抗凍蛋白的制備及其在食品工業(yè)的應(yīng)用研究進(jìn)展

王靜靜，廖愛美，劉瑩瑩，陳新陽，薛迎春，潘龍，黃繼紅，3，4*，侯銀臣

（1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院小麥生物加工與營養(yǎng)功能河南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001；2.中原食品實(shí)驗(yàn)室，河南 漯河 462000；3.河南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 作物逆境適應(yīng)與改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開封 475004；4.許昌學(xué)院 食品與藥學(xué)院，河南 許昌 461000）

由于食品在儲存過程中含水量高，利于微生物生長和發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，容易導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)[1]，而冷凍保存技術(shù)是將食品長期保存的最有效方法。受溫度波動的影響，食品中的冰晶生長或再結(jié)晶，會破壞細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)，使食品失去原有品質(zhì)[2]，并造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。因此，在食品冷凍儲存過程中，找到控制冰晶生長和再結(jié)晶的方法對提高冷凍食品的品質(zhì)至關(guān)重要[3]。在冷凍食品中添加冷凍保護(hù)劑是緩解冷凍貯藏過程中發(fā)生品質(zhì)惡化的最有效方法之一[4]?？箖龅鞍祝╝ntifreeze proteins，AFPs）最初是在南極海洋魚類血清中發(fā)現(xiàn)的，是一種可以防止魚類在冰冷的海水中結(jié)冰的蛋白質(zhì)[5]。與其他蛋白質(zhì)不同，AFPs 對冰有獨(dú)特的作用，它可以通過吸附到冰層表面保留水合分子，保留后的水合分子與冰晶有不同的生長方向和氫鍵結(jié)構(gòu)，AFPs 可以吸附到冰晶表面來抑制冰晶的形成和冰晶的生長[6-7]。此外，它可以通過降低體液的凍結(jié)溫度來保障各種冷適應(yīng)生物的存活，也可以通過抑制凍融過程中產(chǎn)生冰晶從而保護(hù)細(xì)胞不受傷害[8]。因此，AFPs 可以作為一種新型、無毒害的低溫保護(hù)劑應(yīng)用于冷凍食品中。AFPs 可以從生物體中提取，也可以通過人工制備。然而，提取或制備得到的AFPs 粗液包含多種蛋白質(zhì)，因此，需要進(jìn)一步的分離純化從而獲得高濃度的AFPs溶液。本文總結(jié)了近年來國內(nèi)外AFPs 的來源、特性、制備與純化的最新研究，重點(diǎn)論述了AFPs 在冷凍食品中的應(yīng)用進(jìn)展，并展望了AFPs 的制備與應(yīng)用前景，以期為抗凍蛋白的制備、純化和應(yīng)用提供參考。

1 AFPs 的來源

AFPs 主要存在于海洋深處、常年積雪和沙漠地區(qū)的細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲、脊椎動物體內(nèi)，是一種能夠抑制冰晶再結(jié)晶的結(jié)構(gòu)多樣化的大分子蛋白質(zhì)，它可以幫助許多生物體（如魚、昆蟲、植物和細(xì)菌等），能夠在0 ℃以下的溫度中生存[9]。AFPs 有熱滯活性（thermal hysteresis activity，THA）、冰重結(jié)晶抑制（ice recrystalization inhibition，IRI）和修飾冰晶形態(tài)等特性，自然界中不同生物來源的AFPs 的特征有差異[10]。例如，在IRI方面，AFPs 可以通過降低體液中的冰點(diǎn)來阻止魚類和昆蟲冰晶的形成；在修飾冰晶形態(tài)方面，植物和線蟲的抗凍性是通過將磷酸腺苷結(jié)合在冰的表面并防止其變成更大的冰晶來實(shí)現(xiàn)的；不同微生物的AFPs 可以附著在冰面上，并抑制冰晶的形成。AFPs 可以抑制冰晶的生長，這對于生活在冰冷海水中的極地魚類有重要意義[11]。Takeshita 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，冬牙鲆AFPs 溶液經(jīng)過預(yù)熱和超濾后提高了蛋白的純度，增強(qiáng)了對冰晶生長的重結(jié)晶抑制作用。昆蟲中AFPs 的抗凍活性顯著高于魚類；植物中的AFPs 具有顯著抑制冰晶形態(tài)的作用。有研究表明，將AFPs 轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)能夠減緩植物凍害[13]，但關(guān)于植物中AFPs 的研究起步較晚，文獻(xiàn)相對較少。表1 概括了不同生物來源的AFPs，以及它們的代表物種和同源蛋白質(zhì)。

表1 不同生物來源的AFPsTable 1 Different biological sources of antifreeze proteins

2 AFPs 的特性

AFPs 與冰晶結(jié)合，能夠通過非依數(shù)的形式降低溶液的冰點(diǎn)，并保持其熔點(diǎn)不發(fā)生變化；同時，表現(xiàn)出IRI 活性，可以阻止微小冰晶在冷凍、低溫保存過程中生長為大晶體，并具有改變冰晶形態(tài)的能力[18]。

2.1 THA

AFPs 能夠非依數(shù)性地降低溶液的冰點(diǎn)而保持其熔點(diǎn)不變，這樣冰點(diǎn)與熔點(diǎn)間產(chǎn)生的差值就稱為THA，其根據(jù)AFPs 和晶體表面之間的相互作用而變化[19]。根據(jù)THA，AFPs 可分為中度活性抗凍蛋白和過度活性抗凍蛋白。在魚類和植物中發(fā)現(xiàn)了中度活性的AFPs，在高濃度蛋白質(zhì)下，其THA 值約為2 ℃，而在高濃度蛋白下，來自細(xì)菌和昆蟲的THA 值高達(dá)5 ℃[20]。在含有AFPs 的溶液中，冰晶不可逆地結(jié)合到AFPs上，阻止冰晶生長，直到溫度降低到非平衡冰點(diǎn)，從而形成溫度差，使冰晶破裂[21]，這種特殊的性質(zhì)在食品工業(yè)及低溫保存技術(shù)方面存在巨大的應(yīng)用潛力。

2.2 IRI

AFPs 可以防止水在冰晶和溶液之間的再分配，即IRI。根據(jù)這一特性，AFPs 在食品工業(yè)中具有潛在的應(yīng)用價值，例如在制冷系統(tǒng)的冰漿和食品儲存中的應(yīng)用。植物的IRI 活性高于魚類和昆蟲。對于一些耐寒生物體，當(dāng)空氣溫度降至冰點(diǎn)以下時，它們的細(xì)胞外會形成許多冰晶，AFPs 可以減緩胞內(nèi)致命冰的形成[22]。冰的重結(jié)晶過程分為冰晶邊界遷移、大冰晶增大、小冰晶消失。AFPs 可以增加冰晶的數(shù)量，減小冰晶的尺寸。一般來說，AFP 的IRI 率越大，形成的冰晶就越小[23]。AFPs 通過阻止冰晶在邊界處生長和融化來抑制冰晶邊界遷移的過程。即使是在亞微摩爾的濃度中，IRI 也很顯著，這遠(yuǎn)低于THA 所需的濃度。冰晶在冷凍溶液中較小，降低了細(xì)胞的損傷，防止冷凍食品在儲存過程中營養(yǎng)的流失，因此對于冷凍食品和其他冷凍水合材料的保存有至關(guān)重要的作用[24]。Shi 等[25]采用3 種浸漬方法，研究了AFPs 對凍融循環(huán)下扇貝內(nèi)收肌持水能力和質(zhì)地特性的影響。結(jié)果表明，在超聲輔助浸漬中AFPs 通過氫鍵吸附在冰晶表面，可以顯著改變冰晶的形態(tài)，顯著提高扇貝收肌的持水能力和質(zhì)地特性，為研究超聲輔助浸漬及其在冷凍水產(chǎn)品中的作用機(jī)制提供一定的參考。

2.3 修飾冰晶形態(tài)的能力

AFPs 可以結(jié)合到特定冰晶的基面上，從而形成獨(dú)特的冰晶形態(tài)。例如，冬比目魚和黃顙魚中的I 型AFPs分別結(jié)合在冰錐和副棱柱基面上，來自南極的黃桿菌中超活性AFPs 結(jié)合在基面上，形成檸檬的形狀，而超活性AFPs 可以同時結(jié)合在冰晶的基面和棱柱上[26]。

3 AFPs 的制備

AFPs 可以從天然來源（植物、昆蟲、動物和魚類）中提取，也可以通過常見的基因重組技術(shù)制備。對化學(xué)法、分子生物學(xué)表達(dá)、基因工程表達(dá)的制備方法進(jìn)行總結(jié)。

3.1 化學(xué)法

化學(xué)法一般采用的是堿溶酸沉法，依據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同，通過調(diào)節(jié)溶液的pH 值，使得目的蛋白質(zhì)沉淀。陳振家[27]采用堿溶酸沉的方法從大豆中制備分離蛋白，通過改性后制成凝膠，在凍藏條件下對蛋白的抗凍特性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，隨凍藏時間的延長，凝膠特性下降，蛋白降解。丁香麗[28]則以Na2HPO4-NaH2PO4溶液為緩沖液，采用真空滲透法提取大麥籽粒中AFPs，經(jīng)過超濾、一系列柱層析純化，得到的大麥籽粒AFPs 相對分子質(zhì)量為13 370 Da，THA為1.04 ℃，與禾本科小麥族12 個屬中的蛋白具有較高同源性。

3.2 分子生物學(xué)表達(dá)

分子生物學(xué)表達(dá)技術(shù)是指以模式生物（細(xì)菌、真菌、動物細(xì)胞或者植物細(xì)胞）為宿主，對外源基因進(jìn)行表達(dá)的一種方法。張莉等[29]通過構(gòu)建重組乳酸乳球菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)抗凍肽，比較冷凍脅迫前后乳酸乳球菌的生長曲線、發(fā)酵活力和細(xì)胞內(nèi)鈉、鉀離子含量的變化，研究重組菌在冷凍脅迫作用下的生理功能特性。結(jié)果表明，抗凍肽具有顯著的抗冷凍脅迫保護(hù)作用。Zhao 等[30]將4 種云杉品種的基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌宿主中表達(dá)，經(jīng)過誘導(dǎo)、提取、純化后的可溶性基因蛋白進(jìn)行差示掃描量熱儀測試，其特征THA 分別為0.77 ℃（PicW1）、0.78 ℃（PicW2）、0.72 ℃（PicM）和0.86 ℃（PicK），顯著高于對照組（牛血清蛋白）的0.05 ℃。

3.3 基因工程表達(dá)

基因工程表達(dá)蛋白，是先設(shè)計(jì)目的基因并在體外構(gòu)建DNA 分子，然后將基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)來表達(dá)蛋白質(zhì)，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品的遺傳技術(shù)。董小云[31]從白菜型冬油菜中分離鑒定出白菜型冬油菜抗凍蛋白（BrAFP1），其分子量為38.130 kDa。讓冬油菜幼苗在低溫脅迫下生長，結(jié)果顯示BrAFP1 基因表達(dá)上調(diào)，表明該基因在白菜型冬油菜低溫響應(yīng)中起著重要作用。Yu 等[32]從沙冬青中克隆出AnAFP 基因，通過實(shí)時熒光定量，發(fā)現(xiàn)高溫對AnAFP、AnICE1 和AnCBF 基因的表達(dá)有顯著的誘導(dǎo)作用，表明AnAFP 可能受冷脅迫信號調(diào)節(jié)通路調(diào)控。表2 歸納了3 種方法制備AFPs 的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)。

表2 AFPs 的制備方法比較Table 2 Comparison on the preparation methods of antifreeze proteins

4 AFPs 的分離純化

通過化學(xué)法、分子生物學(xué)表達(dá)、基因工程表達(dá)制備得到的AFPs 粗液是一種復(fù)雜的蛋白質(zhì)體系，包含多種蛋白質(zhì)，因此，需要進(jìn)一步的分離純化從而獲得高濃度的AFPs 溶液。冰親和層析、色譜層析、Ni 柱親和層析為常見的純化方法。

4.1 冰親和層析

冰親和層析是純化AFPs 的傳統(tǒng)方法。純化的原理是如果冰晶生長得足夠慢，過冷就會被最小化，雜質(zhì)很難進(jìn)入晶體，可以通過混合溶液來排除冰中的溶質(zhì)。冰親和層析有兩種方法可以實(shí)現(xiàn)，第一種方法是冰親和純化技術(shù)，即用黃銅冷指浸入蛋白質(zhì)溶液中，純化后的蛋白質(zhì)在黃銅冷指上緩慢生長，不斷攪拌溶液防止雜蛋白結(jié)冰；第二種方法是冰殼純化，即圓底燒瓶浸泡在冷水浴里，低溫使燒瓶表面形成薄冰，抗凍蛋白通過吸附到冰的表面以達(dá)到純化的效果[33]。這兩種方法都是在容器中混合AFPs 溶液，同時通過程序，利用水浴降低溫度，通過融化冰提取純化的蛋白質(zhì)。Tomalty 等[34]從實(shí)驗(yàn)室冷馴化后的黃粉蟲幼蟲勻漿中制備出AFPs，經(jīng)過5 次旋轉(zhuǎn)冰親和純化蛋白，測得其熱值活性最高為3.5 ℃，幼蟲勻漿的上清部分具有大量不同的蛋白質(zhì)，最高相對分子質(zhì)量可達(dá)175 kDa。與傳統(tǒng)的分離純化AFPs 方法相比，冰親和層析法更適用于AFPs 較大規(guī)模的粗分離純化，而且電泳條帶切割法適用于高精度和高純度樣品地分離[35]。

馬慶保[36]以特異性親和吸附法制備南極磷蝦AFPs，優(yōu)化的提取南極磷蝦AFPs 最佳條件為樣品濃度1.0 mg/mL、吸附溫度-1.70 ℃、吸附時間11 h、吸附次數(shù)為2，在此條件下，南極磷蝦AFPs 的預(yù)測得率為30.12%，THA 為0.079 ℃。

4.2 色譜層析

色譜層析作為一種物理化學(xué)分離純化方法，是從混合物中分離組分的最重要的方法之一。凝膠過濾層析是根據(jù)流體分子的體積或分子量不同來達(dá)到對蛋白質(zhì)分離的目的，離子交換色譜層析的固定相為陰離子或者陽離子交換劑，流動相為粗蛋白溶液，根據(jù)組分離子與交換劑上的平衡離子的結(jié)合力大小而進(jìn)行分離的一種色譜層析方法。目前，分離純化AFPs 最常用的方法是凝膠過濾色譜法和離子交換色譜層析法。通常，AFPs 的分離純化需要這些色譜方法的組合應(yīng)用。

Ding 等[37]從冷馴化的大麥中提取AFPs，通過超濾濃縮樣品至五分之一，硫酸銨梯度沉淀，然后再通過高配基密度-羥色藻糖快速流動層析和凝膠過濾色譜層析兩種色譜層析的方法純化大麥籽粒AFPs，然后采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜進(jìn)行蛋白鑒定。結(jié)果表明，滲透離心提取的蛋白比傳統(tǒng)方法更有針對性。Wu等[38]用細(xì)胞外蛋白酶對三文魚皮中的膠原蛋白進(jìn)行水解，通過超濾和尺寸排阻層析后，得出其水解產(chǎn)物具有良好的抗凍性（>3 kDa）和抗氧化活性（< 3 kDa）。

4.3 Ni 柱親和層析

Ni 柱親和層析依據(jù)金屬Ni 通過與電子供體配基上能與Ni2+相互作用的羧基或氨基的電負(fù)性元素（O，N）形成較穩(wěn)定的金屬螯合物，使得AFPs 可以選擇性地結(jié)合在填料上，而其他的雜質(zhì)蛋白則不能結(jié)合或僅能微弱結(jié)合。用不同濃度的咪唑緩沖液將結(jié)合在介質(zhì)上的His 標(biāo)簽蛋白洗脫下來，由于純化的重組蛋白粗提取液中含有His-Tag 標(biāo)簽，Ni2+與His-Tag 標(biāo)簽結(jié)合，通過Ni 柱親和層析純化出需要的蛋白質(zhì)，可以得到較高純度的His 標(biāo)簽蛋白。Mao 等[39]在大腸桿菌中異源表達(dá)GmAFPIV 蛋白，將蛋白上清粗提取液負(fù)載在Ni-NTA 柱上，用不同濃度咪唑緩沖液把目的蛋白洗脫下來，經(jīng)過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，其分子量約為30 kDa，通過蛋白質(zhì)免疫印跡驗(yàn)證其活性。金泉等[40]通過在大腸桿菌中表達(dá)絲膠抗凍肽并用鎳瓊脂糖親和層析對其蛋白粗提取液進(jìn)行純化，測得其蛋白分子量為25～35 kDa，并證明了提取到的融合蛋白具有抗冷凍脅迫保護(hù)作用。表3 總結(jié)了3 種AFPs 分離純化方法的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)。

表3 AFPs 的分離純化方法對比Table 3 Comparison on the separation and purification methods of antifreeze proteins

5 AFPs 在食品中的應(yīng)用

近年來，隨著對AFPs 性質(zhì)和機(jī)理的深入研究，其應(yīng)用領(lǐng)域也越來越廣泛。在食品工業(yè)中，AFPs 被認(rèn)為是天然的冰晶生長抑制劑，即使在較低的濃度下，它依然能夠在食品的冷凍、儲存、運(yùn)輸和解凍過程中抑制冰晶再結(jié)晶和降低化合物的冰點(diǎn)，從而通過減少細(xì)胞損傷來保留食物原有風(fēng)味，減少營養(yǎng)物質(zhì)的損失，延長產(chǎn)品的貨架壽命。

5.1 AFPs 在冷凍肉制品中的應(yīng)用

AFPs 通過不可逆地附著在冰晶表面，抑制冰晶的生長，進(jìn)而改變冰晶的形態(tài)，抑制再結(jié)晶，提高冷凍食品的生物抗凍能力。Zeng 等[41]采用響應(yīng)面法對羅非魚加工副產(chǎn)物進(jìn)行酶解，制備了抗凍肽，通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水組相比，抗凍肽保護(hù)下的細(xì)胞表面更規(guī)則、光滑、完整，表明其可作為一種新型菌體的冷凍保護(hù)劑，用于益生菌的保存。Chen 等[42]將不同濃度的AFPs 添加到冷凍雞肉中，觀察雞肉的持水能力、水分分布、顏色、蛋白質(zhì)特性、微觀結(jié)構(gòu)和組織學(xué)的變化，結(jié)果表明，AFPs 可以顯著提高冷凍雞肉的品質(zhì)，減少冷凍期間雞肉的營養(yǎng)損失，是一種潛在的、安全的、高效的冷凍保護(hù)劑。Li 等[43]研究發(fā)現(xiàn)，添加0.2%AFPs 的速凍豬肉餅經(jīng)過5 次凍融循環(huán)后，肉餅硬度和彈性均高于對照組。

5.2 AFPs 在冷凍面團(tuán)中的應(yīng)用

AFPs 可以改變冰晶的大小和形狀，從而抑制冰晶的再結(jié)晶，這對提高冷凍食品的品質(zhì)和延長保質(zhì)期有重要作用。目前，AFPs 已被應(yīng)用于許多冷凍食品的加工中。例如，向預(yù)烤冷凍面包中添加小麥AFPs 和海藻糖，發(fā)現(xiàn)AFPs 能夠改善復(fù)烤面包的品質(zhì)，與未添加相比，0.6% AFPs 與0.6%海藻糖能夠緩解凍融對復(fù)烤面包的影響[44]。Zhang 等[45]研究了添加或不添加AFPs 的情況下對冷凍面團(tuán)的影響。結(jié)構(gòu)特性結(jié)果顯示，添加燕麥AFPs 可以降低冷凍面團(tuán)中的可凍水含量。流變學(xué)特性結(jié)果表明，與未添加燕麥AFPs 組相比，添加燕麥AFPs 組的發(fā)酵能力更強(qiáng)；掃描電鏡結(jié)果表明，燕麥AFPs 的加入可以保護(hù)面筋基質(zhì)免受溫度波動和冷凍造成的破壞，從而使饅頭質(zhì)地特性更好。AFPs 的添加可以改善饅頭的質(zhì)地，但隨著存放時間的延長，這種改善作用逐漸減弱。

5.3 AFPs 在冰淇淋中的應(yīng)用

在冰淇淋產(chǎn)品中，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度是評價冰淇淋在儲存過程中熱力學(xué)穩(wěn)定性的一個指標(biāo)。AFPs 可以提高冰淇淋的重結(jié)晶、耐融性和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度[46]。為了開發(fā)一款質(zhì)地細(xì)膩、抑制重結(jié)晶能力強(qiáng)的冰淇淋，Kaleda 等[47]將冬黑麥AFPs 添加到冰淇淋中，研究AFPs對冰淇淋結(jié)構(gòu)和質(zhì)地的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)AFPs 存在時，冰淇淋中的冰晶明顯變小，再結(jié)晶受到抑制，冰淇淋質(zhì)地更順滑，提高冰淇淋對溫度波動的耐受性。Zhang 等[48]從燕麥中提取燕麥抗凍蛋白（Avena sativa L.AFPs，AsAFP），在濃度15.0 mg/mL時，其THA 為1.24 ℃，經(jīng)過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS） 和串聯(lián)質(zhì)譜（tandem massspectrometry，MS/MS）質(zhì)譜分析結(jié)果表明，AsAFP與幾丁質(zhì)內(nèi)質(zhì)酶同源。隨后，將0.1%的AsAFP 添加到冰淇淋中，使得玻璃化轉(zhuǎn)變溫度從-29.14 ℃增加到-27.74 ℃，有效提高了冰淇淋的抑制重結(jié)晶和耐融化性。

5.4 AFPs 在低溫果蔬中的應(yīng)用

無論是植物細(xì)胞還是動物細(xì)胞，在冷凍時的細(xì)胞損傷都是由再結(jié)晶時晶體尺寸的增加導(dǎo)致。此外，AFPs 通過抑制冰晶的生長來防止再結(jié)晶，進(jìn)而阻礙冰的融化[49]。在低溫保存過程中，融化或解凍是導(dǎo)致細(xì)胞損傷的主要過程。Kashyap 等[16]用沙棘抗凍蛋白（hippophae rhamnoides chitinase class IV，HrCHI4）預(yù)處理青豆，然后將其冷凍保存，并對HrCHI4 作為冷凍保護(hù)劑的作用進(jìn)行了分析。通過掃描電鏡、氣相色譜-質(zhì)譜等檢測青豆的結(jié)構(gòu)和組成成分，結(jié)果表明，用HrCHI4 預(yù)處理后能夠降低冷凍青豆的滴水損失和電解質(zhì)泄漏，保持了青豆細(xì)胞膜的完整性，保護(hù)外層細(xì)胞并促進(jìn)凍融后揮發(fā)成分的保留。此研究通過自然方法來保持低溫蔬菜的質(zhì)地和新鮮度，開辟了AFPs 在果蔬產(chǎn)品保存中的應(yīng)用途徑。Kashyap 等[50]對豌豆冷凍前進(jìn)行預(yù)處理，測定了冷凍豌豆解凍后的滴水損失，采用高效液相色譜法檢測豌豆在冷凍前后維生素的流失情況。結(jié)果表明，使用大麥AFPs 處理后的豌豆水分和維生素（硫胺素、吡哆醇、核黃素和抗壞血酸含量）損失減少。

6 展望

目前，由于AFPs 制備成本高昂，因此在食品領(lǐng)域還未得到廣泛的應(yīng)用。

6.1 制備前景展望

除了通過化學(xué)法、分子生物學(xué)表達(dá)、基因工程表達(dá)方法制備AFPs，還可以用體外無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)（cell-free translation system，CFPS）來制備AFPs。CFPS是以外源DNA 或者mRNA 為模板，在無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系內(nèi)補(bǔ)充底物和能源物質(zhì)[腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）等]，利用細(xì)胞抽提物提供的細(xì)胞器在T7/SP6 RNA聚合酶的組合下體外表達(dá)目的蛋白質(zhì)的系統(tǒng)。

在CFPS 中，細(xì)胞膜的缺失有助于蛋白質(zhì)折疊，進(jìn)而更好地合成AFPs 以達(dá)到高通量生產(chǎn)，并且CFPS 制備出的雜蛋白少，利于純化蛋白，從而避免了純化過程中靶蛋白的減少，可以獲得更高的蛋白產(chǎn)量[51]。由于不含有活細(xì)胞，因此，CFPS 自然地克服了維持細(xì)胞活性的通用限制，在人工和預(yù)定義的環(huán)境中工程化和控制基本和必要的細(xì)胞過程方面具有巨大潛力[52]。

6.2 應(yīng)用前景展望

生物體的抗寒能力是生物體適應(yīng)惡劣自然環(huán)境的一種能力，AFPs 的出現(xiàn)揭示了這種自我保護(hù)能力的本質(zhì)。隨著AFPs 的研究逐年增多，不僅發(fā)現(xiàn)了越來越多的耐寒生物體中含有AFPs，而且AFPs 的防凍作用機(jī)制也越來越清晰。低溫醫(yī)學(xué)是開發(fā)安全、高效、適用于重大疾病治療的醫(yī)用防凍劑的新興領(lǐng)域。血液、胚胎、器官，甚至身體等各種相關(guān)生物材料都需要冷凍保存，保存后的生物材料可用來幫助患者治療和恢復(fù)身體健康。雖然昆蟲AFPs 的抗凍活性高于其他種類的活性，但是無法從昆蟲中大量提取AFPs。因此，大多數(shù)應(yīng)用的AFPs 都來自魚類AFPs，其中III 型AFPs 更容易通過基因重組產(chǎn)生，最常用于低溫保存。

7 小結(jié)

從AFPs 的特性和應(yīng)用來看，它不僅與人們的生活息息相關(guān)，而且也滲透到各個領(lǐng)域。本文介紹了AFPs 的來源，諸多研究表明，自然界中不同生物來源AFPs 的特征有差異；總結(jié)了AFPs 的特性，其具有降低溶液的冰點(diǎn)，保持溶液熔點(diǎn)不發(fā)生變化，阻止微小冰晶在冷凍、低溫保存過程中生長為大晶體的特性，并具有改變冰晶形態(tài)的能力；此外詳細(xì)描述了目前常用的AFPs 制備與純化方法，并對這些方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行分析；最后介紹了AFPs 在食品中的應(yīng)用現(xiàn)狀并展望其制備和應(yīng)用前景。盡管AFPs 作為未來生物技術(shù)的重要性在不同領(lǐng)域得到了認(rèn)可，但對其在低溫下的作用和調(diào)節(jié)抗凍活性機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。