UPLC指紋圖譜結合化學模式識別評價不同產(chǎn)地五靈脂藥材質量△

嚴玉晶，李玲，麥貴敏，曹嵌，林嘉明，鄺敏，劉燎原

廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244

五靈脂為鼯鼠科動物復齒鼯鼠Trogopterus xanthipesMilne-Edwar的干燥糞便，始載于《開寶本草》：“出北地，此是寒號蟲糞也”[1]。趙佳琛等[2]通過對歷代本草文獻的考證，確定五靈脂的主流來源為復齒鼯鼠T.xanthipes的干燥糞便，以山西、河北兩省太行山一帶為五靈脂最主要的產(chǎn)區(qū)?！吨腥A人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）1977年版至1990 年版中記載五靈脂為鼯鼠科動物復齒鼯鼠T.xanthipesMilne-Edwar的干燥糞便，根據(jù)外形的不同常分為“靈脂塊”及“靈脂米”，靈脂米以體輕、色黑棕、斷面色黃綠者為佳[3-5]；《中國藥典》1995 年版至2020 年版正文中則不再收錄。五靈脂主要含有黃酮類、酚酸類、三萜類和核苷類化學成分[6-7]，為活血、散瘀、止痛的中藥，主治胸痛、脘腹疼痛、痛經(jīng)、經(jīng)閉、產(chǎn)后血瘀疼痛、跌仆損傷、蛇蟲咬傷等[8]，在消化性疾病、婦科疾病等方面廣泛應用[9]，因此五靈脂在各地方現(xiàn)行藥材標準中仍有收錄。

目前，五靈脂相關研究主要在臨床配伍、藥理藥效、理化鑒別、含量測定及炮制方面，對其指紋圖譜的研究較少。中藥成分復雜，僅針對少數(shù)幾個成分進行研究難以反映藥材質量全貌，同時，五靈脂藥材為復齒鼯鼠干燥糞便，其質量與復齒鼯鼠食料密切相關，食料不同，所得藥材化學成分及藥理作用均有一定差異。因此，本研究建立了五靈脂藥材超高效液相色譜法（UPLC）指紋圖譜，并結合化學模式識別評價不同產(chǎn)地藥材質量、篩選出不同產(chǎn)地藥材質量差異標志性成分，以期為五靈脂藥材質量研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

H-Class 型超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；Milli-Q Direct 型超純水系統(tǒng)（德國Merck 公司）；111B 型二兩裝高速中藥粉碎機（浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司）；XP26型百萬分之一天平、ME204E 型萬分之一天平均購于瑞士Mettler-Toledo公司；DLSB-5/20B 型低溫冷卻液循環(huán)泵（鄭州長城科工貿有限公司）；HWS-28 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技儀器有限公司）。

1.2 試藥

五靈脂藥材22 批（編號為W1～W22），經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定為鼯鼠科動物復齒鼯鼠Trogopterus xanthipesMilne-Edwar 的干燥糞便，藥材對應編號及產(chǎn)地見表1。

表1 22批五靈脂藥材來源信息

對照品原兒茶酸（批號：110809-201906，純度：97.7%）、槲皮苷（批號：111538-202007，純度：93.5%）、4-羥基苯甲酸（批號：101149-201903，純度：100.0%）、苯甲酸（批號：100419-201703，純度：99.9%）、穗花杉雙黃酮（批號：111902-201603，純度：97.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品扁柏雙黃酮（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：RFS-B0511808009，純度：97.00%）；乙腈、磷酸為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，6%～16%A；10～16 min，16%～20%A；16～24 min，20%～27%A；24～32 min，27%～39%A；32～38 min，39%～47%A；38～48 min，47%A；48～50 min，47%～90%A；50～52 min，90%A）；柱溫：30 ℃；檢測波長：265 nm；流速：0.25 mL·min-1；進樣量：1.0 μL。

2.2 對照品溶液的制備

取對照品原兒茶酸、4-羥基苯甲酸、苯甲酸、槲皮苷、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮適量，精密稱定，加甲醇溶解制成質量濃度分別為28.919、57.900、80.420、26.461、33.023、53.244 μg·mL-1的混合對照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取五靈脂粉末（過三號篩）約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%乙醇50 mL，稱定質量，加熱回流60 min，放冷，再稱定質量，用80%乙醇補足減失的質量，搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取五靈脂藥材粉末（編號：W13），精密稱定，按2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件連續(xù)測定6 次，以5 號峰苯甲酸為參照峰（S），計算得各共有峰相對保留時間RSD<0.12%、相對峰面積RSD<1.55%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取五靈脂藥材粉末（編號：W13），精密稱定，按2.3 項下方法平行制備6 份供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，以5號峰苯甲酸為參照峰（S），計算得各共有峰相對保留時間RSD<0.04%、相對峰面積RSD<1.29%，表明該方法重復性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取五靈脂藥材粉末（編號：W13），精密稱定，按2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，以5 號峰苯甲酸為參照峰（S），計算得各共有峰相對保留時間RSD<0.17%、相對峰面積RSD<2.67%，表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜的建立及分析

2.5.1 指紋圖譜的建立及共有峰指認 取22 批五靈脂藥材，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版）對22 批五靈脂藥材色譜圖進行處理，以W13 號樣品色譜圖為參照圖譜，時間窗寬度為0.1 min，選用平均數(shù)法生成對照指紋圖譜R。共標定14 個共有峰，通過對照品比對，指認出其中6 個峰，分別為原兒茶酸（1號峰）、4-羥基苯甲酸（2 號峰）、苯甲酸（5 號峰）、槲皮苷（7 號峰）、穗花杉雙黃酮（11 號峰）、扁柏雙黃酮（14號峰）。22批五靈脂藥材UPLC指紋圖譜疊加圖、對照指紋圖譜R 見圖1，混合對照品色譜圖、空白試劑色譜圖及共有峰指認見圖2。

圖1 22批五靈脂藥材UPLC指紋圖譜疊加圖及對照指紋圖譜R

圖2 22批五靈脂藥材UPLC指紋圖譜共有峰指認

2.5.2 相似度評價 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版）對22 批五靈脂藥材進行相似度評價，以對照指紋圖譜R 為參照，22 批五靈脂藥材相似度為0.870～0.998，相似度評價結果見表2。以5 號峰苯甲酸為參照峰（S），計算22 批五靈脂樣品共有峰相對保留時間RSD<1.43%、相對峰面積RSD 為20.31%～123.55%。說明不同產(chǎn)地五靈脂藥材各化學組成相似，但樣品間共有化學成分的質量分數(shù)存在一定差異。

表2 22批五靈脂藥材指紋圖譜相似度

2.6 化學模式識別分析

2.6.1 聚類熱圖分析 聚類熱圖可通過橫向與縱向聚類來反映樣本的批間差異及成分間的相關性，同時熱圖色塊顏色的深淺能直觀地反映成分含量的高低[10]。將22 批五靈脂藥材的14 個共有峰單位峰面積進行歸一化后，導入Hiplot 科研繪圖平臺[11]，選擇“ward” 聚類方法，行列距離度量為“euclidean”，生成聚類熱圖。結果如圖3 所示，22批不同產(chǎn)地五靈脂藥材可聚為兩大類，W1～W12 聚為一類，為陜西省商洛市的樣品，W13～W22 聚為一類，為陜西省西安市及山西、湖北、河北省的樣品。其中樣品W13～W22 具有較高相似性，無明顯的區(qū)域性差異，在該聚類中特征峰7（槲皮苷）、峰9、峰10、峰11（穗花杉雙黃酮）、峰13、峰14（扁柏雙黃酮）顏色偏暖，表明所含成分含量相對較高，該特征與樣品W1～W12 具有明顯區(qū)分；同時，熱圖顯示特征峰1（原兒茶酸）在不同產(chǎn)地中呈現(xiàn)出明顯的區(qū)域性特征，陜西省西安市、商洛市所產(chǎn)五靈脂中原兒茶酸含量較低，山西、湖北、河北省樣品中原兒茶酸含量較高。由結果可知，通過聚類熱圖分析，可將陜西省所產(chǎn)五靈脂藥材與其余產(chǎn)地進行區(qū)分。

圖3 22批五靈脂藥材UPLC指紋圖譜聚類熱圖

2.6.2 正交偏最小二乘法-判別分析（OPLSDA）OPLS-DA 是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計方法，近年來，在相關的中藥領域常作為生藥質量評價、中藥炮制前后成分差異研究、中藥藥理代謝組學及中藥潛在質量標志物探索的基礎方法之一[12]，通過OPLS-DA 進一步明確不同產(chǎn)地五靈脂藥材質量差異成分。將22 批五靈脂藥材指紋圖譜共有峰的單位峰面積導入SIMCA 14.1 軟件，進行OPLS-DA。模型三大指標數(shù)據(jù)矩陣解釋率參數(shù)自變量的可解釋率（R2X）為0.943、模型區(qū)分參數(shù)因變量的可解釋率（R2Y）為0.961、模型預測參數(shù)（Q2）為0.893，表明模型具有良好的解釋及預測能力[13]。OPLS-DA模型得分圖見圖4，顯示22 批五靈脂藥材共聚為兩類，陜西省商洛市各區(qū)縣鄉(xiāng)鎮(zhèn)所產(chǎn)五靈脂與其余產(chǎn)地樣品分別聚集在坐標軸左右兩側，表明樣品成分含量有明顯差異，與聚類熱圖分析結果一致。根據(jù)OPLS-DA模型得到14個化學成分的變量重要性投影（VIP）值見圖5，以VIP 值>1 為標準，得到不同產(chǎn)地五靈脂藥材的質量差異標志性成分，根據(jù)影響程度依次為色譜峰9、峰7（槲皮苷）、峰11（穗花杉雙黃酮）、峰10、峰1（原兒茶酸）、峰8、峰6，說明以上7 個成分是造成不同產(chǎn)地五靈脂藥材質量差異的主要成分。

圖4 22批五靈脂藥材OPLS-DA得分

圖5 22批五靈脂藥材OPLS-DA VIP值（,n=22）

3 討論

3.1 指紋圖譜的建立

五靈脂主要化學成分包括黃酮類及酚酸類成分，分別取對照品溶液及供試品溶液進行全波長掃描（190～400 nm），結果顯示，原兒茶酸、4-羥基苯甲酸、苯甲酸等酚酸類成分在波長255～260 nm 具有最佳吸收，而槲皮苷、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮等黃酮類成分在波長255～268、348～337 nm 具有最佳吸收，綜合考慮最終選擇檢測波長為265 nm，基線平穩(wěn)且各色譜峰響應較高。同時，本研究分別對不同的提取方式（超聲、回流）、提取時間（15、30、60 min）、提取溶劑（50%乙醇、80%乙醇、乙醇、50%甲醇、80%甲醇、甲醇）、料液比（1∶25、1∶50）、柱溫（28、30、32 ℃）及流速（0.23、0.25、0.27 mL·min-1）等進行考察，最終確定上述最佳色譜條件，色譜峰較多、分離效果較好。建立的五靈脂藥材UPLC 指紋圖譜共標定14 個共有峰，指認出其中6個成分，分別為原兒茶酸、4-羥基苯甲酸、苯甲酸、槲皮苷、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮。該方法專屬性、重復性、穩(wěn)定性良好，可用于五靈脂藥材質量控制。

3.2 結果分析

通過五靈脂指紋圖譜相似度分析及計算各特征峰相對峰面積RSD，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地五靈脂藥材化學成分相似度較高，但相對峰面積RSD 具有較大差異，推測這可能是復齒鼯鼠的生長環(huán)境、喂養(yǎng)食料及五靈脂藥材的收集時期等多方面因素共同產(chǎn)生的影響。通過觀察各樣品特征峰峰面積，黃酮類成分（槲皮苷、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮）所占比例最高，酚酸類成分（苯甲酸、原兒茶酸、4-羥基苯甲酸）次之，兩類成分特征峰峰面積之和為總峰面積的68.09%～83.37%。有研究發(fā)現(xiàn)，雙黃酮類成分對人凝血酶有強烈的抑制作用[14]，以苯甲酸為母核的酚酸類物質可明顯抑制血小板凝聚[15]，這與五靈脂活血化瘀、通利血脈的功效具有相關性。同時，臨床上五靈脂還用于治療消化性潰瘍、盆腔炎、慢性萎縮性胃炎[16]及多種痛癥[17]，與黃酮類、酚酸類成分的抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等功效密切相關。

化學計量學作為一種新興的分析實驗方法，廣泛應用于中藥鑒別、定性表征、質量控制、組效關系等研究中，尤其在中藥的質量控制與評價研究中具有重要意義，通過無監(jiān)督的模式識別（聚類分析等）獲取樣本分類信息，再經(jīng)過有監(jiān)督的OPLS-DA等方法識別樣本間質量差異標志性成分[18]。聚類熱圖分析表明，22 批五靈脂藥材可聚為兩類，陜西省商洛市樣品可與其他產(chǎn)地進行區(qū)分；山西、湖北、河北樣品中原兒茶酸及黃酮類成分含量明顯高于陜西省樣品。通過有監(jiān)督的OPLS-DA 找出7 個質量差異標志性成分。

筆者查閱文獻發(fā)現(xiàn)，市場流通的五靈脂藥材多為人工飼養(yǎng)鼯鼠生產(chǎn)所得，食料以側柏葉為主，同時人為地摻雜其他樹葉[19]。黃酮類及雙黃酮類成分是側柏葉的特征性成分，也是有效成分，孟麗娟等[20]將楊梅苷、槲皮苷、穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮作為側柏葉的含量控制指標。由此可推測，五靈脂中黃酮類成分來自復齒鼯鼠的主要食料側柏葉，故該類成分特征峰面積占比最高。筆者研究發(fā)現(xiàn)，河北、山西、湖北省及陜西省西安市五靈脂樣品中，均檢測出楊梅苷、槲皮素成分，而陜西省商洛市所產(chǎn)五靈脂中2 個成分含量較低，甚至無法檢出。程明等[19]調查發(fā)現(xiàn)，陜西商洛鼯鼠基地人工飼養(yǎng)鼯鼠時除采用側柏葉外也人為摻雜其他樹葉及饅頭、奶粉等。劉玉太等[21]經(jīng)過多年研究總結，指出復齒鼯鼠在繁殖季節(jié)需喂養(yǎng)鮮牛奶、玉米面、饅頭及多維素和礦物質，以保證營養(yǎng)需求。由此推測復齒鼯鼠主食中側柏葉的占比是導致五靈脂中黃酮類成分含量變化的原因之一。此外，五靈脂在歷代本草中均被記載“采無時”，現(xiàn)代藥材標準及文獻也認為全年均可采收[2-5,8,21]。處于繁殖季節(jié)的復齒鼯鼠以玉米面、饅頭為食，其糞便是否與五靈脂具有相同化學成分、功效，有待進一步考察。五靈脂藥材雖未被收錄于《中國藥典》2020 年版正文部分，但其在成方制劑和單味藥制劑中仍有14 種中藥復方制劑[22]，復齒鼯鼠的規(guī)范喂養(yǎng)及五靈脂的固定采收是否更有利于保證五靈脂藥材質量和療效的穩(wěn)定，有待進一步研究。

綜上，本研究建立的五靈脂藥材UPLC 指紋圖譜及化學模式識別方法可較整體地反映不同產(chǎn)地五靈脂藥材的化學成分差異，并篩選出質量差異標志性成分，可為五靈脂藥材質量研究提供參考。