結(jié)核分枝桿菌抗原檢測(cè)研究進(jìn)展

戴振華 ，郭蘭芹 ，張賀秋 ，馮曉燕

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；2.華北石油總醫(yī)院，河北 任丘 062552

結(jié)核病（tuberculosis，TB）是一種古老的疾病，由于缺乏有效疫苗，缺乏高特異性和敏感性診斷試劑，以及耐藥性結(jié)核病的不斷涌現(xiàn)等原因，該病仍然是全球公共衛(wèi)生的重大威脅，每年有超過200萬人死于TB[1]。2009年世界衛(wèi)生組織發(fā)布報(bào)告，2008年中國(guó)TB發(fā)病100萬～160萬人，僅次于印度，居世界第2位。因此，TB的預(yù)防和控制在我國(guó)顯得尤為重要。

有效控制TB的障礙在于缺乏早期、準(zhǔn)確的診斷方法。分枝桿菌培養(yǎng)是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時(shí)長(zhǎng)且相對(duì)昂貴；涂片鏡檢法檢出率低；分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和操作要求較高，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果；特異性的細(xì)胞免疫檢測(cè)，因在發(fā)展中國(guó)家人群中結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的潛伏感染率高，不適合推廣使用；臨床癥狀及胸部X線檢查結(jié)果不是特異性的，需要其他輔助診斷。再者，肺外結(jié)核、艾滋病合并感染的TB、嬰幼兒感染的TB、菌陰TB的診斷對(duì)上述方法都是巨大的挑戰(zhàn)。

機(jī)體受到MTB感染后,體內(nèi)首先出現(xiàn)的是MTB特異性抗原。因此，MTB抗原檢測(cè)作為TB早期診斷方法可能具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

1 MTB抗原檢測(cè)的方法

1.1 凝集試驗(yàn)

凝集試驗(yàn)是顆粒性抗原與相應(yīng)抗體，或表面包被抗原（抗體）的顆粒狀物質(zhì)與相應(yīng)抗體（抗原）在電解質(zhì)存在的條件下相互結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的凝集團(tuán)現(xiàn)象。1984年，Krambovitis等首次報(bào)道了膠乳凝集試驗(yàn)在TB診斷中的應(yīng)用[2]。Sada等使用協(xié)同凝集技術(shù)檢測(cè)活動(dòng)性TB患者標(biāo)本中的脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomanna，LAM），涂片陽性患者血清檢測(cè)的敏感性為88%，抗酸桿菌陰性患者痰液檢測(cè)敏感性為67%，在人免疫缺陷病毒（HIV）和TB共感染患者中檢測(cè)的敏感性為57%，但特異性達(dá)到100%[3]。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA是一種酶聯(lián)免疫技術(shù)，用于檢測(cè)包被于固相板孔中的待測(cè)抗原或抗體。即用酶標(biāo)記抗體，將已知抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相載體表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，最后通過酶作用于底物后顯色來判斷結(jié)果。1983年，Sada等首次用雙抗體夾心ELISA（sELISA）檢測(cè)腦脊液（CSF）中MTB抗原，取得了較為理想的結(jié)果[4]。其后國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者應(yīng)用sELISA方法對(duì)MTB抗原的檢測(cè)進(jìn)行了探索，檢測(cè)了CSF[5-6]、痰液[7]、血清[5,8-10]和尿液[11-15]標(biāo)本中的MTB抗原，匯總敏感性為44%～91%，匯總特異性為86%～100%。

1.3 免疫斑點(diǎn)法（dot immunobinding assay，Dot-Iba）

Dot-Iba是繼ELISA后發(fā)展起來的另一形式的固相標(biāo)記免疫測(cè)定法，其特點(diǎn)是以微孔膜為載體，陽性結(jié)果在膜上出現(xiàn)著色斑點(diǎn)。與ELISA法相比，Dot-Iba操作更為簡(jiǎn)單，所需試劑少，結(jié)果肉眼可見，檢測(cè)結(jié)果可長(zhǎng)期保存，不需特殊設(shè)備，易于普及和推廣。Deodhar等采用Dot-Iba，不僅可檢出88.88%的痰涂片陽性-培養(yǎng)陽性病例，也能檢出81.89%涂片陰性-培養(yǎng)陽性病例。如果涂片和斑點(diǎn)印跡ELISA的結(jié)果相結(jié)合，91.08%的培養(yǎng)陽性病例可被檢出[16]。

1.4 免疫金標(biāo)技術(shù)

該技術(shù)是在Dot-Iba基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型免疫學(xué)標(biāo)記和檢測(cè)技術(shù)，主要包括免疫金標(biāo)層析法和免疫金標(biāo)滲濾法（Dot-immuogold filtration as?say，DIGFA）。與ELISA和Dot-Iba技術(shù)相比，其操作更為簡(jiǎn)便、快速，可將檢測(cè)時(shí)間縮短至5～15 min，且檢測(cè)的敏感性和特異性保持不變。Stavri于2003年首先應(yīng)用DIGFA技術(shù)檢測(cè)了TB患者血清和痰液中的 MTB 抗原[17]。Fabre[18]、Ben-Selma[19]、Alavi-Naini[20]等使用Patho-TB試劑盒（Anda Biologicals，法國(guó)）檢測(cè)TB患者痰液標(biāo)本中的MTB抗原，敏感性為89.5%～95%,特異性為70.2%～100%。

1.5 免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)是將已知抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體或抗原作為分子探針檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原或抗體。何俊瑛等利用免疫熒光技術(shù)對(duì)30例TB患者和30例正常人的CSF中單核細(xì)胞內(nèi)的MTB抗原進(jìn)行了檢測(cè)，敏感性為83.3%，特異性為100%[21]。Mukundan等在免疫熒光技術(shù)的基礎(chǔ)上用波導(dǎo)光學(xué)生物傳感器，在很短時(shí)間內(nèi)定量檢測(cè)HIV陽性TB患者血清和尿液中的LAM、早期分泌性抗原靶6（ESAT6）和抗原85復(fù)合物（Ag85），與ELISA相比靈敏度大幅度提高[22]。

2 MTB抗原檢測(cè)中的靶抗原

2.1 菌體細(xì)胞

將MTB減毒株H37Ra或卡介苗（BCG）株進(jìn)行超聲破碎，用抽提物免疫動(dòng)物，獲得anti-H37Ra或anti-BCG血清，作為待檢抗原的捕獲抗體。Sada等首先以sELISA法檢測(cè)TB患者CSF中的BCG抗原，檢測(cè)敏感性為81.25%，特異性為95%[4]。Venkatesh等通過反向被動(dòng)血凝試驗(yàn)（RPHA）檢測(cè)CSF中的MTB抗原，檢測(cè)敏感性為50%，特異性為80%[23]。

2.2 結(jié)核菌素的純蛋白衍生物（PPD）

PPD在早期MTB抗原檢測(cè)中有所研究。Sood等用sELISA檢測(cè)肺結(jié)核和結(jié)核性腦膜炎（TBM）患者血清和CSF標(biāo)本中的PPD，在血清中的檢測(cè)敏感性為73.3%，特異性為83.8%；在CSF中的檢測(cè)敏感性為76.4%，特異性為80.6%[24]。Mathai等用Dot-Iba技術(shù)檢測(cè)了30例TBM患者與40例正常受試者CSF中的PPD，檢測(cè)敏感性為83.3%，特異性為95%[25]。

2.3 脂阿拉伯甘露聚糖

LAM是分枝桿菌細(xì)胞壁的重要組成部分，包含9個(gè)單克隆抗體結(jié)合表位，是屬特異性抗原，具有較強(qiáng)的免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能，可刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，因而是TB血清學(xué)診斷應(yīng)用較廣的抗原。很多學(xué)者對(duì)體液中LAM的檢測(cè)進(jìn)行了研究，特別使人感興趣的是近幾年連續(xù)有報(bào)道在TB患者血清[9,26]、尿液[11-12,14-15,27]、痰液[7，28]及肺外結(jié)核患者的胸腔積液和CSF中[29-30]檢測(cè)到LAM抗原，檢測(cè)的敏感性為50%～91%，特異性為69%～100%。Dheda[31]、Lawn[32]和Mutetwa[13]的研究表明，HIV和TB共感染患者尿中LAM的檢測(cè)靈敏度明顯高于非共感染患者，也顯著高于痰鏡檢，LAM的檢出率與低CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)和臨床分期密切相關(guān)。說明尿LAM的檢測(cè)可預(yù)測(cè)TB免疫重建疾病的發(fā)展。

2.4 MPT64

相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）為 24×103，又名 MPB64，是MTB短期培養(yǎng)物濾過蛋白的主要成分之一，是最早被發(fā)現(xiàn)的MTB特異性抗原。MPT64可被大多數(shù)TB患者和結(jié)核感染者的免疫系統(tǒng)所識(shí)別，它既能刺激細(xì)胞免疫反應(yīng)，又能誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)。Kumar等用免疫層析法對(duì)從肉湯和羅氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)分離的54株MTB菌株及12株非MTB菌株進(jìn)行MPT64抗原檢測(cè)，得到的敏感性和特異性均為100%[33]。

2.5 14kD抗原

14kD抗原是從MTB培養(yǎng)濾液中分離出來的蛋白。Sumi等用14kD抗原免疫兔子，獲得相應(yīng)抗血清，應(yīng)用Dot-Iba和PCR技術(shù)同步檢測(cè)37例TBM患者和45例正常受試者CSF中的14kD抗原，Dot-Iba檢測(cè)的敏感性是75.7%，高于PCR的40.7%，兩者的特異性均為100%[34]。

2.6 38kD抗原

38kD抗原是一種定位在質(zhì)膜上的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，只在分枝桿菌復(fù)合群中表達(dá)，表達(dá)量是BCG的10倍，免疫原性強(qiáng)。38kD蛋白可刺激T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫應(yīng)答。劉志廣等用抗38kD蛋白的單克隆抗體，通過直接免疫熒光檢測(cè)法對(duì)41份TB患者的痰標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，敏感性為90.24%，顯著高于抗酸染色法的73.14%[35]。

2.7 31kD抗原

31kD抗原是一種絲氨酸蛋白酶抗原，從結(jié)核分枝桿菌H37Ra株培養(yǎng)基中得到。Bera等通過ELISA法檢測(cè)20例TBM患者CSF和血清中的31kD抗原及抗體。結(jié)果表明，在CSF中檢測(cè)31kD抗原的敏感性為90%，特異性為96%；檢測(cè)31kD抗體的敏感性為85%，特異性為96%。在血清中檢測(cè)31kD抗原的敏感性為80%，特異性為96%；檢測(cè)31kD抗體的敏感性為80%，特異性為94%[36]。

2.8 Ag85復(fù)合物（Ag85）

Ag85是一組具有較強(qiáng)細(xì)胞免疫及體液免疫活性的分枝桿菌分泌性蛋白,Mr為30×103～32×103，具有MTB種特異性和屬共同抗原決定簇，分枝桿菌各菌株均可分泌Ag85。Ag85復(fù)合物由3種同源蛋白質(zhì)Ag85A、Ag85B及Ag85C組成，其中有免疫作用的主要為Ag85A和Ag85B。Kashyap等通過sELISA檢測(cè)128例TB和69例非TB血清樣本中的Ag85復(fù)合物，檢測(cè)的敏感性為82%，特異性為86%[8]。

2.9 HSP65抗原

HSP65屬于MTB熱激蛋白（HSP）家族，在MTB感染人體后，HSP65會(huì)誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。Mudaliar等用抗HSP65單抗，對(duì)80名TB患者和80名對(duì)照受試者CSF中的HSP65抗原進(jìn)行檢測(cè)，敏感性為82.5%，特異性為90%[6]。Rajan等用抗HSP65單抗，通過ELISA法對(duì)188名TB患者和116名對(duì)照血清樣本中HSP65抗原進(jìn)行檢測(cè)，敏感性為82%，特異性為89%[10]。

2.10 培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP-10）

CFP10是低分子量分泌蛋白，由MTB的RD1區(qū)基因編碼，僅存在于致病性MTB中，BCG及其他非致病性分枝桿菌中則不存在。Stavri等用ELISA檢測(cè)痰標(biāo)本中的CFP-10抗原和血清中的CFP-10抗體，Dot-Iba檢測(cè)痰液中的抗原，敏感性為86.1%，特異性為92.9%；ELISA檢測(cè)血清中的抗體，敏感性為83.6%，特異性為95.4%[37]。

2.11 其他相關(guān)的MTB靶抗原

Chanteau等發(fā)現(xiàn)，45/47kD抗原檢測(cè)的敏感性較低，小于40%，特異性為95.6%，抗-45/47kD抗體檢測(cè)敏感性為76.9%，但特異性低，為73.2%[38]。El-Masry等用Fast-Dot-ELISA檢測(cè)TB患者血清中的20kD抗原，敏感性為90.8%，特異性為89.6%[39]。Attallah等用Dot-ELISA檢測(cè)TB和肺外TB患者血清中的55kD抗原，敏感性分別為87%和90%，而特異性均為97%[40]。張周云等采用sELISA檢測(cè)了139例活動(dòng)性TB患者、64例非TB肺部疾病患者和29例健康對(duì)照者血清中的MTB分泌蛋白desA抗原，敏感性為84.1%，特異性為92.19%[41]。

3 問題與展望

MTB抗原檢測(cè)作為TB早期診斷的方法備受關(guān)注，機(jī)體受到MTB感染后，體內(nèi)首先出現(xiàn)的是MTB特異性抗原，TB抗原檢測(cè)不受宿主免疫功能狀態(tài)的影響，可作為MTB存在的直接證據(jù)，避免了由于結(jié)核菌的抗原性較弱，或?qū)匍g和種間共同抗原決定簇的存在，以及TB患者免疫應(yīng)答低下等原因?qū)е碌捏w液免疫檢測(cè)或細(xì)胞免疫檢測(cè)的假陰性。TB具有高度傳染性，在MTB感染初期，對(duì)這種疾病早期、準(zhǔn)確的檢測(cè)，不僅能控制TB的蔓延，也能幫助醫(yī)生開始恰當(dāng)與及時(shí)的治療。

近20年來，在MTB抗原檢測(cè)研究方面，除了LAM外，對(duì)其他特異性抗原的靶向研究較少，而且由于特異性單克隆抗體制備困難，待檢樣本及處理方法沒有形成標(biāo)準(zhǔn)化，以及大多數(shù)研究只關(guān)注方法學(xué)質(zhì)量，導(dǎo)致MTB抗原檢測(cè)在臨床上的應(yīng)用較少，因此MTB抗原檢測(cè)仍然存在較大的研究空間。TBM是最嚴(yán)重的肺外結(jié)核病，常呈急性或亞急性起病，病程慢，常缺乏結(jié)核接觸史，其臨床表現(xiàn)缺乏特異性，且病情變化迅速，需要進(jìn)一步研究確定對(duì)TBM患者進(jìn)行特異性抗原檢測(cè)的價(jià)值。未來的研究也需要評(píng)價(jià)在HIV感染并涂片陰性的TB患者中抗原檢測(cè)的性能。同時(shí)也要探討待檢MTB抗原的濃度與痰液中MTB密度之間的關(guān)系，以了解患者治療前后的疾病狀態(tài)，從而有助于監(jiān)測(cè)治療是否成功及早期識(shí)別治療是否復(fù)發(fā)。

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