也存在大量活動的短桿菌，即弧菌。腸炎病多發(fā)于7—8月，主要由嗜水氣單胞菌、大腸桿菌（Escherichia coli）和沙門氏菌（Salmonella）等細(xì)菌感染引起，腸道、胃部呈血紅色，中腸紅腫、后腸渾濁［5］。該時(shí)期水體溫度偏高，加上未按時(shí)清理餌料和糞便，易引起缺氧和呼吸困難。當(dāng)凡納濱對蝦細(xì)菌性腸炎發(fā)病后，輕則營養(yǎng)吸收能力下降導(dǎo)致對蝦營養(yǎng)不良、脫殼困難、生長緩慢和空腸空胃等現(xiàn)象，重則導(dǎo)致凡納濱對蝦體質(zhì)與抗病力下降，容易繼發(fā)其他細(xì)菌病或病毒病，導(dǎo)致偷死或大面積死亡。黃雪敏［6］對2018年廣東省湛江地區(qū)春夏季凡納濱對蝦爛鰓病主要病原進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)為非發(fā)光哈維氏弧菌，加上水體污染進(jìn)一步引起藻類死亡，病原菌的大量蓄積于對蝦鰓部，進(jìn)一步破壞其組織；病蝦鰓絲腫大呈灰色，潰爛，缺氧，影響吃食，呼吸艱難和食欲不振；水中大量的藻類顆粒能夠通過呼吸進(jìn)入鰓部，長時(shí)間蓄積則會引起黑鰓病以及爛鰓病。

鑒于凡納濱對蝦細(xì)菌性疾病頻發(fā)的現(xiàn)狀，該研究通過DNA提取和PCR擴(kuò)增分離鑒定樣本中的歐文斯弧菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、新喀里多尼亞弧菌、創(chuàng)傷弧菌、坎式弧菌、霍亂弧菌、含CTX腸毒素霍亂弧菌、擬態(tài)弧菌和河流弧菌11種致病性弧菌，以期為凡納濱對蝦細(xì)菌性疾病病原菌的確定和對癥下藥提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1DNA提取

利用試劑盒提取弧菌DNA，提取的DNA可置于2～8 ℃保存，3 d內(nèi)使用，或-20 ℃以下長期凍存。

1.2PCR擴(kuò)增

PCR管中分別加入17 μL的擴(kuò)增反應(yīng)液，然后向每個(gè)PCR管的液面下加入3 μL對蝦樣本DNA模板或陰性對照，加入后對樣本進(jìn)行輕輕吸打，之后將蓋子蓋上，離心數(shù)秒備用。根據(jù)PCR標(biāo)準(zhǔn)程序擴(kuò)增，50 ℃ 2 min；94 ℃ 4 min；（94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s），40循環(huán)；（94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s），3循環(huán)；4 ℃保存。當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)完成后，馬上檢測PCR產(chǎn)物或置于-20 ℃保存。

1.3弧菌芯片鑒定

必須在其他的通風(fēng)房間內(nèi)進(jìn)行，切勿與樣本DNA提取、PCR擴(kuò)增的操作在同一環(huán)境內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)過程中，需提前20 min把微孔板恒溫振蕩器打開，溫度控制在45 ℃。將對應(yīng)樣本數(shù)量的晶格取出，進(jìn)行標(biāo)記編號。每份樣本應(yīng)將600 μL 反應(yīng)液1和待檢樣本的20 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入反應(yīng)槽中。將晶格轉(zhuǎn)入微孔板恒溫振蕩器，1 500 r/min 振蕩10 min。反應(yīng)結(jié)束后，把晶格取出，打開蓋子，然后將晶格稍微傾斜，讓反應(yīng)槽內(nèi)的液體都被吸凈。根據(jù)實(shí)際的檢測數(shù)量，將預(yù)先準(zhǔn)備好的混合反應(yīng)液1和反應(yīng)液2放置到15 mL的試管中，反應(yīng)液1每份取量為600 μL，反應(yīng)液2每份取1 μL。向每個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)分別加入600 μL反應(yīng)液1和反應(yīng)液2預(yù)混合液，振蕩儀1 500 r/min振蕩3 min。打開蓋子，把晶格稍微傾斜，以使反應(yīng)槽內(nèi)的液體被吸收干凈。在每個(gè)反應(yīng)槽中加入2 mL的buffer，蓋蓋，置于恒溫振蕩儀，1 500 r/min，2 min。為確保將芯片完全浸沒，需要在反應(yīng)槽內(nèi)加入500 μL的反應(yīng)液3，然后在恒溫條件下，用1 500 r/min 的振蕩儀振蕩3 min。把自來水依次加入每個(gè)反應(yīng)槽后，緩慢搖晃晶格5 s，觀察水中不同芯片上的試驗(yàn)結(jié)果。質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)為陰性對照品的膜芯片除HC（用于質(zhì)控雜交過程的）存在顏色的位置顯示外，其他的均不出現(xiàn)任何顯色，出現(xiàn)顏色的顯示則表示該區(qū)域可能存在環(huán)境污染情況。

1.4結(jié)果判讀試驗(yàn)結(jié)果如果HC呈陽性，NC探針呈陰性，則可以判斷試驗(yàn)結(jié)果滿足條件，再將不同菌種鑒定試驗(yàn)樣本的顏色與芯片探針排布圖進(jìn)行對比，判讀致病性弧菌的種類。

2結(jié)果與分析

由圖1可以看出，蔣濤樣本在檢測指標(biāo)內(nèi)其優(yōu)勢弧菌為哈維氏弧菌和歐文斯弧菌（圖1a）。張艷樣本TCBS平板培養(yǎng)顯示未見黃色菌落與綠色菌落，在檢測指標(biāo)內(nèi)其存在弧菌為溶藻弧菌和歐文斯弧菌（圖1b）。王祥友樣本TCBS平板培養(yǎng)顯示黃色菌落，在檢測指標(biāo)內(nèi)其存在弧菌為副溶血性弧菌和歐文斯弧菌（圖1c）。文帥第2個(gè)樣本TCBS平板培養(yǎng)顯示為少量黃色菌落，在檢測指標(biāo)內(nèi)未檢出弧菌（圖1d）；第2個(gè)樣本TCBS平板培養(yǎng)顯示黃色菌落，在檢測指標(biāo)內(nèi)其存在優(yōu)勢弧菌為副溶血性弧菌，存在弧菌為哈維氏弧菌（圖1e）。宋忠鑫樣本TCBS平板培養(yǎng)顯示為黃色菌落和綠色菌落，在檢測指標(biāo)內(nèi)其存在弧菌為溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌和歐文斯弧菌（圖1f）。宋忠良第1個(gè)樣本TCBS平板培養(yǎng)顯示為黃色菌落，在檢測指標(biāo)內(nèi)其優(yōu)勢弧菌為哈維氏弧菌，存在弧菌為溶藻弧菌（圖1g）；第2個(gè)樣本TCBS平板培養(yǎng)顯示黃色菌落，在檢測指標(biāo)內(nèi)其存在弧菌為溶藻弧菌、新喀里多尼亞弧菌和歐文斯弧菌（圖1h）。房根善第1個(gè)樣本TCBS平板培養(yǎng)顯示為黃色菌落，在檢測指標(biāo)內(nèi)其存在弧菌為副溶血性弧菌、溶藻弧菌和歐文斯弧菌（圖1i）；第2個(gè)樣本TCBS平板培養(yǎng)顯示為黃色菌落和少量綠色菌落，在檢測指標(biāo)內(nèi)其優(yōu)勢弧菌為溶藻弧菌，存在弧菌為哈維氏弧菌和歐文斯弧菌（圖1j）。陳永利樣本TCBS平板培養(yǎng)未顯示菌落，在檢測指標(biāo)內(nèi)未檢出弧菌（圖1k）。辛偉樣本TCBS平板培養(yǎng)顯示為黃色菌落，在檢測指標(biāo)內(nèi)存在弧菌為哈維氏弧菌和歐文斯弧菌（圖1l）。董淑花樣本TCBS平板培養(yǎng)顯示為黃色菌落，在檢測指標(biāo)內(nèi)其優(yōu)勢弧菌為哈維氏弧菌和歐文斯弧菌（圖1m）。孫成梅樣本TCBS平板培養(yǎng)顯示為黃色菌落，在檢測指標(biāo)內(nèi)其優(yōu)勢弧菌為副溶血性弧菌、哈維氏弧菌和歐文斯弧菌（圖1n）。夏正發(fā)樣本TCBS平板培養(yǎng)顯示為黃色菌落，在檢測指標(biāo)內(nèi)其優(yōu)勢弧菌為溶藻弧菌和哈維氏弧菌，存在弧菌為副溶血性弧菌和新喀里多尼亞弧菌（圖1o）。董淑志樣本TCBS平板培養(yǎng)顯示為黃色菌落和綠色菌落，在檢測指標(biāo)內(nèi)其優(yōu)勢弧菌為歐文斯弧菌，存在弧菌為溶藻弧菌和哈維氏弧菌（圖1p）。陳勝利樣本TCBS平板培養(yǎng)顯示為綠色菌落，在檢測指標(biāo)內(nèi)其存在弧菌為新喀里多尼亞弧菌和歐文斯弧菌（圖1q）。沈衛(wèi)飛樣本TCBS平板培養(yǎng)顯示為黃色菌落，在檢測指標(biāo)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)弧菌（圖1r）。陳文貴TCBS平板培養(yǎng)顯示為黃色菌落，在檢測指標(biāo)內(nèi)優(yōu)勢弧菌為新喀里多尼亞弧菌和歐文斯弧菌，存在弧菌為副溶血性弧菌和溶藻弧菌（圖1s）。毛峰海TCBS平板培養(yǎng)顯示無菌落，在檢測指標(biāo)內(nèi)未檢測出弧菌（圖1t）。

經(jīng)過對20個(gè)樣本中不同弧菌分布統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，歐文斯弧菌在樣本中存在數(shù)量為13個(gè)，哈維氏弧菌和溶藻弧菌存在數(shù)量均為9個(gè)，副溶血性弧菌存在數(shù)量為6個(gè)，新喀里多尼亞弧菌存在數(shù)量為4個(gè)，創(chuàng)傷弧菌存在數(shù)量為1個(gè)，其余弧菌種類在樣本中未能發(fā)現(xiàn)（表1）。

3結(jié)論與討論

歐文斯弧菌可能帶導(dǎo)致急性肝胰腺壞死癥（EMS）的毒力因子，存在ACMM642等高致病性毒株，水體中含有100 CFU/mL該毒株，即可導(dǎo)致對蝦死亡，需要嚴(yán)格防控［7］。哈維氏弧菌是一種重要的致病性海洋弧菌之一，為近海海洋動物體表或體內(nèi)正常菌群，其在水體或蝦體內(nèi)載量較高時(shí)容易導(dǎo)致對蝦發(fā)光病和胰島細(xì)胞壞死病，該弧菌數(shù)量較少時(shí)屬正常范圍［8］。溶藻弧菌是養(yǎng)殖水體主要弧菌病原，數(shù)量較多容易直接或間接導(dǎo)致蝦苗幼體菌血癥、對蝦紅體癥、細(xì)菌白斑病，數(shù)量較少屬于正常［9］。副溶血性弧菌是養(yǎng)殖水體主要病原，即使有少量數(shù)量時(shí)若在養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)毒理蛋白toxinA/B，也可能爆發(fā)EMS；由于EMS死亡率較高，故需要嚴(yán)格防控［10］。新喀里多尼亞弧菌在今年最新的報(bào)道中指出，該弧菌可能是引發(fā)“玻璃苗”的重要病源之一，在玻璃苗中，該菌和溶藻弧菌、副溶血性弧菌為優(yōu)勢菌種［11］?？彩匣【梢詫?dǎo)致EMS，但世界動物組織尚未將其列入EMS病原菌，但考慮EMS具有較強(qiáng)的致病性，故暫將其定位為需要較嚴(yán)格防控的弧菌種［12］?；魜y弧菌數(shù)量較多時(shí)易導(dǎo)致對蝦紅體病，在多處對蝦養(yǎng)殖水體中爆發(fā)，導(dǎo)致較高的對蝦排塘率，該弧菌數(shù)量少時(shí)屬于正常范圍［13］。含CTX腸毒素霍亂弧菌致病性較普通霍亂弧菌更強(qiáng)，發(fā)病癥狀為行動呆滯，時(shí)而浮頭，隨著病情加重全身肌肉發(fā)白，一般在1周內(nèi)死亡，需要嚴(yán)格控制［14］。河流弧菌可引發(fā)對蝦的紅體綜合征，容易在短期內(nèi)迅速增殖，故需要嚴(yán)格控制［15］。擬態(tài)弧菌能引起水產(chǎn)動物的多種弧菌病，如蟹類的氣泡病，黃顙魚潰爛病等，雖目前未見其對蝦養(yǎng)殖影響的明顯案例報(bào)道，單考慮其含有溶血素、黏附素、外毒素和腸毒素等多種毒素，存在與其他弧菌協(xié)同致病的可能，對蝦養(yǎng)殖的潛在病原，數(shù)量較少時(shí)屬正常范圍［16］。創(chuàng)傷弧菌是三大致病性弧菌之一，同時(shí)也是一種人魚共患病原菌，是人類和水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的重要病原弧菌。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，若創(chuàng)傷弧菌超標(biāo)，可使許多種經(jīng)濟(jì)動物患病，如羅非魚、金鯧魚、安圭拉鰻魚、鱘魚、草魚和南美白對蝦等，該細(xì)菌對對蝦養(yǎng)殖而言，數(shù)量少時(shí)屬正常范圍［17］。

根據(jù)20個(gè)樣本弧菌TCBS平板檢測結(jié)果，歐文斯弧菌在樣本中存在數(shù)量最多，哈維氏弧菌和溶藻弧菌存在數(shù)量居中，副溶血性弧菌和新喀里多尼亞弧菌存在數(shù)量較少，創(chuàng)傷弧菌存在數(shù)量最少，因而在購買蝦苗時(shí)，要選擇能提供檢驗(yàn)檢疫合格證的正規(guī)渠道，才能有效地從源頭控制病原體進(jìn)入塘中。蝦苗的放養(yǎng)數(shù)量不能過大，否則容易減小蝦的活動空間，從而蝦的攝食量會減少影響營養(yǎng)的吸收，蝦的生長將會放慢；同時(shí)活動空間減少，會增加蝦的相互碰撞刺傷，受傷的蝦容易感染病原體從而引發(fā)疾病［18］。王淑生［19］研究發(fā)現(xiàn)，好的水質(zhì)對養(yǎng)蝦十分重要，想要養(yǎng)好蝦需要將水質(zhì)養(yǎng)好，良好的水質(zhì)就是水質(zhì)中具有良好的藻相，這是養(yǎng)殖對蝦成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在養(yǎng)殖模式上，主要選用生態(tài)養(yǎng)殖方式。生態(tài)養(yǎng)殖模式具有水體空間進(jìn)行了合理的利用，水體的自然凈化能力強(qiáng)，從而減少蝦的患病等優(yōu)勢，同時(shí)生態(tài)養(yǎng)殖方式可以減少投入成本，從而提高經(jīng)濟(jì)效益。為進(jìn)一步防治紅腿、紅體病，應(yīng)于季節(jié)交替時(shí)全面消毒養(yǎng)殖池，預(yù)防腸炎病的有效措施是定期向水池中潑灑有益活菌，包括EM菌、芽孢桿菌、硝化細(xì)菌等。這樣可以保持水質(zhì)優(yōu)良，水中的氨、氮和亞硝酸鹽等含量不超標(biāo)，同時(shí)保持水質(zhì)中的菌種平衡，不會造成藍(lán)藻過量繁殖［20］。

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