酶的固定化方法在微流控芯片技術(shù)中的應(yīng)用*

仵靜雯,陳 琳,劉春葉,張 劍

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,陜西 西安 710021)

微流控芯片是藥物研發(fā)中重要的高通量篩選平臺(tái)。實(shí)現(xiàn)酶在微流控芯片上的固定化,對(duì)提高藥物篩選可靠性尤為重要。隨著20世紀(jì)60年代酶固定化技術(shù)的興起,酶的固定化在酶分析中得到了廣泛地應(yīng)用。酶的固定化是指通過(guò)化學(xué)或物理方法處理,使酶與載體相結(jié)合,將自由酶限制在一定區(qū)域內(nèi),此時(shí)酶依然能進(jìn)行特異性催化的技術(shù)。酶經(jīng)過(guò)固定化后,可最大程度地保持酶的催化活性,克服了游離化酶存在的不足,在提高酶催化效率的同時(shí)又顯示出許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),如易分離回收,可連續(xù)、重復(fù)使用,穩(wěn)定性高等[1]。固定化酶反應(yīng)器的微型化可以更有效地縮短分析時(shí)間,減少酶和試劑消耗,降低分析成本[2]。

酶的固定化可提高生物活性及穩(wěn)定性,是酶抑制劑類(lèi)藥物篩選結(jié)果可靠的前提。目前,酶抑制劑類(lèi)藥物被廣泛使用,對(duì)該類(lèi)藥物的篩選及研究表征也日益成熟[3-6]。臨床用于治療阿爾茲海默癥(AD)的藥物主要為膽堿酯酶抑制劑[7],如加蘭他敏、他克林、多奈哌齊和卡巴拉汀等,使用二維液相色譜與質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)合毛細(xì)管固定化酶反應(yīng)器反相分離技術(shù),不需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理[8]。

微流控芯片技術(shù)是通過(guò)生物學(xué)、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、電子、材料、機(jī)械等多學(xué)科交叉,將分子生物學(xué)、化學(xué)分析、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域所涉及的樣品前處理、分離及檢測(cè)等過(guò)程集成到幾平方厘米的芯片上,從而實(shí)現(xiàn)從樣品前處理到后續(xù)分析的微型化、自動(dòng)化、集成化和便攜化的技術(shù),具有樣品消耗少、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便、多功能集成、體積小和便于攜帶等優(yōu)點(diǎn),在藥物研發(fā)[9]、病毒檢測(cè)[10]、醫(yī)學(xué)診斷[11]、生物分析[12-13]、藥物篩選及檢測(cè)[14-15]、癌癥腫瘤的治療[16-18]等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。作者對(duì)常見(jiàn)酶固定化方法尤其是微流控芯片體系中酶的固定化方法進(jìn)行綜述,為酶抑制劑類(lèi)藥物篩選提供參考。

1 酶的常見(jiàn)固定化方法

1.1 包埋法

包埋法是通過(guò)物理作用,將酶固定在各種多孔載體(如高分子凝膠、金屬有機(jī)骨架材料、聚合物膜等)中從而實(shí)現(xiàn)酶固定化的方法[2]。由于包埋過(guò)程不改變酶的結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象,也不發(fā)生化學(xué)反應(yīng),能較好地保持酶的活性,且操作工藝簡(jiǎn)單,被廣泛采用[19-24]。目前,常用的包埋法根據(jù)包埋介質(zhì)的不同可以分為凝膠包埋法[25-26]和微囊包埋法[27-28]。凝膠包埋法是指將酶包裹在凝膠形成的網(wǎng)格中,該方法操作簡(jiǎn)單,反應(yīng)條件溫和、機(jī)械穩(wěn)定性較高。微囊包埋法是通過(guò)物理或化學(xué)方法將酶包裹在膜裝置(如中空纖維或微膠囊)中的一種固定化方法,可以同時(shí)固定多種酶。該法一般操作簡(jiǎn)單,可以更好地維持漆酶的自身結(jié)構(gòu)并保持長(zhǎng)期穩(wěn)定,是一種經(jīng)濟(jì)有效的方法。Dawesa等[20]通過(guò)光引發(fā)聚乙二醇二丙烯酸酯共聚而成的水凝膠對(duì)葡萄糖氧化酶進(jìn)行包埋,在體外癌細(xì)胞培育過(guò)程中誘導(dǎo)產(chǎn)生低氧環(huán)境,保證了酶的活性。

1.2 物理吸附法

物理吸附法是酶通過(guò)分子間相互作用力(如氫鍵、疏水作用、范德華力、靜電引力等)將酶吸附并固定在載體表面的一種酶固定化方法。Ji等[29]利用物理吸附法將漆酶固定到碳納米管改性的聚偏氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜上。與化學(xué)交聯(lián)法相比,物理吸附法制備的生物催化膜具有可重復(fù)裝載的優(yōu)點(diǎn),經(jīng)過(guò)4次漆酶重復(fù)裝載后,生物催化膜的活力約維持在首次固定化酶活性的70%。物理吸附法作為一種較為成熟的酶固定化技術(shù),已成功用于商業(yè)化[30]。

1.3 化學(xué)交聯(lián)法

化學(xué)交聯(lián)法是利用雙功能或多功能試劑使酶分子之間相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化方法,通常是將酶先吸附或包埋在載體上/內(nèi),再利用化學(xué)交聯(lián)以增強(qiáng)酶與載體之間的物理纏繞或化學(xué)連接。常用的雙功能試劑有戊二醛(Glutaraldehyde,GA)、偶氮甲酰胺(Azodicarbonamide,ADA)、乙二胺(Ethylenediamine,EDA)、雙偶氮聯(lián)苯胺(Bisazobenzidine,BDB)等[31-33],其中GA是最常用的交聯(lián)劑。Hilal等[33]采用過(guò)濾的方式將脂肪酶吸附到微濾膜孔內(nèi),再利用GA將膜內(nèi)的酶進(jìn)行交聯(lián)固定化,所制備的生物催化膜載酶量高,且具有較高的穩(wěn)定性。為防止交聯(lián)過(guò)程中造成酶失活,導(dǎo)致回收率較低的缺陷,經(jīng)常會(huì)在固定化前向酶溶液中加入底物、底物類(lèi)似物、抑制劑,或向固定化系統(tǒng)中添加惰性蛋白,如牛血清蛋白、明膠等,作為酶的保護(hù)劑維持目標(biāo)酶活性中心的天然結(jié)構(gòu),保證酶活性不變。

1.4 共價(jià)鍵合法

共價(jià)鍵合法是將蛋白的非活性基團(tuán)(如氨基、羧基、巰基、羥基、酚羥基和咪唑基等)與固定化載體表面的官能團(tuán)以共價(jià)鍵形式結(jié)合而完成固定化的方法[34-36]。孔麗云等[36]發(fā)明了一種基于共價(jià)鍵合法固定捕獲抗體的紙基酶聯(lián)免疫吸附法,用于檢測(cè)人血液中類(lèi)過(guò)敏相關(guān)屏障組織中肥大細(xì)胞上表達(dá)的受體(MRGPRX2)含量,其定量結(jié)果準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性良好,適用于臨床檢測(cè)和血液流行病學(xué)調(diào)查。共價(jià)鍵固定化酶呈現(xiàn)良好的穩(wěn)定性及重復(fù)使用性,是目前研究較多的一類(lèi)酶固定方法。但該方法一般反應(yīng)條件較高,操作復(fù)雜,往往會(huì)引起酶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而影響酶的活性。

綜上所述,酶作為一種催化劑廣泛應(yīng)用于各行各業(yè),同時(shí)在生命活動(dòng)中發(fā)揮十分重要的作用。由于酶容易失活,對(duì)反應(yīng)環(huán)境要求高,難以廣泛的在工業(yè)及生物學(xué)研究中進(jìn)行運(yùn)用。同時(shí)生命體內(nèi)微量蛋白的含量低且不易提取,對(duì)微量蛋白進(jìn)行高效催化和檢測(cè)成為當(dāng)前急需解決的問(wèn)題,微流控芯片上酶的固定化為解決這一問(wèn)題提供了支撐。

2 微流控芯片上酶的固定化

自1990年瑞士的Manz和Widmer首次提出微型全分析系統(tǒng)以來(lái),微流控芯片因其集成小型化與自動(dòng)化程度高、高通量、檢測(cè)試劑消耗少、樣本量需求少、污染少等優(yōu)點(diǎn),在生物醫(yī)學(xué)研究、臨床診斷、藥物分析、食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)、法醫(yī)和軍事等領(lǐng)域顯示了良好的應(yīng)用前景。微流控芯片將全分析型的實(shí)驗(yàn)室微型化到芯片系統(tǒng),可完成樣品預(yù)處理、反應(yīng)、注射、分離和檢測(cè)等分析步驟[37-38]。微流控芯片體系中酶的固定化為酶抑制劑類(lèi)藥物的篩選提供了保障。微流控芯片中通常使用溶膠-凝膠包埋技術(shù)將酶固定在微流控芯片通道內(nèi)表面,其缺陷是由于酶的固定不是通過(guò)共價(jià)鍵,存在容易流失、影響酶解效果等問(wèn)題。

2.1 物理固定化方法

微流控芯片體系酶的物理固定化方法在保留傳統(tǒng)物理方法的同時(shí),充分利用了微流控體系自身的結(jié)構(gòu)特征[1,39-41]。Kim等[39]使用微陣列固定過(guò)氧化酶過(guò)程中,將流速控制在1～10 μL/min,利用微珠作為載體,將酶固定在該載體上,再將固定酶的微珠懸浮于一定比例的液體中,注入芯片微通道中,通過(guò)機(jī)械障礙過(guò)濾方法將微珠固定在芯片微通道的特定區(qū)域。如果使用磁性微珠,則可通過(guò)外加磁場(chǎng)將其固定到通道的目標(biāo)位置[40]。

2.2 化學(xué)固定化方法

利用芯片基底材料表面官能團(tuán)和酶的氨基酸殘基之間形成共價(jià)鍵可將酶固定在微通道表面。目前微流控芯片多用玻璃或聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS),其Si—OH基團(tuán)可與交聯(lián)劑或酶上的氨基酸殘基通過(guò)共價(jià)鍵進(jìn)行結(jié)合[41-46]。Liang等[43]在微流控紙芯片上制備了復(fù)合比色免疫裝置,首先用殼聚糖溶液對(duì)紙張表面進(jìn)行處理,采用原位還原法在微流控紙芯片檢測(cè)區(qū)固定花型磁性納米金顆粒(FLAuNPs-Pd/Fe3O4@C),再借助捕獲抗體(Ab1)和二抗(Ab2)分子中的氨基將其固定在納米金表面(納米粒子主要用以提高單位面積抗原加載量),最后通過(guò)位點(diǎn)選擇性對(duì)抗體進(jìn)行篩選,完成了癌胚抗原和α-甲胎蛋白的高靈敏度檢測(cè)。Wang等[44]用殼聚糖處理紙張表面,借助雙功能試劑將抗體以共價(jià)鍵修飾到微流控紙芯片(μPADs)檢測(cè)區(qū),實(shí)現(xiàn)了μPADs上的夾心化學(xué)發(fā)光免疫分析(CL-ELISA)實(shí)驗(yàn),對(duì)血清中癌胚抗原和α-甲胎蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。由文獻(xiàn)可知,和抗原抗體類(lèi)似,均需要對(duì)紙張表面進(jìn)行殼聚糖處理,引入大量氨基,再借助雙功能試劑實(shí)現(xiàn)酶的固定化,才能實(shí)現(xiàn)酶分子在紙張表面的共價(jià)鍵合。

通過(guò)抗生物素-生物素表面化學(xué)可將固定化過(guò)程集成到微流控芯片中[46-49],降低價(jià)格昂貴抗體等生物樣本消耗量(100 ng),提高固定速度(1 min)。該固定過(guò)程可以在微流控芯片上自動(dòng)執(zhí)行,操作簡(jiǎn)單易行。

通過(guò)分層組裝技術(shù),也可實(shí)現(xiàn)酶在微流控芯片中的固定。Liu等[49]基于一種新開(kāi)發(fā)的全液相微流控芯片,該芯片由納米表面活性劑(NPS)在兩相系統(tǒng)中的界面組裝而成。采用分層組裝策略在微通道表面生成多糖多層膜,以辣根過(guò)氧化物酶和葡萄糖氧化酶為模型,構(gòu)建了全液相微流控酶反應(yīng)器和級(jí)聯(lián)反應(yīng)器,證明了多糖多層膜在提高酶負(fù)荷和催化效率方面的關(guān)鍵作用。

Zhang等[50]通過(guò)酶與聚丙烯酸(Polyacrylic acid,PAA)結(jié)合并將其加入海藻酸鹽基微纖維中,可以顯著抑制酶的泄漏,實(shí)現(xiàn)酶的穩(wěn)定性鍵合,提高酶的回收率和熱穩(wěn)定性。此外,利用這些酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng),在優(yōu)化條件下制備了葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)負(fù)載的微纖維,用于c(葡萄糖)=0～2 mol/L的可視化檢測(cè)。由于可調(diào)性和多功能性,這種基于微流體的微纖維平臺(tái),用于級(jí)聯(lián)催化和多種臨床標(biāo)志物的診斷。

Gong等[51]首次在微通道反應(yīng)器中應(yīng)用流動(dòng)的懸浮固定化酶進(jìn)行生物催化。在微通道中流動(dòng)的功能化形式的石墨烯固定化柚皮苷酶在異槲皮苷生產(chǎn)中取得了優(yōu)異的結(jié)果,流動(dòng)性懸浮石墨烯片固定化酶具有高度持久的特異性和溫和的催化特性,使酶的重復(fù)利用成為可能。

化學(xué)交聯(lián)法也被應(yīng)用在微流控芯片體系酶的固定化中。Hickey等[52]使用2種酶交聯(lián)反應(yīng),將氨酰化酶成功固定在微流控通道中,用于生產(chǎn)穩(wěn)定的生物催化微反應(yīng)器,可在幾個(gè)月內(nèi)重復(fù)使用。

3 結(jié)束語(yǔ)

微流控芯片是一種集成、快速、高效、高通量、試劑用量小的技術(shù)平臺(tái),將極大地促進(jìn)生物分析及藥物評(píng)價(jià)篩選的研究。酶的固定化可提高其生物活性及穩(wěn)定性,是酶抑制劑類(lèi)藥物篩選結(jié)果可靠的前提。微流控芯片上酶的固定化通過(guò)化學(xué)鍵、次級(jí)鍵、物理吸附及生物學(xué)的方法,將酶固定在特定的載體上,同時(shí)保證酶的活性。相比于常見(jiàn)固定化方法,其具有微型化的特點(diǎn),大大減少了酶與反應(yīng)物的用量,具有固定化酶的優(yōu)勢(shì),使酶可以重復(fù)利用,同時(shí)又提高酶的穩(wěn)定性,操作簡(jiǎn)單且容易控制,易自動(dòng)化且低耗高效。對(duì)微流控紙芯片體系的制備及應(yīng)用進(jìn)行簡(jiǎn)單總結(jié),旨在對(duì)酶在紙張上的固定化進(jìn)行思考,進(jìn)一步擴(kuò)大微流控紙芯片在酶抑制劑類(lèi)藥物篩選中的應(yīng)用。