基于數(shù)據(jù)挖掘的重癥肌無力動(dòng)物模型應(yīng)用分析

★ 徐添 官磊瑤 劉浪輝 王瑞奇 吳國艷 黃梅 黃春華（.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004；.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006）

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG） 是一種主要由乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AChR）抗體介導(dǎo)，補(bǔ)體及多種因素參與的自身免疫性疾病［1］，病變主要累及神經(jīng)肌肉接頭突觸后膜上的乙酰膽堿受體［2］。其全球患病率及病死率逐年升高，死亡原因包括呼吸衰竭和肺部感染，嚴(yán)重危害患者生命健康和生活質(zhì)量［3］。目前MG 的治療以膽堿酯酶抑制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、靜脈注射免疫球蛋白、血漿置換以及胸腺切除為主［4-6］，這些方法雖然能緩解MG 癥狀，但長期使用可引起一系列不良反應(yīng)［7］。因此，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)越來越關(guān)注與MG有關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型是開展實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。本研究基于數(shù)據(jù)挖掘，通過檢索MG 相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn)，對(duì)現(xiàn)有的造模要素進(jìn)行歸納分析，以期為MG 實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

以重癥肌無力和動(dòng)物模型為主題，檢索CNKI、萬方、維普、Sinomed、Pubmed 數(shù)據(jù)庫，中文數(shù)據(jù)庫檢索時(shí)間為2001 年至今（共檢索出相關(guān)文獻(xiàn)490 篇）、外文數(shù)據(jù)庫檢索時(shí)間為2011 年—2021 年（共檢索出相關(guān)文獻(xiàn)243 篇）。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

選擇MG 模型期刊文獻(xiàn)，排除綜述類、碩博論文、會(huì)議類及MG 體外實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)等，共有137 篇文獻(xiàn)符合標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇、造模方法、陽性藥、檢測(cè)指標(biāo)等按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)》［8］進(jìn)行規(guī)范，并錄入Excel 2019，采用頻數(shù)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)歸納。

2 結(jié)果

2.1 MG 模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇

將納入的137 篇文獻(xiàn)中所涉及的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類、性別、年齡及體重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（部分文獻(xiàn)未標(biāo)注），MG 模型實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物：Lewis 大鼠，雌性，6～8 周齡，體重140～180 g；C57BL/6 小鼠，雌性，6～8 周齡，體重14～16 g；SD 大鼠，雄性，8～10 周齡，體重200～250 g。見表1。

表1 MG動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)常用動(dòng)物統(tǒng)計(jì)

2.2 MG 模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類分布情況

將納入的137 篇文獻(xiàn)中的全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類進(jìn)行分類排序，共有13 類動(dòng)物，累積頻次137 次，其中2 篇文獻(xiàn)中的動(dòng)物未標(biāo)種類，故在此不做統(tǒng)計(jì)。從分析結(jié)果可以看出MG 模型所用動(dòng)物種類中，使用最多的為Lewis 大鼠（67 次，48.91%），其次為C57BL/6 小鼠（51 次，37.23%），SD 大鼠（5 次，3.65%），其他種類動(dòng)物14 次。見圖1。

圖1 MG模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類分布

2.3 MG 模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物性別分布情況

將納入的137 篇文獻(xiàn)中所涉及的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物性別進(jìn)行分類，共139 次，13 次未對(duì)動(dòng)物性別做出標(biāo)注，剩下的126 次中，雌性（107 次，84.92%），雄性（16 次，12.70%），雌雄各半（3 次，2.38%）。見圖2。

圖2 MG模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物性別分布

2.4 MG 模型造模方法

在重癥肌無力研究中，常用的動(dòng)物模型主要有5 種［9-10］：（1）AChR 誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力（EAMG）模型，主要是電鰩AChR 誘導(dǎo)的EAMG 模型［11］和人工合成肽段誘導(dǎo)的EAMG模型［12］。（2）利用雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗體建立被動(dòng)轉(zhuǎn)移模型；被動(dòng)轉(zhuǎn)移MG 患者或慢性EAMG 動(dòng)物血清中的AChR-Ab；通過向?qū)嶒?yàn)動(dòng)物腦室中注入MG 患者AChR-Ab 建立被動(dòng)轉(zhuǎn)移模型；被動(dòng)轉(zhuǎn)移AChRa 亞基單克隆抗體。（3）通過MG患者胸腺組織移植建立被動(dòng)轉(zhuǎn)移模型。（4）MuSK誘導(dǎo)的MG 模型［13］。（5）LRP4 誘導(dǎo)的MG 模型［14］。通過分析納入的137 篇文獻(xiàn)，其中電鰩AChR 誘導(dǎo)的EAMG 模型使用頻次最高（57 次，41.61%），其次為人工合成肽段誘導(dǎo)EAMG 模型（41 次，29.93%）。見表2。

表2 MG動(dòng)物模型分類

2.5 MG 模型陽性藥

統(tǒng)計(jì)顯示，MG 實(shí)驗(yàn)研究中陽性藥的選擇主要為強(qiáng)的松［15-16］，其次為溴吡斯的明［17-18］。

2.6 MG 造模成功標(biāo)準(zhǔn)

MG 造模成功標(biāo)準(zhǔn)主要通過以下幾個(gè)方面進(jìn)行評(píng)估：（1）臨床表現(xiàn)變化，動(dòng)物體重及肌力，精神狀態(tài)、毛色、步態(tài)、日?；顒?dòng)、咀嚼攝食情況、呼吸頻率等［19］；（2）行為學(xué)指標(biāo)，游泳試驗(yàn)、抓握試驗(yàn)、懸吊試驗(yàn)等；（3）新斯的明試驗(yàn)；（4）AChR 抗體濃度及滴度檢測(cè)；（5）電生理改變，低頻重復(fù)電刺激的衰減率（RNS）、肌電圖等；（6）病理形態(tài)學(xué)觀察，骨骼肌神經(jīng)肌肉接頭處病理改變。

2.7 MG 模型相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)

將納入的137 篇文獻(xiàn)中的全部檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行分類排序，共涵蓋16 種不同的指標(biāo)類型，累積頻數(shù)374 次。其中檢測(cè)較多的指標(biāo)為ELISA 法檢測(cè)血清中的生化指標(biāo)（94 次，25.13%），流式細(xì)胞儀分析脾臟和淋巴結(jié)、外周血、骨髓等組織細(xì)胞（57 次，15.24%），RT-PCR 檢測(cè)相關(guān)基因包括脾臟和淋巴結(jié)、肌肉、胸腺等組織淋巴細(xì)胞總RNA及mRNA 的表達(dá)等（43 次，11.50%），Western Blotting 法檢測(cè)相關(guān)蛋白包括脾臟和淋巴結(jié)、肌肉、胸腺等組織蛋白檢測(cè)（26 次，6.95%），免疫熒光技術(shù)包括NMJ 處電生理、形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)（26 次，6.95%）等。見表3。

表3 檢測(cè)指標(biāo)分類

94 篇ELISA 法檢測(cè)血清中的生化指標(biāo)累積頻數(shù)132 次，其中較多的血清生化指標(biāo)為AChR抗體水平（58 次，43.94%），細(xì)胞因子水平包括TGF-β、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10 和IL-17 等（24 次，18.18%），AChR IgG 抗體亞類包括IgG1、IgG2a、IgG2b 和IgG3 抗體（22 次，16.67%）等。見表4。

表4 ELISA 法檢測(cè)血清中的生化指標(biāo)分類

3 討論

MG 主要表現(xiàn)為波動(dòng)性無力和易疲勞性，晨輕暮重，活動(dòng)后加重，休息后可減輕。全身骨骼肌均可受累，眼外肌最易受累，表現(xiàn)為對(duì)稱或非對(duì)稱性上瞼下垂和復(fù)視，是MG 最常見的首發(fā)癥狀，見于80%以上的MG 患者［4,20］，其他還可導(dǎo)致面肌、咀嚼肌、頸肌，呼吸機(jī)等受累。發(fā)病早期可單獨(dú)出現(xiàn)眼外肌、喉肌或肢體肌肉無力的癥狀，逐漸累及其他肌群，直到全身肌無力。部分患者短期內(nèi)病情迅速進(jìn)展，發(fā)生肌無力危象，危及生命［21］。MG 當(dāng)屬中醫(yī)學(xué)“痿證”“痿躄”“瞼廢”“虛損”等范疇，《素問·痿論》曰：“五臟使人痿，何也？岐伯對(duì)曰：肺主身之皮毛，心主身之血脈，肝主身之筋膜，脾主身之肌肉，腎主身之骨髓，故肺熱葉焦，則皮毛虛弱急薄，著發(fā)為痿躄也?！敝赋霰静〉闹饕C(jī)是肺熱葉焦，將痿證分為皮、脈、筋、骨、肉五痿，并提出“治痿獨(dú)取陽明”的基本原則［21］，其治療核心為補(bǔ)脾益氣［16,23］。

目前治療該病尚無特效藥物，現(xiàn)有藥物的長期使用常伴隨一系列不良反應(yīng)。隨著MG 的發(fā)病率和死亡率逐年升高，人們對(duì)其關(guān)注也與日俱增，尋找一種更為安全有效的治療藥物或方案尤為重要。本文通過分析MG 相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，MG 模型常用動(dòng)物為大鼠和小鼠，研究表明鼠的行為改變與人發(fā)病的表現(xiàn)最為相似，且已有相對(duì)成熟的技術(shù)對(duì)鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)基因和基因敲除等處理，同時(shí)鼠較其他大型動(dòng)物所需的免疫劑量更少，在造價(jià)、繁殖、操作等方面更具優(yōu)勢(shì)。MG 實(shí)驗(yàn)研究常選用Lewis 大鼠和C57BL/6 小鼠，Lewis 大鼠與人MG 表現(xiàn)最相像，且進(jìn)展快、癥狀嚴(yán)重［9,25］；C57BL/6 小鼠對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力的易感性較高，發(fā)病率在50%～70%［26-27］，其中大鼠較小鼠更易出現(xiàn)額外的急性反應(yīng)期及更嚴(yán)重的肌無力癥狀。統(tǒng)計(jì)顯示，在動(dòng)物性別的選擇上雌性較雄性更易誘發(fā)MG，EAMG 血清誘導(dǎo)可使雌鼠AChR 降低40%～50%，而雄鼠則無AChR 數(shù)量改變［9］。另外，在動(dòng)物年齡和體重的選擇上，6～8 周齡、體重140～180 g 的雌性Lewis 大鼠和6～8 周齡、體重14～16 g 的雌性C57BL/6 小鼠為較常用的MG 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，體重決定自身抗體有效的胞外濃度，這是突觸傳遞過程中的決定因素之一［28］。

本文統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)使用最多的造模方法為AChR 誘導(dǎo)的EAMG 模型。AChR 誘導(dǎo)的EAMG 模型與人的發(fā)病進(jìn)程相似，具有較高的可行性［9］。其不僅可以探索MG 的發(fā)病機(jī)制，也可以用于檢測(cè)其他抗原的致病性，還可以用于評(píng)估降低自身抗體致病效應(yīng)藥物的治療潛力［29］。但因該模型需要2～3 次增強(qiáng)免疫，對(duì)小鼠確定合適的時(shí)間窗預(yù)防和治療MG 造成一定困難。其主要的造模方法包括電鰩AChR 和人工合成肽段誘導(dǎo)EAMG 模型［30-31］，電鰩AChR誘導(dǎo)EAMG 模型雖然可產(chǎn)生明顯的肌無力癥狀，但AChR 提取困難且純化過程涉及安全問題［32］。因此，近年來多選擇人工合成肽段誘導(dǎo)EAMG 模型，與前者相比，其病程進(jìn)展緩慢，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，更加有利于MG 發(fā)病機(jī)制和治療藥物的研究［33］。AChR-Ab 誘導(dǎo)的PTMG 模型直接將AChR-Ab 注入動(dòng)物體內(nèi)，其在抗體注射的48 h 內(nèi)即可出現(xiàn)典型的肌無力癥狀［34］。但該方法不能檢測(cè)靶向淋巴細(xì)胞及細(xì)胞因子表達(dá)或抗原識(shí)別的治療劑量，也不會(huì)誘發(fā)慢性自身免疫性疾病［35］。其包括通過利用雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗體建立PTMG 模型［29］，建模時(shí)間短，發(fā)病率高而易于評(píng)估，且避免了異質(zhì)性，適合進(jìn)行短期研究。被動(dòng)轉(zhuǎn)移MG 患者或慢性EAMG 鼠血清中的AChR-Ab，血清中存在各種免疫蛋白及炎癥介質(zhì)，干擾較大，不能保證單因素影響［36］。向?qū)嶒?yàn)動(dòng)物腦室中注入MG 患者AChR-Ab建立被PTMG 模型，該方法步驟較復(fù)雜，對(duì)無菌條件及實(shí)驗(yàn)者的操作水平要求高，在實(shí)際操作中存在一定困難［37］。被動(dòng)轉(zhuǎn)移AChRa 亞基單克隆抗體，成模率較高，速度快，但臨床癥狀消失快，不符合人類的患病特點(diǎn)［38］。其他還有MuSK 誘導(dǎo)的MG模型和LRP4 誘導(dǎo)的MG 模型等。

137 篇MG 實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn)中檢測(cè)指標(biāo)多為ELISA 法檢測(cè)血清中的生化指標(biāo)，流式細(xì)胞儀分析脾臟和淋巴結(jié)、外周血、骨髓等組織細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因包括脾臟和淋巴結(jié)、肌肉、胸腺等組織淋巴細(xì)胞總RNA 及mRNA 的表達(dá)等，Western Blotting 法檢測(cè)相關(guān)蛋白包括脾臟和淋巴結(jié)、肌肉、胸腺等組織蛋白檢測(cè)，免疫熒光技術(shù)包括NMJ 處電生理、形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)等。

MG 是一種罕見的自身免疫性疾病，其作用機(jī)制尚不明確，病理變化復(fù)雜多樣。目前還沒有能夠完全替代涉及多組織和系統(tǒng)的復(fù)雜病理的動(dòng)物模型［26］。在構(gòu)建MG 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜁r(shí)常選擇6～8 周齡、體重140～180 g 的雌性Lewis 大鼠和6～8 周齡、體重14～16 g 的雌性C57BL/6 小鼠，采用電鰩AChR或人工合成肽段誘導(dǎo)的EAMG 模型。EAMG 模型不僅可以探索MG 的發(fā)病機(jī)制，也可以用于檢測(cè)其他抗原的致病性，而且還可以用于評(píng)估降低自身抗體致病效應(yīng)藥物的治療潛力。因此，EAMG 模型是研究發(fā)病機(jī)制和探索新療法的重要工具。然而，與人類疾病相比，EAMG 模型的發(fā)病機(jī)制更加簡單，因?yàn)樗窃谑芸貤l件下繁殖的同基因動(dòng)物身上進(jìn)行的，特別是在遺傳易感性和環(huán)境因素方面。