電針通過(guò)Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬途徑改善腦缺血再灌注損傷的機(jī)制研究

★ 陳阿貞 蘭嵐 謝小文 高麗麗（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院 福州 350003）

缺血性腦血管病嚴(yán)重危害人類的健康，有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高等特點(diǎn)［1-2］。在超早期通過(guò)溶栓治療等方式恢復(fù)缺血腦組織灌注已被證實(shí)是有效治療方法之一，但有研究提示，腦缺血再灌注是加重腦功能損傷的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)，因?yàn)樵俟嘧⑦^(guò)程中，缺血腦組織可能會(huì)因炎癥反應(yīng)或活性氧積累等而進(jìn)一步加重，使得缺血性腦卒中治療及預(yù)后不佳［3］。針灸作為傳統(tǒng)的治療方法，已廣泛應(yīng)用于腦血管疾病的治療，并在臨床康復(fù)中有良好的治療效果，但其作用機(jī)制尚未清楚。本課題前期研究表明，電針曲池、足三里可改善腦缺血再灌注損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)及認(rèn)知等功能障礙［4-6］，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。

近年來(lái)研究表明，腦缺血再灌注損傷可使線粒體自噬活化，線粒體自噬的激活能進(jìn)一步減輕腦缺血再灌注損傷，故線粒體自噬成為干預(yù)腦缺血再灌注損傷的重要潛在靶點(diǎn)［7］。已有大量研究表明，PINK1/Parkin 參與了腦缺血再灌注損傷的病理過(guò)程，且上調(diào)線粒體自噬水平具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用［8-9］。因此，Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬途徑顯得尤為重要。本課題組前期研究證明了電針在腦缺血再灌注損傷中的多靶點(diǎn)作用，基于線粒體自噬在腦缺血再灌注中的作用，本課題以大腦中動(dòng)脈缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠為模型，進(jìn)一步從Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬途徑揭示電針治療腦缺血再灌注損傷的機(jī)制，為臨床電針治療腦缺血性疾病提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

本次實(shí)驗(yàn)選用45 只SPF 級(jí)健康雄性SD 大鼠，體重為（250±50）g，動(dòng)物飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，恒溫恒濕，模擬12 h/12 h 晝夜循環(huán)光照系統(tǒng)，予以自由飲食及飲水。福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境許可證：SYXK（閩）2021-0007。用隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)選取15 只為假手術(shù)組，造模成功后的模型大鼠再隨機(jī)分為模型組及電針組，各15 只。

1.2 主要材料及儀器

PINK1、Parkin、β-actin 抗體均購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；TUNEL 試劑盒、增強(qiáng)型RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒、Tris-Glycine-SDS 電泳緩沖液等購(gòu)于博士德；華佗牌電針儀（型號(hào)SDZ-Ⅱ）購(gòu)于蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；超凈工作臺(tái)（Opticlean-1300）購(gòu)于力康生物醫(yī)療公司；病理切片機(jī)（型號(hào)RM2016）購(gòu)于上海徠卡儀器；Gel DOC 2000 凝膠成像系統(tǒng)、電熱恒溫水槽（型號(hào)DK-8AD）均購(gòu)于上海一恒；瓊脂糖水平電泳儀購(gòu)于北京六一生物科技有限公司；凝膠玻璃板、固定夾及轉(zhuǎn)移槽購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司；HE 成像儀（型號(hào)Nikon DS-U3）及超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)均購(gòu)于杭州米歐儀器有限公司 ；Image-Pro-Plus 圖像分析系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Media Cybernetics 公司。

1.3 MCAO 大鼠模型建立

參照Longa 等［10］改良線栓法規(guī)范化制備大鼠MCAO 模型。稱重，按0.35 mL/kg 腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，從頸正中縱行切開(kāi)皮膚以暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA），分離頸外動(dòng)脈（ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）顱外段，并在根部結(jié)扎ECA，動(dòng)脈夾夾閉ICA，在CCA 分叉下方約3 mm 處剪一“V”型小口，緩慢插入頭端圓鈍、直徑約0.25 mm 的尼龍線栓，線栓經(jīng)CCA 分叉處進(jìn)入ICA，當(dāng)有少許阻力時(shí)停止插入，松開(kāi)動(dòng)脈夾，此時(shí)線栓頭端距離分叉處約18 mm，表示線栓頭端已到達(dá)大腦中動(dòng)脈起始端，固定線栓，待缺血90 min 后，撤出線栓以恢復(fù)血流再灌注。實(shí)驗(yàn)過(guò)程及動(dòng)物蘇醒期間使用37 ℃恒溫臺(tái)進(jìn)行保溫。待大鼠完全清醒后，采用Zea Longa 法［10］進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，1～3 分者為造模成功，所有造模成功的模型大鼠再按隨機(jī)數(shù)字法分為模型組及電針組2 組；假手術(shù)組大鼠麻醉后只暴露、分離血管后縫合皮膚。動(dòng)物處理方法經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審定，按照中華人民共和國(guó)科技部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》執(zhí)行。

1.4 干預(yù)措施

（1）電針組：電針組于MCAO 術(shù)后24 h 開(kāi)始電針治療，干預(yù)方法參照中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸委員會(huì)制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜，選取大鼠右側(cè)曲池、足三里穴（大鼠穴位定位參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［11］中的定位方法）為電針穴位，選用30 號(hào)0.5 寸華佗牌不銹鋼毫針刺入，應(yīng)用SDZ-Ⅱ電針儀，電流強(qiáng)度為1 mA，波型選擇1/20 Hz 頻率的疏密波，電壓峰值為6 V，以針體輕輕抖動(dòng)為判斷電針得氣標(biāo)準(zhǔn)，20 min/次，每天同一時(shí)間治療1 次，連續(xù)7 d。治療結(jié)束后放回籠中正常飼養(yǎng)，至7 d 后處死動(dòng)物取材。（2）模型組：造模結(jié)束后回籠飼養(yǎng)，不予任何治療。（3）假手術(shù)組：手術(shù)后回籠飼養(yǎng)，不予任何治療。

1.5 行為學(xué)評(píng)定

各組大鼠在腦缺血再灌注后2 h 及電針治療第7 天，由1 名對(duì)研究不知情的觀察者按Zea Longa評(píng)分［10］評(píng)估神經(jīng)功能改善情況，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0 分，正常，無(wú)神經(jīng)缺損；1 分，對(duì)側(cè)前爪不能完全伸展；2 分，活動(dòng)時(shí)向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3 分，行走不穩(wěn)，不自主向?qū)?cè)傾倒；4 分，完全不能行走，甚至意識(shí)喪失。

1.6 取材和指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 取材 干預(yù)7 d 后取材，各組大鼠在10%水合氯醛3.5 mL/kg 腹腔注射麻醉下行開(kāi)顱，取出的大腦組織迅速保存在-80 ℃冰箱中，或固定后制成石蠟標(biāo)本備用。

1.6.2 HE 染色 取各組大鼠缺血區(qū)域腦組織置于4%多聚甲醛內(nèi)，4 ℃固定24 h。常規(guī)脫水，石蠟包埋，冠狀切片，片厚5 μm。常規(guī)梯度脫蠟入水，脫蠟后蘇木精-伊紅（HE）染色并用中性樹(shù)脂封片，于顯微鏡下觀察各組形態(tài)病理學(xué)改變。

1.6.3 Western blot 法檢測(cè)PINK1、Parkin 提取各組50 μg 左側(cè)大腦皮質(zhì)區(qū)腦組織，加入RIPA 裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1），充分研磨裂解。勻漿后于冰上靜置30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min 后分離上清液，提取全蛋白提取物。用BCA 法檢測(cè)所提取的蛋白濃度。用SDS-PAGE 凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色標(biāo)記蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，轉(zhuǎn)膜，用封閉液封閉2 h，加入相應(yīng)的一抗PINK1（1∶1 000 稀釋）、Parkin（1∶2 000 稀釋），4 ℃孵育過(guò)夜；次日洗滌，加入HRP（辣根過(guò)氧化物）標(biāo)記的二抗（1∶5 000稀釋），振蕩孵育2 h，TBST 洗滌，將膜置于透明塑料板上，將膜蛋白面朝下與混合好的化學(xué)熒光發(fā)光底物充分接觸，去盡殘液，采用凝膠成像系統(tǒng)顯影成像與分析，內(nèi)參蛋白為GAPDH，目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量為目的蛋白與內(nèi)參蛋白的比值。

1.6.4 TUNEL 檢測(cè)細(xì)胞凋亡數(shù) 按TUNEL 試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書上操作處理：將腦組織石蠟標(biāo)本切成約3 μm 厚的切片組織，于玻片上固定。于60 ℃烘箱中烤片后進(jìn)行二甲苯脫蠟及乙醇溶液梯度水化。封片觀察，在顯微鏡下觀察并采集圖像，計(jì)算TUNE 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。

1.7 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所收集的數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊用Dunnett's T3 檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

假手術(shù)組大鼠無(wú)神經(jīng)功能缺損，均為0 分；造模后，與假手術(shù)組相比，模型組與電針組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分均明顯升高（P＜0.05），但模型組與電針組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；經(jīng)電針干預(yù)治療，電針組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分較模型組顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較（±s，n=15）分

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較（±s，n=15）分

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

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2.2 各組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)變化比較

假手術(shù)組神經(jīng)元排列整齊，分布均勻，神經(jīng)元胞體較大，未見(jiàn)明顯空泡，核呈圓形，核仁清晰可見(jiàn)；模型組神經(jīng)元皺縮，分布凌亂，胞質(zhì)變形縮小，結(jié)構(gòu)不清，核固縮，呈三角形，細(xì)胞周圍間隙增寬，可能是炎性細(xì)胞；電針組神經(jīng)細(xì)胞核皺縮或碎裂有所減少，細(xì)胞浸潤(rùn)減少，一定程度上減輕缺血再灌注所致的病理?yè)p傷。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)HE染色結(jié)果（20×）

2.3 各組大鼠腦缺血皮質(zhì)區(qū)PINK1、Parkin 蛋白表達(dá)比較

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦缺血皮質(zhì)區(qū)線粒體自噬蛋白PINK1、Parkin 表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，電針組大鼠皮質(zhì)組織PINK1、Parkin水平進(jìn)一步升高（P＜0.01），表明電針可上調(diào)PINK1、Parkin 表達(dá)，激活線粒體自噬。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠腦缺血皮質(zhì)區(qū)PINK1、Parkin蛋白表達(dá)比較

2.4 各組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡率的比較

與假手術(shù)組相比，模型組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01），而電針組的細(xì)胞凋亡率較模型組明顯下降（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 各組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡率的比較

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，中風(fēng)病的基本病機(jī)總屬陰陽(yáng)失調(diào)，氣血逆亂，主要病位在腦，臨床上常表現(xiàn)為半身不遂、偏身麻木等。根據(jù)《素問(wèn)·痿論》“治痿獨(dú)取陽(yáng)明”理論，曲池和足三里均是陽(yáng)明經(jīng)上的合穴，對(duì)治療缺血性中風(fēng)具有良好的臨床療效，這已在大量臨床研究中得到證實(shí)［12］。腦缺血再灌注損傷大鼠模型（MCAO 模型）產(chǎn)生的神經(jīng)功能缺損癥狀與腦缺血患者的臨床癥狀相似，常伴有肢體的運(yùn)動(dòng)及感覺(jué)障礙等。本研究結(jié)果顯示，電針可以改善神經(jīng)功能缺失癥狀，減少腦缺血再灌注損傷大鼠的炎性反應(yīng)，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及病理學(xué)結(jié)果很好地證實(shí)了這一點(diǎn)，這與既往報(bào)道相符［13-14］，表明電針具有治療腦缺血再灌注損傷的作用。

腦缺血再灌注損傷會(huì)產(chǎn)生鈣離子超載、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、自由基氧化損傷等在內(nèi)的一系列復(fù)雜反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［15］。線粒體作為細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵細(xì)胞器，在細(xì)胞能量產(chǎn)生、氧化磷酸化、細(xì)胞死亡等過(guò)程中起重要的作用，其作為細(xì)胞能量代謝的中心，為大腦提供重要的能量。大量研究表明線粒體受損會(huì)加重缺血性腦損傷神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡［16］。因此，及時(shí)對(duì)受損的線粒體進(jìn)行清除可以有效減輕腦缺血再灌注損傷。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，線粒體自噬是機(jī)體通過(guò)特異性自噬將受損線粒體消除的重要方式之一［17-18］。而在腦缺血灌注過(guò)程中線粒體自噬受多種蛋白的調(diào)節(jié)，其中，PINK1/Parkin 通路調(diào)控的線粒體自噬途徑最為典型［19］。Parkin 主要通過(guò)介導(dǎo)底物泛素化進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)蛋白降解等而誘發(fā)線粒體的自噬，PINK 是受損傷線粒體的分子感受器，可通過(guò)募集并活化Parkin 進(jìn)一步引發(fā)線粒體自噬，是線粒體受損時(shí)的第一道防線。已有研究揭示，在腦缺血再灌注損傷中，當(dāng)線粒體自噬發(fā)生時(shí)，腦神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)PINK1 蛋白表達(dá)升高，Parkin 被活化，Parkin 敲除后，PINK1 也可通過(guò)泛素蛋白磷酸化誘導(dǎo)低水平線粒體自噬，這表明Parkin 的存在會(huì)增加PINK1誘導(dǎo)的信號(hào)通路，增強(qiáng)線粒體自噬過(guò)程［20］。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，造模成功后大鼠腦組織中的線粒體自噬蛋白PINK1、Parkin 的表達(dá)水平升高，說(shuō)明腦缺血再灌注損傷后存在自噬蛋白的活化，這與此前大量的研究報(bào)道一致［21-22］。而進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，電針干預(yù)后可進(jìn)一步提高PINK1 及Parkin 蛋白水平，這表明在腦缺血再灌注損傷中，電針可能通過(guò)上調(diào)PINK1/Parkin 通路介導(dǎo)的線粒體自噬水平發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

最新研究表明，線粒體受損可以通過(guò)促進(jìn)腦缺血再灌注損傷的炎癥聯(lián)級(jí)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡，從而加重腦損傷［23］。已有研究證實(shí)PINK1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬作為一種清除受損線粒體的途徑，在腦缺血再灌注中起重要作用［24］。通過(guò)激活線粒體自噬可以減輕腦缺血神經(jīng)元損傷，進(jìn)而減少線粒體依賴的細(xì)胞凋亡，這已經(jīng)在體內(nèi)模型和培養(yǎng)的神經(jīng)元中得到證實(shí)［25］。故本課題組進(jìn)一步應(yīng)用TUNEL 染色法檢測(cè)電針對(duì)腦缺血再灌注區(qū)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明MCAO 組大鼠腦缺血區(qū)存在大量細(xì)胞凋亡，電針干預(yù)后細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少，神經(jīng)功能缺損癥狀明顯改善，與相關(guān)研究一致。這也表明電針通過(guò)介導(dǎo)線粒體自噬途徑減輕腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，電針MCAO 大鼠曲池、足三里可能通過(guò)激活Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬途徑減少細(xì)胞凋亡，減輕腦缺血再灌注神經(jīng)損傷，從而起到腦保護(hù)的作用。但調(diào)控線粒體自噬的信號(hào)通路多樣，電針能否通過(guò)其他途徑調(diào)控線粒體自噬產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用，其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。