液液萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法分析不同陳釀時間朗姆酒香氣成分

高俊杰，李志星，姚彬彬，趙先炎，胡文效*，邱磊*

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院） 生物工程學(xué)院，山東 濟南 250353；2.山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，山東 濟南 250014）

朗姆酒與中國白酒、白蘭地、威士忌、伏特加和金酒齊名，是“世界六大蒸餾酒”之一[1-4]。朗姆酒最早起源于加勒比海地區(qū)的西印度群島，即現(xiàn)在的古巴地區(qū)[5]，后傳入歐洲，迄今已有200 年左右的生產(chǎn)歷史[6]。朗姆酒是以甘蔗汁或甘蔗附屬物如糖蜜等為原料，經(jīng)酒精發(fā)酵、蒸餾、橡木桶陳釀等一系列工序后釀制而成，它因口感甜爽、芳香馥郁、果味突出，現(xiàn)已成為廣大消費者喜愛的一種世界名酒[7]，在世界暢銷的酒精飲料中銷量僅次于白蘭地和威士忌，排名第三[8]。我國朗姆酒市場十分廣闊，近年來對朗姆酒的進口量逐年增加，躍居我國進口酒精飲品量之首[9]。

朗姆酒的香氣主要取決于原料、發(fā)酵和陳釀這3 個方面[10]。由于原料類型、發(fā)酵條件和所用菌種以及陳釀時間的不同，朗姆酒中酯類、醇類、酸類、醛類、酮類、酚類等主要呈香物質(zhì)的種類、含量及比例存在差異，進而造就了不同朗姆酒的香氣特點，同時也決定了朗姆酒品質(zhì)的高低。然而目前國際上對朗姆酒關(guān)鍵香氣化合物的組成仍沒有清晰定論，對朗姆酒的檢測標準也僅局限于原料和主要成分規(guī)定上，對香氣成分的檢測標準也未做出明確規(guī)定，因此，根據(jù)其他酒類（如白蘭地、白酒）香氣成分的檢測方法對朗姆酒中的香氣組分進行定性和定量分析具有十分重要的研究價值和現(xiàn)實意義[7]。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)屬于質(zhì)譜分析學(xué)的一部分，因其可準確對產(chǎn)品中各種化合物進行定性和定量分析被廣泛應(yīng)用于食品指標檢測、生物醫(yī)藥及化工涂料研發(fā)等領(lǐng)域[11]。酒類中酒精和水占絕大部分比重，香氣成分所占比重甚微，而恰恰是這些微量的香味物質(zhì)對酒體的風(fēng)格和口感起著至關(guān)重要的作用[12-13]。為了便于利用GC-MS 對各種香氣成分進行準確定性和定量，需要對酒樣進行必要的前處理，從而將這些微量香味物質(zhì)分離出來。常見的前處理方法包括液液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）法[14-15]和頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）法[16-17]。為盡可能地將酒類中的不同揮發(fā)性和極性的香氣物質(zhì)提取完全，本研究以二氯甲烷為萃取劑，利用液液萃取法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對哈瓦那俱樂部3 年、哈瓦那俱樂部7 年和哈瓦那俱樂部樽融3 種不同陳釀時間朗姆酒中的香氣成分進行定性和定量分析[18]，探究3 種朗姆酒的香氣組成，以期為我國高質(zhì)量朗姆酒評價系統(tǒng)的建立和完善提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3 款朗姆酒[哈瓦那俱樂部3 年、哈瓦那俱樂部7年和哈瓦那俱樂部樽融（陳釀時間在25 年以上）]：保樂力加（中國）酒業(yè)有限公司；氯化鈉、無水硫酸鈉（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；2-辛醇標準品：上海麥克林生化科技有限公司；二氯甲烷（色譜純）：美國天地試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XS104 型電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；液液萃取裝置（500 mL 梨形分液漏斗及漏斗架）：山東力戈生物科技有限公司；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國海道夫公司；DC-12 氮吹儀：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；7890B/7000D 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-5 非極性毛細管柱色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國Agilent 公司。

1.3 方法

1.3.1 朗姆酒酒樣的前處理

取25 mL 朗姆酒于錐形瓶中，加入75 mL 去離子水將其稀釋至酒精度為10% vol 左右[19]，加入2 g 氯化鈉。將處理完的朗姆酒酒樣轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，并用二氯甲烷先后萃取3 次（60、40、20 mL），靜置后將下層有機相倒入錐形瓶中合并，加入干燥后的無水硫酸鈉15 g，靜置過夜。最后將有機相常壓45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、氮吹濃縮至1 mL，轉(zhuǎn)移至1.5 mL 進樣瓶中，加入20 μL 質(zhì)量濃度為1 g/L 的2-辛醇標準品（內(nèi)標），密封好并置于4 ℃冰箱中保存，進樣時采用直接進樣方式進樣1 μL。

1.3.2 GC-MS 分析條件

GC 條件：DB-5 非極性毛細管色譜柱（30m×0.25mm×0.25 μm）；升溫程序為50 ℃保持2 min，以4 ℃/min升溫至170 ℃保持5 min，以8 ℃/min 升溫至280 ℃保持10 min；載氣（He）（99.99%）流速1.0 mL/min，壓力53.5 kPa，采用分流比6：1 方式進樣，進樣體積1 μL。

MS 條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；檢測器電壓830 eV；傳輸管線溫度280 ℃；進樣口和接口溫度為250 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；全掃描模式（Scan）；質(zhì)量掃描范圍35～350 amu；掃描速度：769 amu/s；溶劑延遲4 min。

1.3.3 定性和定量方法

定性方法：根據(jù)NIST14 譜庫對GC-MS 掃描分析得到的各香氣化合物組分進行計算機檢索，利用匹配度＞80%特征離子和保留時間進行定性分析。

定量方法[20]：采用半定量方法對各組分進行定量分析，按下列公式計算。

Xi=Ai/As×Cs

式中：Xi為待測物的質(zhì)量濃度，g/L；Cs為內(nèi)標物（2-辛醇）質(zhì)量濃度，g/L；Ai為待測物的峰面積；As表示內(nèi)標物的峰面積。

1.3.4 香氣活力值的計算方法

香氣活力值（odor activity value，OAV）可從閾值和濃度兩個維度上評價某香氣化合物對整體風(fēng)味的貢獻度，進而表征酒中的關(guān)鍵香氣化合物。各化合物的OAV（W）可按下列公式計算[21]。

W=ρ/T

式中：W 為各化合物的OAV；ρ 為香氣化合物在酒中的質(zhì)量濃度，g/L；T 為香氣化合物的香氣閾值（以10%乙醇水溶液計），μg/L。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計及繪圖均在Excel 2007 軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種朗姆酒的香氣成分測定結(jié)果

采用LLE-GC-MS 法對3 種哈瓦那俱樂部朗姆酒中的香氣成分進行測定，其GC-MS 分析的總離子流色譜圖見圖1，3 種朗姆酒中香氣成分的測定結(jié)果見表1。

表1 3 種朗姆酒中香氣成分的GC-MS 測定結(jié)果Table 1 Determination of aroma components in three types of rum by GC-MS

圖1 3 種朗姆酒中香氣成分GC-MS 分析的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow chromatograms of aroma components in three types of rum by GC-MS

由圖1 和表1 可知，3 種朗姆酒中香氣化合物的分離效果較好且種類和含量存在明顯差異，從中共檢測出139 種香氣成分，包括47 種酯類、23 種醇類、15 種酸類、13 種醛類、16 種酮類、8 種酚類、17 種其他類，這與楊華峰等[22]對銀朗姆酒不同蒸餾階段香氣物質(zhì)的研究結(jié)果極為相似。檢出的香氣成分大多為中鏈香氣化合物，占檢出香氣成分總數(shù)的82.01%。此外，檢出的酯類中包括3 種內(nèi)酯類，內(nèi)酯類是朗姆酒陳釀過程中長時間與橡木桶作用產(chǎn)生的，其含量會隨著陳釀時間的延長而有所增加，這里將內(nèi)酯類單獨作為一類香氣成分進行討論。

哈瓦那俱樂部3 年中共測得58 種香氣化合物，包括酯類20 種（50.71%）、內(nèi)酯類3 種（1.27%）、醇類9種（15.12%）、醛類6 種（10.10%）、酸類7 種（15.13%）、酮類3 種（0.85%）、酚類3 種（1.02%）和其他類7 種（5.81%）；哈瓦那俱樂部7 年中共測得65 種香氣化合物，包括酯類24 種（31.54%）、內(nèi)酯類2 種（1.74%）、醇類14 種（34.38%）、醛類6 種（15.70%）、酸類5 種（8.94%）、酮類5 種（5.04%）、酚類2 種（0.43%）和其他類6 種（5.62%）；哈瓦那俱樂部樽融中共測得102 種香氣化合物，包括酯類33 種（30.23%）、內(nèi)酯類2 種（1.91%）、醇類14 種（17.57%）、醛類11 種（31.85%）、酸類11 種（9.65%）、酮類12 種（2.74%）、酚類6 種（0.43%）和其他類12 種（5.62%）。3 種朗姆酒中檢出的香氣成分總量隨著陳釀時間的延長而增大，哈瓦那俱樂部3 年、哈瓦那俱樂部7 年和哈瓦那俱樂部樽融中檢出的香氣成分總量分別為30.67、36.85 g/L 和73.81 g/L，哈瓦那俱樂部樽融中各類香氣化合物的含量均高于其他2 種朗姆酒，這與陳釀過程中氧化還原作用和酯化反應(yīng)產(chǎn)生的芳香物質(zhì)的積累有關(guān)[23]。另外，陳釀時間較長的朗姆酒香氣成分中內(nèi)酯類和醛類的含量及其占比較大，這些成分多來自橡木。

2.2 3 種朗姆酒中的共有香氣組分

為進一步探究朗姆酒普遍的香氣特征，對3 種朗姆酒中的共有香氣成分進行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表2。

表2 3 種朗姆酒中的共有香氣成分Table 2 Common aroma components in three types of rum

由表2 可知，3 種朗姆酒共檢測出25 種共有香氣成分，包括12 種酯類、1 種內(nèi)酯類、3 種醇類、1 種酸類、3 種醛類、1 種酮類、1 種酚類和3 種其他類。這些共有香氣成分的含量分別占3 種朗姆酒各自香氣成分檢出總量的76.67%、72.50%、56.33%，對朗姆酒總體香氣成分影響較大，它們相互作用形成了朗姆酒果香、花香、甜香、木香、熏香的基礎(chǔ)香氣特征。

2.3 3 種朗姆酒中香氣組分的OAV 分析

為進一步確定3 種朗姆酒中的特征香氣組分，對3種朗姆酒中可查詢到閾值的香氣化合物進行OAV 計算，發(fā)現(xiàn)部分香氣化合物的閾值較小，OAV 較大，因此，OAV 的計算結(jié)果取以10 為底數(shù)的對數(shù)后用OAV* 表示，OAV 值計算結(jié)果、相應(yīng)的香氣特征及分類情況見表3。OAV＞1 即OAV*＞0 時，說明該香氣化合物對相應(yīng)朗姆酒的香氣類型有貢獻且值越大，貢獻就越大。

表3 3 種朗姆酒中香氣成分的OAVTable 3 OAV of aroma components in three types of rum

由表3 可知，從3 種朗姆酒中檢出且能查到閾值的香氣化合物共有18 種，其中可被檢出的化合物的OAV* 均大于0，說明這些化合物對朗姆酒的香氣有貢獻?，F(xiàn)將OAV＞10 000 即OAV*＞4 的化合物定為第一梯度貢獻最大的香氣化合物，其組分包括大馬士酮、辛酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯；第二梯度的貢獻較大的香氣化合物有香蘭素、2-苯乙醇、愈創(chuàng)木酚、水楊酸甲酯、α-松油醇，其中可被檢出的化合物的OAV*均介于3～4 之間；其他7 種香氣化合物的OAV* 均小于3，被劃分到貢獻較小的第三梯度，這與Pino 等[25]對陳年朗姆酒中氣味活性化合物的研究結(jié)果類似。結(jié)合表1 可知，3 種朗姆酒中酯類、醇類、醛類香氣化合物含量較高且占比較大，這在一定程度上說明了香氣化合物的含量大小決定了其對朗姆酒整體香氣的貢獻大小。此外，大馬士酮的含量與愈創(chuàng)木酚相近，而OAV 卻明顯大于愈創(chuàng)木酚。因此，僅依據(jù)某香氣化合物的含量來判斷其貢獻度大小是不準確的，還應(yīng)考慮到該香氣化合物的閾值大小。

2.4 感官評定

為進一步確定3 種朗姆酒中的風(fēng)味活性物質(zhì)，需將香氣化合物和感官特征聯(lián)系起來。3 種朗姆酒的感官評定結(jié)果見圖2。

圖2 3 種朗姆酒的香氣輪廓圖Fig.2 Aroma profiles of three types of rum

香氣化合物的香氣特征大致可歸類為10 種香氣類型：花香、果香、甜香、青香、奶香、熏香、木香、辛香、藥香和脂蠟香，這些香氣類型是人的感官對朗姆酒整體香氣特征的評定，是多種香氣成分之間相互作用（協(xié)同或掩蓋）形成的[26]。在這些香氣類型中，果香和花香是朗姆酒最突出的香氣特點，是朗姆酒香氣的主體部分，其次是甜香、青香和奶香，它們對朗姆酒的香氣也具有較大影響。此外，雖然脂蠟香、熏香、木香、辛香和藥香對朗姆酒的香氣影響較小，但是它們與其他幾種香氣類型相互協(xié)調(diào)共同構(gòu)成了朗姆酒的整體風(fēng)味，其中熏香、辛香和藥香隨著朗姆酒陳釀時間的延長有明顯增加的現(xiàn)象，這主要取決于陳釀過程中酚類和醛類物質(zhì)的積累，其中酚類物質(zhì)的存在也是朗姆酒抗氧化的主要原因。

3 討論與結(jié)論

本研究利用LLE-GC-MS 法對3 種朗姆酒（哈瓦那俱樂部3 年、哈瓦那俱樂部7 年和哈瓦那俱樂部樽融）的香氣成分進行了分離和分析。3 種朗姆酒共檢測出139 種香氣成分，包括酯類、醇類、酸類、醛類、內(nèi)酯類、酮類、酚類、其他類8 類，其中酯類化合物的種類最多，有44 種。酯類是由朗姆酒發(fā)酵過程中的醇類和酸類發(fā)生酯化反應(yīng)生成的，是酵母細胞在酒精發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一類重要的揮發(fā)性香氣化合物，大多具有花果香氣，在朗姆酒中含量較高而閾值較低，因而對朗姆酒的香氣貢獻作用較大。

3 種朗姆酒中的香氣成分主要是酯類、醇類、醛類、酸類4 類，另外還有少量的酮類、內(nèi)酯類、酚類、烷烴類、吡喃類、含氮化合物等。哈瓦那俱樂部樽融中檢測到的香氣化合物數(shù)目最多且總量最高。此外，陳釀時間越長的朗姆酒中，內(nèi)酯類和醛類含量占比越大且含量也越高。內(nèi)酯類是由相應(yīng)的羥基酸形成的，其中主要是威士忌內(nèi)酯，它來源于橡木木材，主要使朗姆酒呈橡木香，是衡量陳釀朗姆酒品質(zhì)的一個重要指標。醛類主要由相應(yīng)的醇氧化而來，往往使朗姆酒呈現(xiàn)微弱的刺激性氣味，其中主要是丁香醛，它主要來源于橡木桶的烘烤過程，可使朗姆酒呈現(xiàn)一定的刺鼻氣味和辛辣味，對朗姆酒整體香氣的細微差別和陳釀后朗姆酒酒體顏色的穩(wěn)定有著重要的影響。

3 種朗姆酒中共檢測出25 種共有香氣成分，這些共有香氣成分含量較高，占各自香氣成分檢出總量的55%以上，其中辛酸乙酯、癸酸乙酯、2-苯乙醇等香氣化合物的含量較高，被認為是朗姆酒中的基本香氣成分。由香氣成分的OAV 分析結(jié)果可知，對3 種朗姆酒香氣貢獻最大的香氣化合物是大馬士酮，它是朗姆酒中玫瑰花香的主要來源。此外，對朗姆酒香氣貢獻較大的香氣化合物還有辛酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、香蘭素、2-苯乙醇、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、愈創(chuàng)木酚。通過感官評定可知，果香和花香是3 種朗姆酒的主要香氣特征，其次是甜香、青香和奶香。隨著朗姆酒陳釀時間的延長，其熏香、辛香和藥香會明顯增加，這可能與陳釀過程中橡木中木質(zhì)素的降解有關(guān)。

本研究分離并分析了3 種哈瓦那俱樂部朗姆酒中的香氣成分，比較了3 種朗姆酒中香氣組成的異同，探究了朗姆酒隨著陳釀時間延長香氣組分及香氣特征變化的規(guī)律，初步明確了朗姆酒中的某些關(guān)鍵香氣化合物，這為高品質(zhì)朗姆酒的品鑒及其生產(chǎn)工藝的優(yōu)化提供了一定的理論依據(jù)。但同時可能存在未查明對朗姆酒貢獻較大香氣化合物的閾值的情況，這可能造成對3 種朗姆酒關(guān)鍵香氣成分的判定及其風(fēng)味輪廓的描述存在一定的偏差，有必要進一步對其他化合物的香氣閾值進行測定。